Les travaux présentés dans ce manuscrit sont divisés en deux grandes parties, et abordent des applications biologiques relatives au cancer et plus particulièrement à leur traitement. La première partie est consacrée à une recherche technologique, dont l'objectif est le développement d'un dispositif innovant permettant de contrôler plus efficacement la phase cytotoxique de la thérapie photodynamique. Cette thérapie contre le cancer met en jeu trois éléments principaux : un agent photosensibilisant, de l'oxygène et de la lumière. La solution proposée repose sur une stratégie d'asservissement d'un indicateur thérapeutique observable durant le traitement : le photoblanchiment. Le système d'asservissement développé utilise un observateur d'état qui a nécessité de résoudre en pratique des problèmes d'identifiabilité et d'identification d'un processus non-linéaire. Il est implanté dans une plateforme pilote opérationnelle validée par des tests in vitro. Une demande de brevet pour le dispositif développé est en cours. La seconde partie de cette thèse s'inscrit dans le cadre d'une recherche appliquée, sur le thème de l'identification à temps continu de systèmes biologiques, à partir de séquences d'images au travers de trois cas d'études aux échelles cellulaire, tissulaire et animale. Une première étude est dédiée à la proposition d'un modèle à compartiments de la pharmacocinétique intratumorale de nanoparticules multifonctionnelles dans des cerveaux de rats, ainsi qu'à son identification à partir de séquences d'images IRM in vivo. La seconde traite de la modélisation, à partir de données d'imagerie expérimentale de fluorescence, de la fonctionnalité des jonctions communicantes intercellulaires. L'objectif est de discriminer deux types de cellules cancéreuses, grâce à leur dynamique de recouvrement de fluorescence. Enfin, un troisième cas d'étude aborde le problème de l'identification d'une cohorte de systèmes à partir de petits échantillons de données. Le contexte applicatif est l'étude de l'angiogenèse tumoral et de l'effet des traitements anti-cancer sur le développement du réseau vasculaire / The presented works are divided into two main parts and deal with biological applications to cancer, and more specifically to their treatments. The first part is dedicated to a technological research, in which a new device is designed and built to efficiently control the cytotoxic phase of photodynamic therapy. This anti-cancer therapy involves three main compounds: a photosensitizer agent, oxygen and light. The proposed solution relies on the control of an observable therapeutic indicator during the treatment: the photobleaching phenomenon. The developed control system uses a state observer which required to solve practical identifiability issues and the identification of a non-linear process. It has been implemented in a technical platform and validated during in in vitro tests. A patent application for this device is currently under review. The second section of this thesis deals with the applicability of continuous-time identification approaches to three biological systems from image sequences recorded at cellular, tissue and animal scales. A first study examines how continuous-time system identification may be used to determine a pharmacokinetic compartmental model of multifunctional nanoparticles within rat brain from in vivo MRI images. The second study deals with the empirical modeling of the junctional intercellular communication functionalities. The purpose is to discriminate two cancer cells types from their fluorescence recovery dynamics. Finally, a third study case addresses the issue of identifying a systems cohort from small amount of data. The applied context is the study of tumoral angiogenesis and the anti-cancer treatment effects on vascular network development

O objetivo deste estudo foi verificar a eficácia da Terapia Fotodinâmica (PDT) no tratamento de bolsas residuais de pacientes portadores de periodontite crônica em manutenção periodontal, através da avaliação de parâmetros clínicos e microbiológicos. Um ensaio clínico aleatório controlado duplo-cego paralelo foi conduzido para avaliar 34 pacientes com periodontite crônica, que foram submetidos ao tratamento periodontal convencional e apresentaram pelo menos quatro sítios com bolsas residuais na reavaliação. Os pacientes foram alocados em grupo teste (PDT) e grupo controle (sham) aleatoriamente. A terapia fotodinâmica foi realizada através da irrigação subgengival com azul de metileno (0,01%), e