Submitted by MIRIAN MARCOLAN DE MELLO null (marcolanmirian@yahoo.com.br) on 2016-02-16T08:13:42Z No. of bitstreams: 1 TESE Doutorado Mirian14_02_2016REPOSITÓRIO.pdf: 1649527 bytes, checksum: c26e5ed45e88f8a3889873caa917015a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-02-17T13:45:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mello_mm_dr_sjc.pdf: 1649527 bytes, checksum: c26e5ed45e88f8a3889873caa917015a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-17T13:45:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mello_mm_dr_sjc.pdf: 1649527 bytes, checksum: c26e5ed45e88f8a3889873caa917015a (MD5) Previous issue date: 2015-12-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Devido ao rápido aumento dos micro-organismos resistentes aos antibióticos e ao desenvolvimento limitado de novos agentes antimicrobianos, as infecções por bactérias Gram-negativas estão se tornando um desafio para os profissionais da saúde e uma ameaça para a saúde pública internacional. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito sinérgico dos antibióticos convencionais associados a terapia fotodinâmica antimicrobiana (PDT) no controle de Acinetobacter baumannii. Para realização desse trabalho, foram obtidos isolados clínicos de A. baumannii do Laboratório de Análises Clínicas Valeclin da cidade de São José dos Campos/SP, identificados pelo método de bioquimismo e submetidos ao teste de difusão em disco para verificar a sensibilidade antimicrobiana. Os isolados selecionados foram transferidos para o ICT/UNESP, onde foi realizado testes para determinação da Concentração Inibitória Mínima aos antibióticos Imipenem e Meropenem seguindo as normas da CLSI. Cepas sensíveis e resistentes aos antibióticos foram avaliadas quanto a sensibilidade in vitro à terapia fotodinâmica antimicrobiana. Além disso, foram testados os efeitos dos antibióticos convencionais, da PDT e da terapia combinada de antibióticos e PDT nas infecções experimentais induzidas em G. mellonella por isolados clínicos de A. baumannii resistentes aos antibióticos. Os resultados das terapias na infecção experimental foram avaliados por meio da curva de sobrevivência das lagartas de G. mellonella. Os dados dos testes in vitro foram submetidos à Análise de Variância e teste de Tukey. Os dados obtidos na curva de sobrevivência de G. mellonella foram analisados pelo método de Log-rank. Em todos os testes, foi considerado nível de significância de 5%. Nos resultados desse estudo, observou-se que o Laboratório Valeclin identificou 1,54% de amostras positivas para A. baumannii entre as 13.715 amostras clínicas analisadas em um período de 8 meses. Entre os isolados de A. baumannii, 58% demonstraram resistência aos antibióticos imipenem e meropenem por meio de teste de difusão em disco. A seguir 3 isolados clínicos sensíveis e 18 isolados resistentes a esses antibióticos foram selecionados para o presente estudo. O valor de CIM para os isolados sensíveis variou de ˂ 0,5 a 1µg/mL e para os isolados resistentes de 64 a >128µg/mL. A PDT in vitro reduziu o número de células de A. baumannii em todos os isolados testados, mas o percentual de redução foi dependente dos isolados analisados. Além disso, verificou-se nos testes in vivo, que o tratamento com PDT, antibióticos (Imipenem e Meropenem) e associação de PDT+Antibióticos resultaram na sobrevivência das lagartas de G. mellonella, porém sem efeito sinérgico. Conclui-se que a PDT teve ação antimicrobiana contra isolados clínicos de A. baumannii sensíveis e resistentes aos carbapenêmicos, mas não apresentou efeito sinérgico quando associada com antibióticos. / Due to the rapid growth of microorganisms resistant to antibiotics and the limited development of new antimicrobial agents, infections by Gram-negative bacteria are becoming a challenge for health professionals and a threat to international public health. The aim of this study was to evaluate the synergistic effect of conventional antibiotics associated with antimicrobial photodynamic therapy (PDT) in control of Acinetobacter baumannii. In order to conduct this project were obtained clinical isolates of A. baumannii at the Clinical Laboratory Valeclin situated in the city of São José dos Campos / SP, identified by bioquimismo method and submitted to disk diffusion test to verify the antimicrobial sensitivity. The selected isolates were transferred to the ICT / UNESP, which were conducted tests to determine the Minimum Inhibitory Concentration to Imipenem and Meropenem antibiotics following the rules of the CLSI. Sensitive and resistant strains to antibiotics were evaluated in vitro sensitivity to antimicrobial photodynamic therapy. Besides, the effects of conventional antibiotics, and combined PDT, and PDT of antibiotics