Orientador: João Ruggiero Neto / Banca: Carlos José Leopoldo Constantino / Banca: Renata Danielle Adati / Banca: Jorge Chahine / Banca: Eloi da Silva Feitosa / Resumo: Peptídeos antimicrobianos agem diretamente na matriz lipídica da membrana celular perturbando o empacotamento lipídico, criando tensões elásticas e desequilíbrio de massa, que são relaxados pela formação de poros ou defeitos que dão origem ao processo lítico. Polybia-MP1, ou simplesmente MP1, com sequência de aminoácidos IDWKKLLDAAKQIL-NH2, extraído da vespa nativa Polybia paulista, é um exemplo destes peptídeos. Além de potente atividade antimicrobiana ele inibe a proliferação celular em culturas de células de câncer de próstata e bexiga. Este efeito inibitório acredita-se ser devido à presença simultânea de aminofosfolipídios fosfatidilserina (PS) e fosfatidiletanolamina (PE) nas monocamadas externas das membranas destas células. Investigação da atividade lítica em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) revelaram que o peptídeo induziu a formação de regiões fluorescentes densas que foram atribuídas à agregação peptídeo/lipídio ou então à segregação lipídica. A atividade permeabilizadora do MP1 foi também fortemente modulada quando as GUVs continham frações de aminofosfolipídios PS e PE. Foi observado que a permeabilidade induzida pelo MP1 aumentou dramaticamente para vesículas de PC/PE/PS (7:1:2) permitindo influxo de moléculas de 10 kDa. Esta tese investigou a habilidade do MP1 em perturbar o empacotamento lipídico usando monocamadas lipídicas como modelo de membrana. Foram utilizados três fosfolipídios: PC, PE e PS contendo duas cadeias acíclicas. Isotermas de compressão foram obtidas usando cuba de Langmuir conjugadas com microscópios de fluorescência e de ângulo de Brewster. Por meio de isotermas de compressão de filme lipídico foram investigadas a preferência do peptídeo pelas fases lipídicas e seu efeito na coexistência de fases e nas alterações induzidas na forma, tamanho e número de domínios sólidos. Utilizando cadeias acíclicas derivadas de ácidos mirístico e... / Abstract: Antimicrobial peptides act directly on the lipid matrix of the cell membrane by perturbing the lipid packing, creating elastic stresses and mass imbalance, that are relieved by the formation of pores or defects resulting in the lytic activity. Polybia MP1, or shortly MP1, with aminoacid sequence IDWKKLLDAAKQIL-NH2, extracted from the native wasp Polybia paulista is an example of these peptides. Beyond a potent antibacterial activity, it inhibits cell proliferation in prostate and bladder cancer cell cultures. This inhibitory effect is believed to be due to the simultaneous presence of aminophospholipids: phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE) on the outer leaflet of these cell membranes. Investigations of MP1 lytic activity in giant unilamellar vesicles (GUVs) revealed that the peptide induced some dense fluorescent regions on the vesicles that were interpreted as being due to peptide/lipid aggregation or to lipid segregation. The MP1 permeabilizing activity was also strongly modulated when fractions of aminophospholipids PS and PE were present in the lipid composition of these GUVs. It was observed that the permeability induced by MP1 increased dramatically for vesicles of PC/PE/PS (7:1:2) allowing influx of up to 10 kDa molecules. This thesis investigated the ability of MP1 in disturbing lipid packing using lipid monolayers as model membranes. Three diacylated phospholipids: PC, PE and PS were used. Compression isotherms obtained with Langmuir trough in conjunction with fluorescence and Brewster angle microscopies were used to investigate preferences of the peptide for lipid phases and its effects on the phase coexistence and on the changes of the shape, size and number of solid domains. Using diacyl chains derived from myristic and palmitic acids attached to PC, PE and PS polar heads it was possible to explore the role played by head groups and effect of the acyl chain lengths on the impact of the peptide in lipid ... / Doutor