a irradiação com laser de diodo a 660nm, 90J/cm2 por 90s A intervenção foi feita no início do estudo, aos 3, 6 e 9 meses. Os parâmetros clínicos foram avaliados no início, 3, 6 e 12 meses após o tratamento. A coleta de placa subgengival foi feita antes da intervenção, uma semana após, 3, 6 e 12 meses depois. A avaliação microbiológica foi feita a partir da detecção e quantificação de Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola e Aggregatibacter actinomycetemcomitans, pela reação de polimerase em cadeia em tempo real. Todos os parâmetros clínicos avaliados apresentaram melhora significativa durante o estudo, porém não houve diferença significativa entre os grupos. Em relação à análise microbiológica, não houve diferença entre os grupos em nenhum momento do estudo. Porém, houve redução significativa de T. forsythia no grupo teste aos 6 meses, e aumento significativo de P. gingivalis no mesmo grupo aos 12 meses. Dentro dos parâmetros do laser e fotossensibilizador utilizados neste estudo, a PDT não demonstrou ter efeito benéfico adicional no tratamento de bolsas periodontais residuais. / The aim of this study was to investigate the effectiveness of Photodynamic Therapy (PDT) in the treatment of residual pockets of chronic periodontitis patients in periodontal maintenance, by assessing clinical and microbiological parameters. A randomized clinical controlled double-blind parallel trial was performed to assess 34 periodontal patients, who received conventional periodontal treatment and presented residual pockets at revaluation. The patients were allocated to test (PDT) and control (sham) group randomly. The photodynamic therapy was performed by subgingival irrigation with methylene blue (0.01%), and diode laser irradiation (660nm, 90j/cm2) during 90s. The intervention was performed at baseline, 3, 6 and 9 months. The clinical parameters were evaluated at baseline, 3, 6 and 12 months. The subgingival plaque sampling was collected before intervention, a week after, 3, 6 and 12 months later. The detection and quantification of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola and Aggregatibacter actinomycetemcomitans was achieved by means of the real time polymerase chain reaction. All clinical parameters showed significant improvement during the study, but there was no significant difference between groups. The microbiological analyses showed no differences between groups in any time of study. There was a significant reduction of T. forsythia in test group at 6 months, and a significant increase of P. gingivalis in test group at 12 months. Considering the laser and photosensitizer used in this trial, PDT failed to demonstrate additional benefits in residual pockets treatment.

A leishmaniose pertence à classe de doenças infecciosas e é causada por parasitas do gênero Leishmania. Essa enfermidade se manifesta nas formas visceral ou cutânea e o tratamento de ambas consiste em quimioterapia utilizando fármacos à base de antimônio. A aplicação desses medicamentos, no entanto, apresenta diversas desvantagens, como o surgimento de efeitos colaterais severos e a disseminação de parasitas resistentes aos fármacos convencionais. Dessa forma, há uma grande necessidade de se desenvolver novos medicamentos, bem como, novas técnicas de tratamento e diagnostico. Neste trabalho foram sintetizados novos fotossensibilizadores derivados da riboflavina (vitamina B2) com potencial aplicação no tratamento de leishmaniose cutânea (através de terapia fotodinâmica) e foram sintetizados novos complexos de Ru (II) com potencial uso como sensores luminescentes de antimônio. Os derivados da riboflavina foram obtidos utilizando a vitamina B2 como material de partida e as transformações químicas estudadas fizeram uso de reações de acilação das hidroxilas da cadeia ribitil e de alquilações do nitrogênio 3 do sistema de anéis isoaloxazina. Essas modificações estruturais permitiram a construção de uma biblioteca de fotossensibilizadores que contém partes hidrofílicas, hidrofóbicas, anfifílicas e iônicas, que possibilitaram estudos da relação estrutura atividade. Com a otimização dessas rotas sintéticas foram obtidos dois derivados flavínicos-catiônicos inéditos na literatura com rendimentos de até 68%. Foi mostrado que as transformações químicas estudadas não afetaram significantemente as propriedades fotofísicas dos derivados flavínicos, sendo todos eles fluorescentes e capazes de fotossensibilizar a produção de oxigênio singlete com rendimento quântico semelhante