in experimental infections induced in G. mellonella by clinical isolates of A. baumannii resistant to antibiotic therapy were tested. The results of therapies in experimental infection were evaluated by survival curve of worms G. mellonella. Data from in vitro tests were submitted to ANOVA and Tukey test. The data obtained in G. mellonella survival curve were analyzed by log-rank method. In all tests it was considered 5% significance level. The results of this study, it was observed that the Valeclin Laboratory identified 1.54% of positive samples for A. baumannii between the 13,715 clinical specimens analyzed in a period of 8 months. Among the isolates of A. baumannii, 58% were resistant to antibiotic imipenem and meropenem by disk diffusion test. Next, 3 isolates clinical sensitive and 18 isolates resistant to those antibiotics were selected for this study. The MIC value for sensitive isolates ranged from 0.5 to ˂ 1μg / mL and resistant isolates from 64 to> 128μg / mL. The PDT in vitro reduced the number of A. baumannii cells in all isolates tested, but the percentage of reduction was dependent on the analyzed isolates. Furthermore, it was found in in vivo tests, treatment with PDT, antibiotic (Imipenem and Meropenem) and PDT + Antibiotics association resulted in the survival of G. mellonella caterpillars, but no synergistic effect. It was concluded that PDT has antimicrobial activity against clinical isolates of A. baumannii sensitive and resistant to carbapenems, but it had no synergistic effect when combined with antibiotics.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis that affects humans and animals, and it is caused by dimorphic melanized fungi belonging to the genus Sporothrix. Sporotrichosis is mainly acquired by traumatic implantation of the fungus into the dermis through scratches inflicted by domestic animals or by handling plants. This study approaches: a) the in vitro susceptibility of Sporothrix schenckii complex species to photodynamic inactivation using methylene blue as a photosensitizer and laser as the light source; b) the combination of amphotericin B plus posaconazole in a murine model of systemic infection by S. brasiliensis and S. schenckii sensu stricto, seeking to enhance the treatment of disseminated sporotrichosis; c) the interference of fungal melanin in the in vitro susceptibility of S. brasiliensis and S. schenckii sensu stricto to amphotericin B and itraconazole. In the photodynamic therapy study we have applied methylene blue as a photosensitizing agent and Light emitting diode (InGaAlP) against Sporothrix schenckii complex species in an in vitro assay. The viability of the conidia was determined through the counting of colony forming units. The activity of amphotericin B and posaconazole alone or in combination was evaluated by using a microdilution checkerboard method. For the in vivo study, OF-1 mice were intravenously (i.v.) infected with a lethal inoculum of 2 x 107 CFU/animal. Two strains of S. brasiliensis and two of S. schenckii were tested. Animals received amphotericin i.v. at suboptimal dose i.e., 0.3 mg/kg, in combination with oral posaconazole at 2.5 mg/kg, 5 mg/kg or 10 mg/kg BID. Results were compared with their respective monotherapies and efficacy was evaluated by prolongation of survival and reduction of tissue burden in spleen and liver. In the study of the interference of melanin in the susceptibility of S. brasiliensis and S. schenckii sensu stricto, yeast cells were cultivated in minimal medium with or without L-DOPA in order to induce the production of melanin. Microdilution and time-kill methods were used to determine the antifungal activity against yeast cells with different amounts of melanin. The laser light (InGaAlP) together with a methylene blue photosensitizer were able to significantly reduce the growth of all the tested Sporothrix strains. In vitro data demonstrated a synergistic effect of the combination and although posaconazole alone was effective against sporotrichosis, efficacy was increased when combined with amphotericin B. The maximum efficacy of the combinations was obtained with posaconazole 5 mg/kg. The killing assay showed that melanization protected isolates within the Sporothrix schenckii complex from amphotericin B, particularly in the lower concentrations tested. The conclusions of the present study are: a) the in vitro inhibition of Sporothrix spp. isolates by laser light deserves in vivo experimental and clinical studies since it may be a promising treatment for cutaneous and subcutaneous sporotrichosis; b) posaconazole in combination with suboptimal doses of amphotericin B could be an option in the treatment of disseminated sporotrichosis especially when itraconazole or