[pt] Defensinas de planta, componentes inatos do sistema imune das plantas, são peptídeos antifúngicos, catiônicos, com estrutura primária rica em cisteína. Evidência dada pela literatura demonstrou que trechos de esfingolipídios complexos na membrana dos fungos, contendo manosildiinositolfosforilceramida e glicosilceramida, são sítios de ligação seletivos para as defensinas de planta isoladas de Dahlia merckii e Raphanus sativus, respectivamente. Entretanto, desconhece-se se as defensinas de planta interagem direta ou indiretamente com alvos intracelulares dos fungos. A fim de identificar interações físicas e diretas do tipo proteína- proteína, um sistema de duplo-híbrido, em levedura, baseado no fator de transcrição GAL4, foi construído utilizando-se como isca, a defensina da planta Pisum sativum, Psd1 (Pisum sativum defensin 1). Proteínas alvos, capazes de interagirem com o peptídeo Psd1, foram detectadas através do rastreamento de uma biblioteca de cDNA do fungo Neurospora crassa. Do resultado deste rastreamento, nove dentre quinze candidatos, selecionados pelo método do duplo-híbrido, foram identificados como proteínas nucleares da N. crassa. Um clone, detectado com alta freqüência neste rastreamento, apresentou homologia de seqüência com a proteína ciclina F, relacionada com o controle do ciclo celular. O ensaio de co-purificação utilizando a proteína conjugada a glutationa S-transferase (GST) validou in vitro o resultado obtido pelo sistema duplohíbrido. Análise por microscopia de fluorescência da Psd1, conjugada a FITC, e, dos núcleos do fungo Fusarium solani, marcados com DAPI, demonstrou in vivo a co-localização da defensina de planta Psd1 com os núcleos do fungo. Para pesquisar o modo de ação da Psd1 ao nível do ciclo celular, utilizou-se o modelo multicelular da retina de ratos neonatais, em desenvolvimento. Neste modelo, a migração nuclear intercinética, correlacionada com as transições de fase de S para M do ciclo celular, foi observada na presença da Psd1. Verificouse que Psd1 impediu a migração nuclear em neuroblastos, parando o ciclo celular na transição de S para G2. Estes resultados revelaram modos de ação da defensina de planta Psd1 sobre a fisiologia nuclear. / [en] Plant defensins, innate components of the plant immune system, are cationic, antifungal peptides, with a cysteine- rich primary structure. Evidence from the literature demonstrated that fungus membrane patches containing complex sphingolipids, mannosyldiinositolphosphorylceramide and glucosylceramides, are selective binding sites for the plant defensins isolated from Dahlia merckii and Raphanus sativus, respectively. However, whether the plant defensins interact directly or indirectly with fungus intracellular targets is unknown. To identify direct physical protein-protein interactions, a GAL4-based yeast two-hybrid system was constructed, using the plant peptide, Pisum sativum defensin 1 (Psd1), as the bait protein. Target proteins, capable of interacting with the bait Psd1, were detected by screening a Neurospora crassa cDNA library. In this screening, nine out of fifteen two-hybrid candidates were identified as N. crassa nuclear proteins. One clone, detected with high frequency in the screening, presented sequence similarity to a N. crassa cyclin F, related to the cell cycle control. The GST pull- down co purification assay corroborated this two-hybrid result in vitro. Fluorescence microscopy analysis of FITC- conjugated Psd1 and DAPI-stained Fusarium solani nuclei demonstrated in vivo the co-localization of the plant peptide Psd1 and the fungus nuclei. We used the developing retina of neonatal rats as a multicellular model to study Psd1 mode of action at the cell cycle level. In this model, we observed in vivo the interkinetic nuclear migration, correlated to the transitions from S to M-phase of the cell cycle, in the presence of the Psd1 peptide. It was shown that Psd1 impaired nuclear migration of neuroblasts by arresting the cell cycle at the S to G2- phase transition. These results revealed modes of action of the plant defensin Psd1 upon the nuclear physiology.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-16Bitstream added on 2014-06-13T20:38:35Z : No. of bitstreams: 1 trindade_fz_me_arafo.pdf: 753799 bytes, checksum: 6cf9c912e4ce2332952d19081bfcbfa7 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A utilização da PDT para tratamento de diferentes tipos de infecções, tal como a candidose bucal, tem sido estudada. Entretanto, poucos são os dados científicos que relatam os possíveis efeitos tóxicos dessa terapia. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da irradiação na mucosa bucal de ratos com LED azul (de 460 nm e potência de 200 mW/cm2) em presença do fotossensibilizador (FS) Photogem®, em duas diferentes concentrações (500 mg/L e 1000 mg/L). Para isso, foram utilizados 101 ratos (Rattus Norvegicus Albinus Holtzman) distribuídos em 6 grupos, de acordo com os seguintes tratamentos: Grupo 1 – controle; Grupo 2 – aplicação do FS (500 mg/L); Grupo 3 – aplicação do FS (500 mg/L) e irradiação com LED; Grupo 4 - aplicação do FS (1000 mg/L); Grupo 5 – aplicação do FS (1000 mg/L) e irradiação com LED; e Grupo 6 – irradiação com LED. O FS foi aplicado por 30 minutos (tempo de pré-incubação) e o tempo de irradiação da mucosa foi de 20 minutos (dose de 144 J/cm2). Decorridos os 4 períodos de