ao da riboflavina (Φ&#916. ≈ 0,5). Por outro lado, as modificações estruturais na riboflavina alteraram as propriedades físico-químicas em termos de solubilidade e coeficiente de partição. Os derivados sintetizados foram testados contra promastigotas de Leishmania major utilizando LED azul (470 nm). Os fotossensibilizadores apresentaram baixa toxicicidade no escuro (CE50 (concentração efetiva 50%)> 100 µM para todos os compostos) e todos os derivados testados apresentaram maior fototoxicidade (CE50 de até 5 µM) que a riboflavina (CE50 de 50 µM). Foi observado que a fototoxicidade dos derivados da riboflavina está fortemente associada à lipofilicidade do fotossensibilizador. Um complexo de Ru (II) que responde à presença de antimônio foi preparado a partir do bis-complexo Ru(bpz)2Cl2 e do ligante derivado da fenantrolina contendo o grupo bitiofeno (bitiofeno-imidazo-fen). Esse complexo apresenta potencial na construção de sensores luminescentes de antimônio. Foi mostrado que o novo complexo sintetizado [Ru(bpz)2(bitiofeno-imidazo-fen)2+] apresenta baixa luminescência na região do vermelho devido à auto-supressão causada pelo grupo bitiofeno. No entanto, estudos preliminares mostraram que a adição de SbCl3 ou tartarato de antimônio ao meio intensifica significativamente a emissão nessa região do espectro. Devido à formação do complexo Sb-bitiofeno, ocorre o aumento percentual da espécie eletronicamente excitada e a mesma é auto-suprimida com menos eficiência. / The leishmaniases belong to a group of infectious diseases caused by a parasite of the genus Leishmania. This disease manifests as the visceral or the cutaneous forms and the treatment of both types is based on chemotherapies with antimony drugs. The application of these drugs, however, presents drawbacks like several side effects and dissemination of parasites resistant to this conventional treatment. Thus, there is a growing need to develop new drugs, as well as new modalities of treatment and diagnosis. In this work, novel photosensitizers derived from riboflavin (vitamin B2) with potential application in the treatment of cutaneous leishmaniasis (by photodynamic therapy) were synthesized. Also, novel Ru (II) complexes with potential usage as luminescent sensors of antimony were synthesized. The riboflavin derivatives were obtained by using vitamin B2 as the starting material, and the chemical transformations were based on acylation of the hydroxyl groups from the ribityl side chain and alkylation of nitrogen 3 of the isoalloxazine ring system.These structural modifications yielded a library of photosensitizers containing hydrophilic, hydrophobic, amphiphilic or ionic moieties, which provide molecules for a study of the structure-activity relationship. By optimizing these synthetic routes, two novel cationic riboflavin derivatives were obtained in good yield (up to 68%). It has been shown that the chemical modifications performed have not significantly affected the photophysical properties of the riboflavin derivatives. All compounds are fluorescent and able to photosensitize singlet oxygen in yields similar to riboflavin itself (Φ&#916 ≈ 0,5). On the other hand, these structural modifications varied the physic-chemical properties related to solubility and partition coefficient of the derivatives. The obtained derivatives were tested against promastigotes of Leishmania major using blue LED (470 nm). The photosensitizers displayed low dark toxicity (EC50 (Effective Concentration 50%) > 100 µM for all the studied compounds) and all derivatives showed greater phototoxicity (EC50 up to 5µM) when compared to riboflavin (EC50 = 50µM). It was observed that the phototoxicity of the riboflavin derivatives is strongly associated with the lipophilicity of photosensitizer. A Ru (II) complex that responds in the presence of antimony was prepared from Ru(bpz)2Cl2 and a phenanthroline ligand containing a bithiophene group (bithiophen-imidazo-phen). This complex can be potentially applied in the construction of luminescent sensors of antimony. It has been demonstrated that the novel complex [Ru(bpz)2(bitiofeno-imidazo-fen)2+] displays low red luminescence due to the self-quenching promoted by the bithiophen moiety. However, preliminary studies have evidenced that, upon addition of SbCl3 or antimony tartrate to the media, the emission intensifies in the red region of the spectrum. Due to the formation of the chelate Sb-bithiophene, the elf-quenching of the electronic excited species occurs less efficiently.

Glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais comum e agressivo de tumor cerebral em adultos. O tempo de vida do paciente diagnosticado com GBM é, em média, 14 meses, apesar dos tratamentos convencionais, como a radioterapia, neurocirurgia e quimioterapia. A terapia fotodinâmica (TFD), juntamente com a nanotecnologia, são tratamentos alternativos e promissores para o combate do câncer do sistema nervoso central. Sendo assim, foi desenvolvido e avaliado nanopartículas de soro albumina humano (PAM), para veiculação controlada de fotoativos (AlClPc e curcumina) aplicáveis no tratamento fotodinâmico do câncer do sistema nervoso central. As nanopartículas de albumina foram preparadas por dois métodos distintos (crosslinking químico e térmico), e para avaliar qual formulação apresentou as características desejáveis foram feitas caracterizações físico-químicas como tamanho médio de partícula, índice de polidispersividade, potencial zeta e taxa de associação dos fármacos fotossensibilizadores incorporados. A formulação preparada pelo crosslinking químico (PAMQ) exibiu características físico-quimicas satisfatórias para os estudos in vitro, obtendo tamanho médio de partículas de 250 nm, distribuição homogênea (PDI < 0,3), potencial zeta negativo (-25 mV), e quantidades de ativos incorporados na nanopartícula de albumina foi de aproximadamente 20% para a AlClPc e 40% para a curcumina. A análise morfológica foi realizada através de microscopia de força atômica (MFA), pela qual se observou o formato esférico, e composição heterogênea das nanopartículas. A formulação apresentou estabilidade com previsão de shelf life de aproximadamente 9 meses. A PAMQ apresentou ainda biocompatibilidade in vitro, na ausência de ativação fotodinâmica, frente à linhagem celular de gliobastoma humano, pelos ensaios de MTT (atividade mitocondrial in vitro). Sob irradiação de luz visível em uma dose máxima de 700 mJ.cm-2, o efeito fototóxico provocado pela PAMQAlClPc (3 ?M) reduziu a viabilidade celular a 22%, enquanto que sob irradiação de luz visível em uma dose máxima de 2000 mJ.cm-2, o efeito fototóxico provocado pela ii PAMQCurcumina (10 ?M) reduziu a viabilidade celular a 59%. Para potencializar o fotodano da célula de glioblastoma humano com a formulação PAMQAlClPc+Curcumina foi feito ensaio em diferentes tempos de irradiação, sendo que no intervalo de 6 horas, a morte celular foi de 77%, provocando um efeito fototóxico desejável para o tratamento fotodinâmico. Portanto, os resultados obtidos neste trabalho indicam que as nanopartículas protéicas apresentam grande potencial para veiculação de fármacos fotossensibilizadores para aplicação da TFD com o propósito do tratamento de câncer do sistema nervoso, incentivando estudos posteriores baseados em ensaios fotobiológicos in vitro e in vivo. / Glioblastoma multiform (GBM) is the most common and aggressive type of brain tumor in adults. The lifetime of the patient diagnosed with GBM is on average 14 months, despite conventional treatments, such as radiotherapy, neurosurgery, and chemotherapy. Photodynamic therapy (PDT) with nanotechnology is an innovative and promising alternative treatment to combat central nervous system cancer. So, this work proposed to develop albumin nanoparticles (PAM) associated with photosensitizers chloro-aluminiumphtalocyanine (AlClPc) and curcumin for PDT application. Albumin nanoparticles were prepared by two different methods (chemical and thermal crosslinking), to evaluate which formulation showed desirable characteristics were performed physicochemical characterizations as mean size, polydispersity index, zeta potential and association rate of photosensitizing drugs incorporated. The formulation prepared by chemical crosslinking (PAMQ) exhibited satisfactory physicochemical characteristics for in vitro studies, obtaining an average diameter of 250 nm, low distribution (around 0,3), negative zeta potential (about -25 mV) and an active uptake rate around 20% for AlClPc and 40% for curcumin. Morphological analysis was performed using atomic force