amphotericin B at optimal doses are contraindicated; c) combination studies of amphotericin B with inhibitors of melanin are required in order to avoid this effect. / A esporotricose é uma micose subcutânea que afeta homens e animais, e é causada por fungos dimórficos melanizados pertencentes ao gênero Sporothrix. Pode ser principalmente adquirida por implantação traumática do fungo na derme através da arranhadura de animais domésticos ou manipulação de plantas contaminadas. O presente estudo investigou: a) a suscetibilidade in vitro de espécies do Complexo Sporothrix schenckii à inativação fotodinâmica; b) a combinação de anfotericina B e posaconazol em modelo murino de infecção sistêmica por S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu, buscando melhorar o tratamento da esporotricosse disseminada; c) a interferência da melanina fúngica na suscetibilidade in vitro de S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu à anfotericina B e itraconazol. No estudo da terapia fotodinâmica foi aplicado azul de metileno como fotossensibilizador e emissão de luz diiodo (InGaAlP) frente espécies do complexo Sporothrix schenckii em ensaio in vitro. A viabilidade dos conídios foi determinada através de contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). A atividade da anfotericina B e posaconazol sozinhos ou combinados foi avaliada segundo a técnica de microdiluição em caldo e técnica de checkerboard. No estudo in vivo, camundongos OF-1 foram infectados com um inóculo de 2 x 107 UFC/animal. Foram utilizadas duas cepas de S. brasiliensis e duas cepas de S. schenckii. Os animais receberam doses de 0.3 mg/kg de anfotericina B em combinação com 2.5 mg/kg e 5 mg/kg de posaconazol. Os resultados foram comparados com as respectivas monoterapias e a eficácia foi avaliada através do prolongamento da sobrevivência e redução da carga fúngica no fígado e baço. No estudo da interferência da melanina na suscetibilidade de S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu à anfotericina B e itraconazol, células leveduriformes foram cultivadas em meio mínimo com e sem L-DOPA. Métodos de microdiluição e tempo de morte foram utilizados para determinar a atividade dos antifúngicos frente às células com diferentes quantidades de melanina. A luz laser (InGaAlP) em conjunto com o azul de metileno foram capazes de reduzir significativamente o crescimento de todas as cepas de Sporothrix testadas. Os dados in vitro demonstraram um efeito sinérgico da combinação de posaconazol e anfotericina B, e, apesar de o posaconazol 5 mg/kg sozinho apresentar eficácia contra a esporotricose, teve sua eficiência aumentada quando combinado com anfotericina B 0,3 mg/kg. A técnica de tempo de morte mostrou que a melanização protegeu os isolados do complexo Sporothrix schenckii da anfotericina B, particularmente na concentração mais baixa testada. Desta forma, as conclusões do presente estudo são: a) a inibição fotodinâmica in vitro de isolados de Sporothrix merece estudos experimentais e clínicos, uma vez que pode ser um tratamento promissor para a esporotricose cutânea e subcutânea; b) o posaconazol em combinação com dose baixa de anfotericina B pode ser uma opção para o tratamento de esporotricose disseminada, especialmente quando itraconazol e anfotericina B são contraindicados; c) estudos de combinação de anfotericina B com inibidores de melanina são necessários a fim de evitar o efeito protetor da melanina contra as defesas do organismo e contra antifúngicos.

[pt] Terapia fotodinâmica (PDT) é um tratamento médico baseado na excitação ótica de um fármaco chamado fotossensibilizador. Quando os fotossensibilizadores são expostos a luz em comprimento de onda específico, eles podem produzir espécies reativas, como oxigênio singlete, capazes de matar células próximas ao local irradiado, tais como células cancerígenas. Nanomateriais híbridos formados de nanopartículas metálicas e componentes poliméricos são investigados por seu potencial em aplicações biomédicas devido à sua habilidade de simultaneamente permitir detecção para diagnóstico e terapia (teranóstico). Graças à multifuncionalidade assegurada pelas propriedades plasmônicas das nanopartículas metálicas e atividade terapêutica dos nanotransportadores de drogas, o encapsulamento de nanopartículas de ouro (AuNPs) envolvidas por polímeros biocompatíveis se tornaram um caminho fascinante para testar a terapia fotodinâmica, com a grande vantagem de prevenir efeitos de agregação em condições biológicas. Essa dissertação tem enfoque na estabilização e atividade fotodinâmica de um nanomaterial híbrido constituído de AuNPs sintetizadas em água por ablação a laser pulsado. O copolímero Pluronic F-127 foi utilizado como componente polimérico para