avaliação propostos (0 dia, 1dia, 3 dias e 7 dias), os animais tiveram a mucosa palatina fotografada para análise macroscópica, sendo então imediatamente sacrificados para remoção cirúrgica do palato e posterior análise em microscopia de luz e de fluorescência. Um mapeamento térmico foi realizado a fim de avaliar a variação de temperatura ocorrida no tecido durante a irradiação com LED. Macroscopicamente, em todos os grupos experimentais e para todos os períodos de avaliação propostos na presente pesquisa, observou-se que a mucosa apresentava-se intacta, com aspecto de normalidade semelhante ao do Grupo 1 (controle). Microscopicamente, alterações teciduais, caracterizadas especialmente por discreta inflamação, puderam ser observadas na mucosa palatina de apenas 4 de um total de 80 animais submetidos a PDT... / The use of PDT has been investigated for the treatment of different types of infection, like oral candidosis. There are, however, few research-based data that report the possible toxic effects of this therapy. Therefore, this study evaluated the effects of irradiating the palatal mucosa of rats with blue LED (460 nm; 200 mW/cm²) in the presence of the photosensitizer Photogem® at two concentrations (500 and 1000 mg/L). Then, 101 rats (Rattus norvegicus albinus Holtzman) were randomly distributed in six groups, according to the treatment performed on the palatal mucosa: Group 1: control; Group 2: Photogem® (500 mg/L); Group 3: Photogem® (500 mg/L) + blue LED; Group 4 - Photogem® (1000 mg/L); Group 5: (1000 mg/L) + blue LED; and Group 6: blue LED. The exposure times to the photosensitizing agent and to the light source were 30 min (pre-incubation time) and 20 min (144 J/cm2 energy density), respectively. At 0, 1, 3 and 7 days posttreatment, the animals had their palatal mucosa photographed for macroscopic analysis and were immediately sacrificed. The palate was removed for further analysis by light and fluorescence microscopy. Thermal mapping was made to evaluate the temperature change occurred in the tissue during LED irradiation. In all experimental groups and periods, the macroscopic analysis revealed intact mucosa with normal aspect similar to that of Group 1 (control). Tissue alterations, characterized primarily by a mild inflammation, were observed microscopically on the mucosa of only 4 out of 80 animals subjected to PDT. Photosensitizer penetration into the treated mucosa was identified by the fluorescence emitted by Photogem® and was limited to the epithelial layer. The thermal mapping revealed a temperature increase from 35 to 41ºC during the 20-min irradiation. In conclusion, under the tested conditions, PDT using Photogem® at 500 and 1000 mg/L concentrations... (Complete abstract click electronic access below)

Resumo: A utilização da PDT para tratamento de diferentes tipos de infecções, tal como a candidose bucal, tem sido estudada. Entretanto, poucos são os dados científicos que relatam os possíveis efeitos tóxicos dessa terapia. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da irradiação na mucosa bucal de ratos com LED azul (de 460 nm e potência de 200 mW/cm2) em presença do fotossensibilizador (FS) Photogem®, em duas diferentes concentrações (500 mg/L e 1000 mg/L). Para isso, foram utilizados 101 ratos (Rattus Norvegicus Albinus Holtzman) distribuídos em 6 grupos, de acordo com os seguintes tratamentos: Grupo 1 - controle; Grupo 2 - aplicação do FS (500 mg/L); Grupo 3 - aplicação do FS (500 mg/L) e irradiação com LED; Grupo 4 - aplicação do FS (1000 mg/L); Grupo 5 - aplicação do FS (1000 mg/L) e irradiação com LED; e Grupo 6 - irradiação com LED. O FS foi aplicado por 30 minutos (tempo de pré-incubação) e o tempo de irradiação da mucosa foi de 20 minutos (dose de 144 J/cm2). Decorridos os 4 períodos de avaliação propostos (0 dia, 1dia, 3 dias e 7 dias), os animais tiveram a mucosa palatina fotografada para análise macroscópica, sendo então imediatamente sacrificados para remoção cirúrgica do palato e posterior análise em microscopia de luz e de fluorescência. Um mapeamento térmico foi realizado a fim de avaliar a variação de temperatura ocorrida no tecido durante a irradiação com LED. Macroscopicamente, em todos os grupos experimentais e para todos os períodos de avaliação propostos na presente pesquisa, observou-se que a mucosa apresentava-se intacta, com aspecto de normalidade semelhante ao do Grupo 1 (controle). Microscopicamente, alterações teciduais, caracterizadas especialmente por discreta inflamação, puderam ser observadas na mucosa palatina de apenas 4 de um total de 80 animais submetidos a PDT... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of PDT has been investigated for the treatment of different types of infection, like oral candidosis. There are, however, few research-based data that report the possible toxic effects of this therapy. Therefore, this study evaluated the effects of irradiating the palatal mucosa of rats with blue LED (460 nm; 200 mW/cm²) in the presence of the photosensitizer Photogem® at two concentrations (500 and 1000 mg/L). Then, 101 rats (Rattus norvegicus albinus Holtzman) were randomly distributed in six groups, according to the treatment performed on the palatal mucosa: Group 1: control; Group 2: Photogem® (500 mg/L); Group 3: Photogem® (500 mg/L) + blue LED; Group 4 - Photogem® (1000 mg/L); Group 5: (1000 mg/L) + blue LED; and Group 6: blue LED. The exposure times to the photosensitizing agent and to the light source were 30 min (pre-incubation time) and 20 min (144 J/cm2 energy density), respectively. At 0, 1, 3 and 7 days posttreatment, the animals had their palatal mucosa photographed for macroscopic analysis and were immediately sacrificed. The palate was removed for further analysis by light and fluorescence microscopy. Thermal mapping was made to evaluate the temperature change occurred in the tissue during LED irradiation. In all experimental groups and periods, the macroscopic analysis revealed intact mucosa with normal aspect similar to that of Group 1 (control). Tissue alterations, characterized primarily by a mild inflammation, were observed microscopically on the mucosa of only 4 out of 80 animals subjected to PDT. Photosensitizer penetration into the treated mucosa was identified by the fluorescence emitted by Photogem® and was limited to the epithelial layer. The thermal mapping revealed a temperature increase from 35 to 41ºC during the 20-min irradiation. In conclusion, under the tested conditions, PDT using Photogem® at 500 and 1000 mg/L concentrations... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ana Cláudia Pavarina / Coorientador: Carlos Alberto de Souza / Banca: Eunice Teresinha Giampaolo / Banca: Cristina Kuraschi / Mestre

Orientador: João Ruggiero Neto / Resumo: Os peptídeos sintéticos L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2, Q = +3e) e seu análogo acetilado (acL1A, Q = +2e) utilizados neste estudo foram projetados para que tenham características estruturais semelhantes ao peptídeo Polybia-MP1 extraído do veneno da vespa Polybia paulista, em que um dos dois resíduos ácidos ocupa a segunda posição na região Nterminal, e resíduos básicos são terceiros e/ou quartos vizinhos dos resíduos ácidos. Esses peptídeos possuem significativa atividade bactericida seletiva para bactérias Gram-negativas, especialmente Escherichia coli, sem serem hemolíticos. Estudos anteriores, em sistemas modelo, demonstraram que a acetilação do N-terminal resultou no aumento da atividade lítica em vesículas aniônicas (8POPC/2POPG) em comparação com o L1A, o que sugeriu perturbação do empacotamento lipídico de modo mais eficaz para o análogo que é menos carregado. Considerando que a membrana plasmática de bactérias Gram-negativas contém majoritariamente fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilglicerol (PG), o presente trabalho propôs investigar o impacto dos peptídeos L1A e acL1A em membranas modelo compostas por 3POPE/1DOPG utilizando uma variedade de técnicas experimentais. Os resultados demonstraram que ambos os peptídeos induziram segregação lipídica, sendo o análogo acetilado mais eficiente em recrutar PG e segregar PE. / Abstract: The synthetic peptides L1A (IDGLKAIWKKVADLLKNT-NH2, Q = +3e) and its acetylated analog (acL1A, Q = +2e) used in this study were designed to have some structural features similar to the peptide Polybia-MP1 extracted from the venom of the wasp Polybia paulista, in which one of the acidic residues occupies the second position on the N-terminus region and basic residues are third and/or fourth neighbors of the acidic residues. These peptides display significant bactericidal activity against Gram-negative bacteria, especially Escherichia coli, being non-hemolytic. Previous work performed in model membrane systems has shown that the N-terminal acetylation led to an increase on the lytic activity in anionic vesicles (8POPC/2POPG) compared with L1A, suggesting that the less charged peptide has higher ability to perturb the lipid-packing. Considering that the Gram-negative cell membranes contain mainly phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylglycerol (PG), the present work proposed to investigate the impact of L1A and acL1A on model membranes composed of 3POPE/1DOPG using a variety of experimental techniques. The results suggested that both peptides induced lipid segregation being the acetylated analog more efficient in recruiting PG and segregating PE. / Mestre