microscopy (AFM), in which was observed the spherical shape and heterogenic composition of nanoparticles. The formulation shows stability with estimated shelf-life of approximately 9 months. The PAM also demonstrated biocompatibility in the absence of photodynamic activation, using cell lines of human glioblastoma by MTT assays. Under irradiation of visible light at a maximum dose of 700 mJ cm-2, induce phototoxic by PAMQAlClPc (at 3 ?M) reduced cell viability to 22%. while under visible light of 418 nm nm the maximum dose of 2000 mJ cm-2, showed phototoxic effect caused by PAMQCurcumina (at 10 ?M) reduced cell viability to 59%. To potentialize photodamage in human glioblastoma cell with PAMQAlClPc+Curcumin was testing at different times of irradiation, wherein in the range of 6 hours, cell death was 77%, causing a desired phototoxic effect for the photodynamic treatment. Therefore, the results obtained in this study indicate that iv albumin nanoparticles have great potential to photosensitizing drugs for application of PDT for the purpose of treatment of cancer of the nervous system, encouraging further studies based in the in vitro and in vivo photobiologicals assays.

Glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais comum e agressivo de tumor cerebral em adultos. O tempo de vida do paciente diagnosticado com GBM é, em média, 14 meses, apesar dos tratamentos convencionais, como a radioterapia, neurocirurgia e quimioterapia. A terapia fotodinâmica (TFD), juntamente com a nanotecnologia, são tratamentos alternativos e promissores para o combate do câncer do sistema nervoso central. Sendo assim, foi desenvolvido e avaliado nanopartículas de soro albumina humano (PAM), para veiculação controlada de fotoativos (AlClPc e curcumina) aplicáveis no tratamento fotodinâmico do câncer do sistema nervoso central. As nanopartículas de albumina foram preparadas por dois métodos distintos (crosslinking químico e térmico), e para avaliar qual formulação apresentou as características desejáveis foram feitas caracterizações físico-químicas como tamanho médio de partícula, índice de polidispersividade, potencial zeta e taxa de associação dos fármacos fotossensibilizadores incorporados. A formulação preparada pelo crosslinking químico (PAMQ) exibiu características físico-quimicas satisfatórias para os estudos in vitro, obtendo tamanho médio de partículas de 250 nm, distribuição homogênea (PDI < 0,3), potencial zeta negativo (-25 mV), e quantidades de ativos incorporados na nanopartícula de albumina foi de aproximadamente 20% para a AlClPc e 40% para a curcumina. A análise morfológica foi realizada através de microscopia de força atômica (MFA), pela qual se observou o formato esférico, e composição heterogênea das nanopartículas. A formulação apresentou estabilidade com previsão de shelf life de aproximadamente 9 meses. A PAMQ apresentou ainda biocompatibilidade in vitro, na ausência de ativação fotodinâmica, frente à linhagem celular de gliobastoma humano, pelos ensaios de MTT (atividade mitocondrial in vitro). Sob irradiação de luz visível em uma dose máxima de 700 mJ.cm-2, o efeito fototóxico provocado pela PAMQAlClPc (3 ?M) reduziu a viabilidade celular a 22%, enquanto que sob irradiação de luz visível em uma dose máxima de 2000 mJ.cm-2, o efeito fototóxico provocado pela ii PAMQCurcumina (10 ?M) reduziu a viabilidade celular a 59%. Para potencializar o fotodano da célula de glioblastoma humano com a formulação PAMQAlClPc+Curcumina foi feito ensaio em diferentes tempos de irradiação, sendo que no intervalo de 6 horas, a morte celular foi de 77%, provocando um efeito fototóxico desejável para o tratamento fotodinâmico. Portanto, os resultados obtidos neste trabalho indicam que as nanopartículas protéicas apresentam grande potencial para veiculação de fármacos fotossensibilizadores para aplicação da TFD com o propósito do tratamento de câncer do sistema nervoso, incentivando estudos posteriores baseados em ensaios fotobiológicos in vitro e in vivo. / Glioblastoma multiform (GBM) is the most common and aggressive type of brain