estabilizar as nanopartículas. A produção de oxigênio singlete pelos fotossensibilizadores clorina e6 e azul de metileno foi estudada em ausência e em presença das AuNPs, utilizando 1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) como sonda molecular. A reação específica de DPBF com oxigênio singlete modifica seu espectro de absorção na faixa visível, permitindo obter taxas de produção da espécie citotóxica. As amostras foram irradiadas com um LED emitindo em 650 nm e os espectros de absorção foram monitorados como função do tempo durante a irradiação. Foram obtidas taxas de fotodegradação dos fotossensibilizadores e rendimento quântico de produção de oxigênio singlete nos diferentes casos. / [en] Photodynamic therapy (PDT) is a medical treatment based on the optical excitation of a drug, called photosensitizer. When photosensitizers are exposed to light of specific wavelength, they can produce reactive species, such as singlet oxygen, capable of killing cells close to the irradiated site, such as cancer cells. Hybrid nanomaterials, comprising metallic nanoparticles and polymeric components, are investigated for their potential in biomedical applications due to their ability to simultaneously allow detection for diagnosis and therapy (theranostic). Thanks to the multi functionality assured by the nanoparticle plasmonic properties and therapeutic activity of the drug nanotransporters, the encapsulation of gold nanoparticles (AuNPs) wrapped by biocompatible polymers has become an attractive way to test photodynamic therapy, with the great advantage of preventing effects of aggregation under biological conditions. This dissertation focuses on the stabilization and photodynamic activity of a hybrid nanomaterial composed of AuNPs synthesized in water by laser ablation. The copolymer Pluronic F-127 was used as a polymeric component to stabilize the nanoparticles. The production of singlet oxygen by the photosensitizers chlorin e6 and methylene blue was studied in the absence and presence of AuNPs using 1,3 diphenylisobenzofuran (DPBF) as a molecular probe. The specific reaction of DPBF with singlet oxygen modifies its absorption spectrum in the visible range and allows to obtain rates of cytotoxic species production. Samples were irradiated with a LED emitting 650 nm radiation and the absorption spectra were monitored as a function of time during irradiation. Rates of photosensitizers degradation and quantum yields of singlet oxygen production were obtained in different cases.

A terapia fotodinâmica consiste em uma nova e promissora técnica de tratamento de câncer. O tratamento se baseia na administração tópica ou sistêmica de um fotossensibilizador, que se acumula seletivamente em tecido tumoral. Na presença de luz e oxigênio o fotossensibilizador produz espécies tóxicas levando as células à morte. Neste trabalho foi determinada a eficiência fotodinâmica dos corantes fenotiazínicos (Azul de Metileno e Azul de Toluidina O) e xantenos (Rose Bengal, Eritrosina B, Eosina Y e Fluoresceína) através da comparação dos valores de concentração inibitória media (IC50) em células tumorais HEp-2; atividade fotodinâmica utilizando o ácido úrico como dosímetro químico; interação com proteína através da constante de ligação (KA) com BSA e coeficiente de partição em octanol-água (logP). Os resultados foram relacionados com as propriedades moleculares destes corantes afim de se obter uma melhor compreensão de suas estruturas e fornecer subsídios para o planejamento de novos e melhores compostos para serem utilizados como fotossensibilizadores em PDT. Os experimentos mostraram que os fenotiazínicos são mais citotóxicos nesta linhagem celular do que os xantenos, sendo que o Azul de Toluidina O possui o menor valor de IC50. Dentre os xantenos, o Rose Bengal foi o fotossensibilizador mais eficiente em causar fotoxidação do ácido úrico e o Azul de Toluidina O dentre os fenotiazínicos. Estes resultados estão de acordo com os resultados obtidos nos experimentos citotóxicos, em que Rose Bengal e Azul de Toluidina O apresentam os menores valores de IC50, em suas respectivas famílias. Os xantenos possuem maior interação com BSA do que os fenotiazínicos. Os corantes fenotiazínicos são mais hidrofóbicos do que os xantenos (com vii exceção do Rose Bengal), o que corrobora com os valores de IC50, pois também são os mais citotóxicos. Relacionando algumas propriedades moleculares dos corantes obtidos no estudo teórico com os dados experimentais observou-se que; i) quanto menor os valores das energias dos orbitais HOMO e LUMO maior foi os valores obtidos de IC50; ii) os corantes fenotiazínicos são moléculas menores que os corantes xantenos, facilitando sua difusão pela membrana plasmática e a localização