tumor in adults. The lifetime of the patient diagnosed with GBM is on average 14 months, despite conventional treatments, such as radiotherapy, neurosurgery, and chemotherapy. Photodynamic therapy (PDT) with nanotechnology is an innovative and promising alternative treatment to combat central nervous system cancer. So, this work proposed to develop albumin nanoparticles (PAM) associated with photosensitizers chloro-aluminiumphtalocyanine (AlClPc) and curcumin for PDT application. Albumin nanoparticles were prepared by two different methods (chemical and thermal crosslinking), to evaluate which formulation showed desirable characteristics were performed physicochemical characterizations as mean size, polydispersity index, zeta potential and association rate of photosensitizing drugs incorporated. The formulation prepared by chemical crosslinking (PAMQ) exhibited satisfactory physicochemical characteristics for in vitro studies, obtaining an average diameter of 250 nm, low distribution (around 0,3), negative zeta potential (about -25 mV) and an active uptake rate around 20% for AlClPc and 40% for curcumin. Morphological analysis was performed using atomic force microscopy (AFM), in which was observed the spherical shape and heterogenic composition of nanoparticles. The formulation shows stability with estimated shelf-life of approximately 9 months. The PAM also demonstrated biocompatibility in the absence of photodynamic activation, using cell lines of human glioblastoma by MTT assays. Under irradiation of visible light at a maximum dose of 700 mJ cm-2, induce phototoxic by PAMQAlClPc (at 3 ?M) reduced cell viability to 22%. while under visible light of 418 nm nm the maximum dose of 2000 mJ cm-2, showed phototoxic effect caused by PAMQCurcumina (at 10 ?M) reduced cell viability to 59%. To potentialize photodamage in human glioblastoma cell with PAMQAlClPc+Curcumin was testing at different times of irradiation, wherein in the range of 6 hours, cell death was 77%, causing a desired phototoxic effect for the photodynamic treatment. Therefore, the results obtained in this study indicate that iv albumin nanoparticles have great potential to photosensitizing drugs for application of PDT for the purpose of treatment of cancer of the nervous system, encouraging further studies based in the in vitro and in vivo photobiologicals assays.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento de câncer relativamente nova e promissora. Baseia-se na utilização de uma substância fotossensibilizante e luz para provocar um dano seletivo ao tecido alvo, sendo que a seletividade ao órgão/tecido deve ser reconhecida como uma das vantagens no tratamento do câncer. Atualmente, o desenvolvimento de sistemas de liberação e promotores de absorção visando a otimização da liberação tópica de fotossensibilizadores, apresenta-se como um promissor e inexplorado campo de pesquisa na TFD do câncer de pele. Sistemas de liberação compostos por monoleína, um lipídeo polar biocompatível, e água são capazes de aumentar a permeação de fármacos na pele, além de serem capazes de controlar a liberação dos mesmos. No presente estudo foram desenvolvidas e caracterizadas nanodispersões de cristais líquidos como sistemas de liberação para os fotossensibilizadores Protoporfirina IX (PpIX) e Ftalocianinas de Zinco (ZnPc) e Cloro Alumínio (ClAlPc), objetivando otimizar a penetração cutânea destes na epiderme. As nanodispersões foram avaliadas em relação a sua eficiência de encapsulação, estabilidade física e química dos fotosensibilizadores veiculados, bem como a permeação e retenção cutânea in vitro e in vivo por microscopia de fluorescência. Estudos de pré-tratamento foram realizados, objetivando-se verificar o efeito promotor de absorção cutânea das nanodispersões desenvolvidas. Os experimentos de eficiência de encapsulação e estabilidade mostraram que as nanodispersões são um sistema de liberação adequado a aplicação tópica de fotosensibilizadores. Os experimentos in vitro mostraram que as nanodispersões aumentaram a penetração cutânea da PpIX e ClAlPc no