nas organelas; iii) nos corantes xantenos a substituição por um átomo de número atômico maior provoca aumento no valor da atividade fotodinâmica e iv) os xantenos apresentam momentos de dipolo maiores do que os fenotiazínicos, explicando assim a maior hidrofilicidade dos xantenos. Os resultados obtidos mostraram que os corantes fenotiazínicos possuem uma eficiência fotodinâmica superior aos dos corantes xantenos, sendo que o Azul de Toluidina O é o mais eficiente e deve ser considerado como agente potencial para aplicação em PDT. / The photodynamic therapy consists in a new technique for cancer treatment. The treatment is based on topic or systemic administration of a photosensitizer, which is selectively retained in tumor tissue. In the presence of light and oxygen, it produces toxic species to cells leading to their death. In this work it was determinated the photodynamic efficiency of phenothiazinium (Methylene Blue and Toluidine Blue O) and xanthene dyes (Rose Bengal, Erythrosin B, Eosin Y and Fluorescein) by comparing the values of medium inibitory concentration (IC50) in HEp-2; photodynamic activity using the uric acid as a chemical dosimeter; interaction with protein through the binding constant (KA) with BSA and the octanolwater partition coefficient (logP). The results were related with the molecular properties of these dyes, in order to obtain a better understanding of their structures and provide insights for the design of new and better compounds to be used as photosensitizers in PDT. The experiments showed that the phenothiazine dyes are more cytotoxic in this cell line than the xanthenes, being Toluidine Blue the one that has the lower IC50. Among the xanthenes, Rose Bengal was the most efficient photosensitizer in causing photoxidation of uric acid and the Toluidine Blue O among the phenothiazines. These results are consistent with the ones obtained in the cytotoxicity experiments, once the Rose Bengal and Toluidine Blue O have the lower IC50 values, when compared with the other dyes studied in the same family. The xathenes have higher interaction with BSA than the phenothiazines. The phenothiazine dyes are more hydrophobic than the xanthenes (with the exception of Rose Bengal), which corroborate with the IC50 values, once they are also the most cytotoxic. Relating some molecular properties of the dyes obtained in the theoretical studies with the experimental data, it could be observed that; i) the lower is the values of HOMO and LUMO energy, the high is the IC50; ii) the phenothiazine dyes are smaller molecules than the xanthenes, which facilitate their diffusion across the plasmatic membrane and the localization in organelles; iii) in xanthenes dyes the substitution for an atom with higher atomic number increases the photodynamic activity, and iv) the xanthenes dyes have the higher dipole moment than the phenothiazines, explaining the higher hydrophilicity of the xanthenes. The obtained results showed that the phenothiazine dyes have higher photodynamic efficiency than the xanthenes dyes, being Toluidine Blue the most efficient of these dyes and it should be considered as a potential agent for photodynamic therapy.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:42:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:55:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:05:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:53:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-16Bitstream added on 2014-06-13T20:38:35Z : No. of bitstreams: 1 trindade_fz_me_arafo.pdf: 753799 bytes, checksum: 6cf9c912e4ce2332952d19081bfcbfa7 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A utilização da PDT para tratamento de diferentes tipos de infecções, tal como a candidose bucal, tem sido estudada. Entretanto, poucos são os dados científicos que relatam os possíveis efeitos tóxicos dessa terapia. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da irradiação na mucosa bucal de ratos com LED azul (de 460 nm e potência de 200 mW/cm2) em presença do fotossensibilizador (FS) Photogem®, em duas diferentes concentrações (500 mg/L e 1000 mg/L). Para isso, foram utilizados 101 ratos (Rattus Norvegicus Albinus Holtzman) distribuídos em 6 grupos, de acordo com os seguintes tratamentos: Grupo 1 – controle; Grupo 2 – aplicação do FS (500 mg/L); Grupo 3 – aplicação do FS (500 mg/L) e irradiação com LED; Grupo 4 - aplicação do FS (1000 mg/L); Grupo 5 – aplicação do FS (1000 mg/L) e irradiação com LED; e Grupo 6 – irradiação com LED. O FS foi aplicado por 30 minutos (tempo de pré-incubação) e o tempo de irradiação da mucosa foi de 20 minutos (dose de 144 J/cm2). Decorridos os 4 períodos de avaliação propostos (0 dia, 1dia, 3 dias e 7 dias), os animais tiveram a mucosa palatina fotografada para análise macroscópica, sendo então imediatamente sacrificados para remoção cirúrgica do palato e posterior análise em microscopia de luz e de fluorescência. Um mapeamento térmico foi realizado a fim de avaliar a variação de temperatura ocorrida no tecido durante a irradiação com LED. Macroscopicamente, em todos os grupos experimentais e para todos os períodos de avaliação propostos na presente pesquisa, observou-se que a mucosa apresentava-se intacta, com aspecto de normalidade semelhante ao do Grupo 1 (controle). Microscopicamente, alterações teciduais, caracterizadas especialmente por discreta inflamação, puderam ser observadas na mucosa palatina de apenas 4 de um total de 80 animais submetidos a PDT... / The use of PDT has been investigated for the treatment of different types of infection, like oral candidosis. There are, however, few research-based data that report the possible toxic effects of this therapy. Therefore, this study evaluated the effects of irradiating the palatal mucosa of rats with blue LED (460 nm; 200 mW/cm²) in the presence of the photosensitizer Photogem® at two concentrations (500 and 1000 mg/L). Then, 101 rats (Rattus norvegicus albinus Holtzman) were randomly distributed in six groups, according to the treatment performed on the palatal mucosa: Group 1: control; Group 2: Photogem® (500 mg/L); Group 3: Photogem® (500 mg/L) + blue LED; Group 4 - Photogem® (1000 mg/L); Group 5: (1000 mg/L) + blue LED; and Group 6: blue LED. The exposure times to the photosensitizing agent and to the light source were 30 min (pre-incubation time) and 20 min (144 J/cm2 energy density), respectively. At 0, 1, 3 and 7 days posttreatment, the animals had their palatal mucosa photographed for macroscopic analysis and were immediately sacrificed. The palate was removed for further analysis by light and fluorescence microscopy. Thermal mapping was made to evaluate the temperature change occurred in the tissue during LED irradiation. In all experimental groups and periods, the macroscopic analysis revealed intact mucosa with normal aspect similar to that of Group 1 (control). Tissue alterations, characterized primarily by a mild inflammation, were observed microscopically on the mucosa of only 4 out of 80 animals subjected to PDT. Photosensitizer penetration into the treated mucosa was identified by the fluorescence emitted by Photogem® and was limited to the epithelial layer. The thermal mapping revealed a temperature increase from 35 to 41ºC during the 20-min irradiation. In conclusion, under the tested conditions, PDT using Photogem® at 500 and 1000 mg/L concentrations... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by MAÍRA TERRA GARCIA null (maa.terra@hotmail.com) on 2018-05-18T19:56:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final.pdf: 2946838 bytes, checksum: ea178be5bf5fe9de6d90f99275e65044 (MD5) / Approved for entry into archive by Silvana Alvarez null (silvana@ict.unesp.br) on 2018-05-21T17:11:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 garcia_mt_me_sjc.pdf: 2946838 bytes, checksum: ea178be5bf5fe9de6d90f99275e65044 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-21T17:11:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 garcia_mt_me_sjc.pdf: 2946838 bytes, checksum: ea178be5bf5fe9de6d90f99275e65044 (MD5) Previous issue date: 2018-05-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A terapia fotodinâmica (TFD) vem se mostrando eficaz na redução de patógenos bucais e diferentes fotossensibilizadores têm sido investigados. O objetivo desse estudo foi avaliar a eficácia da TFD sobre Streptococcus mutans usando dois fotossensibilizadores derivados da Clorina, Photoditazine (PDZ) e Fotoenticine (FTC), associados à irradiação Laser (660nm, 50 mw/cm²). Esses fotossensibilizadores também foram comparados com o Azul de Metileno (AM) que já tem seus efeitos comprovados contra S. mutans. Para realização desse trabalho, foram isoladas 11 amostras clínicas de S. mutans a partir de pacientes com lesões de cáries ativas. Essas amostras foram identificadas pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), seguida por confirmação em sequenciamento automático. Também foi incluída no estudo uma cepa padrão de referência (S. mutans UA159). Os efeitos da TFD foram testados sobre S. mutans em culturas planctônicas e sobre biofilmes formados em dentes bovinos. Os resultados foram avaliados pela contagem de células viáveis e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A capacidade dos fotossensibilizadores em penetrar nas células de S. mutans foi avaliada por meio da absorbância em espectrofotômetro. Os dados foram analisados por ANOVA e teste de Tukey. Na identificação das amostras, verificou-se que todas apresentaram o fragmento de 517 pb específico para S. mutans e que o sequenciamento demonstrou similaridade de 87% com a cepa de referência. Em culturas planctônicas, todos os fotossensibilizadores reduziram as células de S. mutans com diferença significante em relação ao grupo sem tratamento. O FTC conseguiu atingir 100% de redução tanto para a cepa de referência como para as cepas clínicas. Nos testes em biofilmes, houve redução bacteriana de 4 log para o AM, 6 log para o PDZ e de 5 a 8 log para o FTC. Na cepa padrão de referência, o FTC levou a eliminação total das células de S. mutans. Além disso, verificou-se que o FTC foi o fotossensibilizador com maior capacidade de desestruturar o biofilme e penetrar nas células de S. mutans. Concluiu-se que os fotossensibilizadores derivados da clorina demonstraram maior atividade antimicrobiana na TFD contra S. mutans em relação ao AM, sendo esse efeito mais significativo para o FTC. / A terapia fotodinâmica (TFD) vem se mostrando eficaz na redução de patógenos bucais e diferentes fotossensibilizadores têm sido investigados. O objetivo desse estudo foi avaliar a eficácia da TFD sobre Streptococcus mutans usando dois fotossensibilizadores derivados da Clorina, Photoditazine (PDZ) e Fotoenticine (FTC), associados à irradiação Laser (660nm, 50 mw/cm²). Esses fotossensibilizadores também foram comparados com o Azul de Metileno (AM) que já tem seus efeitos comprovados contra S. mutans. Para realização desse trabalho, foram isoladas 11 amostras clínicas de S. mutans a partir de pacientes com lesões de cáries ativas. Essas amostras foram identificadas pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), seguida por confirmação em sequenciamento automático. Também foi incluída no estudo uma cepa padrão de referência (S. mutans UA159). Os efeitos da TFD foram testados sobre S. mutans em culturas planctônicas e sobre biofilmes formados em dentes bovinos. Os resultados foram avaliados pela contagem de células viáveis e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A capacidade dos fotossensibilizadores em penetrar nas células de S. mutans foi avaliada por meio da absorbância em espectrofotômetro. Os dados foram analisados por ANOVA e teste de Tukey. Na identificação das amostras, verificou-se que todas apresentaram o fragmento de 517 pb específico para S. mutans e que o sequenciamento demonstrou similaridade de 87% com a cepa de referência. Em culturas planctônicas, todos os fotossensibilizadores reduziram as células de S. mutans com diferença significante em relação ao grupo sem tratamento. O FTC conseguiu atingir 100% de redução tanto para a cepa de referência como para as cepas clínicas. Nos testes em biofilmes, houve redução bacteriana de 4 log para o AM, 6 log para o PDZ e de 5 a 8 log para o FTC. Na cepa padrão de referência, o FTC levou a eliminação total das células de S. mutans. Além disso, verificou-se que o FTC foi o fotossensibilizador com maior capacidade de desestruturar o biofilme e penetrar nas células de S. mutans. Concluiu-se que os fotossensibilizadores derivados da clorina demonstraram maior atividade antimicrobiana na TFD contra S. mutans em relação ao AM, sendo esse efeito mais significativo para o FTC. / Photodynamic therapy (PDT) has been shown to be effective in reducing oral pathogens and different photosensitizers have been investigated. The objective of this study was to evaluate the efficacy of PDT on Streptococcus mutans using two photosensitizers derived from Chlorine, Photoditazine (PDZ) and Fotoenticine (FTC) associated with Laser irradiation (660 nm, 50 mw / cm²). These photosensitizers were also compared to Methylene Blue (AM) that already has its proven effects against S. mutans. To perform this work, 11 clinical samples of S. mutans were isolated from patients with active caries lesions. These samples were identified by the Polymerase Chain Reaction (PCR), for confirmation in automatic sequencing. Also included in the study was a standard standard (S. mutans UA159). The effects of PDT were tested on S. mutans in planktonic cultures and on biofilms formed in bovine teeth. Results of viable cell and Scanning Electron Microscopy (SEM) tests. The ability of the photosensitizers to penetrate the S. mutans cells was evaluated by spectrophotometer absorption. Data were analyzed by ANOVA and Tukey's test. In the identification of the samples, all the presentations of the 517 bp fragment specific for S. mutans and that the sequencing demonstrate similarity of 87% with a reference strain were found. In planktonic cultures, all photosensitizers reduced as S. mutans cells with a significant difference in relation to the untreated group. The FTC achieved a 100% reduction for both the reference strain and the clinical strains. In biofilm tests, there was a 4 log reduction for AM, 6 log for PDZ and 5 to 8 log for FTC. In the standard reference strain, FTC led to the complete elimination of S. mutans cells. In addition, it was found that FTC was the photosensitizer with the greatest capacity to de-structure the biofilm and penetrate S. mutans cells. It was concluded that the photosensitizers derived from chlorine showed a greater antimicrobial activity in PDT against S. mutans in relation to AM, being this effect more significant for the FTC. / 2016/09296-8

O presente trabalho teve por objetivo avaliar a ação do laser de baixa intensidade associado ao corante azul de toluidina, como agente bactericida durante a fase de instrumentação dos canais radiculares, comparando sua utilização associada ou não ao hipoclorito de sódio 0,5%. Para tal, 90 caninos humanos foram instrumentados, autoclavados e 88 imersos em caldo TSB(Tryptcase Soy Broth). Em seguida foram inoculados com suspensão de E. faecalis e incubados em estufa a 37C, por 72 horas, para permitir a formação do biofilme. As amostras foram randomicamente divididas em 4 grupos de 22 dentes cada e 1 grupo controle negativo com 2 dentes. Grupo I: reinstrumentados e irrigados com soro fisiológico com posterior aplicação de terapia fotodinâmica (PDT); Grupo II: reinstrumentados e irrigados com hipoclorito de sódio a 0,5% com posterior aplicação de PDT; Grupo III: reinstrumentados e irrigados com hipoclorito de sódio a 0,5%; Grupo IV controle positivo: não foi realizado nenhum tipo de tratamento antes da coleta do material e Grupo V controle negativo:não foram contaminados. Para a coleta da dentina intracanal utilizou-se uma broca Gates Glidden número 6. A atividade antimicrobiana foi avaliada por meio da contagem de UFCs (unidades formadoras de colônias). Os dentes foram então imersos em meio seletivo para enterococos, incubados em estufa a 37 C por 72 horas e avaliados quanto à alteração de coloração do meio. Todas as amostras, exceto o controle negativo, apresentaram-se positivas. Com a finalidade de certificar-se da formação do biofilme e da confirmação dos resultados das contagens das UFCs, 9 amostras foram avaliadas ao MEV (microscopia eletrônica de varredura). Para a análise dos resultados utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis e o teste de comparações múltiplas de Tukey, ambos com o nível de significância de 5%. Baseado nos resultados obtidos parece-nos lícito concluir que não houve diferença estatística significante entre o grupo hipoclorito e o hipoclorito com laser e que PDT associada à instrumentação com soro fisiológico não foi capaz de eliminar o E. faecalis de forma significativa. / This current paper aims to assess the action of low-intensity laser together with toluidine blue as a bactericidal agent during the instrumentation phase of radicular canals, comparing its associated or non-associated use with sodium hypochlorite 0.5%. To do so, 90 human canines were instrumented, autoclaved, and 88 were immersed into TSB, and were then inoculated with an E. faecalis suspension and brought into an incubator at 37 degrees Celsius for 72 hours in order to allow the formation of biofilm. The samples were randomly divided into 5 groups, 4 of which composed of 22 samples each plus 1 negative control. Group I: reinstrumented and irrigated with saline solution and subsequent application of photodynamic therapy (PDT); Group II: reinstrumented and irrigated with sodium hypochlorite 0.5% and subsequent PDT application; Group III: reinstrumented and irrigated with sodium hypochlorite 0.5%; Group IV: positive control (no previous treatment before material collection); Group V: negative control (2 samples) with no contamination. The collection of intracanal dentin was obtained by using a Gates Glidden drill #6. The antimicrobial activity was assessed by CFUs counting. The teeth were then immersed in a selected medium for Enterococcus, incubated at 37 degrees Celsius for 72 hours. They were then assessed for medium turbidity. All samples, with the exception of the negative control, showed positive. In order to make sure of the formation of biofilm and the confirmation of the CFUs counting, 9 samples were scavenged under the electron microscope. For result assessment, the Kruskal-Wallis test and the Tukeys multiple comparison test were utilized, presenting both tests a rate and significance of 5%. Based on the results obtained, we may licitly conclude that there was no significant statistical difference between the hypochlorite group and the hypochlorite group with laser. We may still conclude that PDT associated with saline solution instrumentation was not possible to significantly eliminate E. faecalis.