estrato córneo em, respectivamente, 3,4 e 11,7 vezes, quando comparadas a formulação controle. Na epiderme mais derme sem estrato córneo, os aumentos promovidos pelas nanodispersões foram de 6,5 e 9,7 vezes para a PpIX e ClAlPc. No experimento in vivo as nanodispersões aumentaram a penetração cutânea da PpIX e ClAlPc no estrato córneo em, respectivamente, 13,7 e 7,0 vezes, quando comparadas ao controle, sendo que na epiderme mais derme sem estrato córneo somente as nanodispersões foram capazes de promover a penetração cutânea destes fotossensibilizadores nestas camadas da pele. A visualização da penetração cutânea dos fotosensibilizadores por microscopia de florescência confirmou os resultados obtidos nos experimentos in vivo de que as nanodispersões foram superiores ao controle em aumentar a penetração cutânea da PpIX e ClAlPc em camadas mais profundas da pele. Os resultados obtidos mostraram que as nanodispersões desenvolvidas são sistemas de liberação promissores para a PpIX e ClAlPc no tratamento do câncer de pele na TFD uma vez que aumentaram in vitro e in vivo a penetração cutânea destes na epiderme. / Photodynamic therapy (PDT) is a relatively new and promising cancer treatment modality that involves the administration of a photosensitizing drug and its subsequent activation by light to produce activated oxygen species that selectively destroy target cells. Recently, PDT to treat skin cancer is focused on the development of drug delivery systems and penetration enhancers that aim to optimize the topical release of photosensitizers. Drug delivery systems based on monoolein, a biocompatible polar lipid, and water are able to enhance the cutaneous penetration of drugs and control their release. Liquid crystal nanodispersions were developed and characterized in this project as delivery systems for the photosensitizers Protoporphyrin IX (PpIX) and Zinc and Chloroaluminum phthalocyanines (ZnPc and ClAlPc), aiming to increase their topical penetration in the epidermis. The physical stability of the nanodispersions, their encapsulation efficiency and the chemical stability of the photosensitizers incorporated were tested. In vitro and in vivo skin penetration tests were performed to verify the efficacy of the nanodispersions in enhancing the topical delivery of the photosensitizers. In vitro pre-treatment tests were conducted to determine if the nanodispersions are able to increase the skin penetration of the photosensitizers by a penetration enhancing effect. Stability and encapsulation efficiency tests showed that nanodispersions are an adequate topical delivery system for photosensitizers. In vitro experiments showed increased PpIX and ClAlPc penetration in the stratum corneum, respectively, of 6.5- and 9.7-fold for the nanodispersions compared to the control. In the epidermis with dermis, without stratum corneum, the increase promoted by the nanodispersions for PpIX and ClAlPc were, respectively, of 6.5- and 9.7-fold. Experimental retention in vivo confirmed that when the nanodispersions were used as carrier, PpIX and ClAlPc concentrations in the stratum corneum were about 13.7- and 7.0-fold higher, respectively, than control. In the epidermis with dermis, without stratum corneum, only the nanodispersions were able to promote the skin penetration of these photosensitizers. Visualization of PpIX and ClAlPc skin penetration by fluorescence microscopy confirmed that the nanodispersions increased the skin penetration of these photosensitizers in deeper skin layers. The results showed that the nanodispersions are promising topical delivery systems in the PDT of skin cancer once they increased in vitro and in vivo the topical penetration of PpIX and ClAlPc in the epidermis.

Neste trabalho foi investigada a ação fotodinâmica dos pró-fármacos 5-ALA e 8-ALA incorporados em nanopartículas de quitosana, através da incidência de luz em células de melanoma, utilizando sinergicamente a Eletroquimioterapia e a Terapia Fotodinâmica. O ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) e seus ésteres derivados são precursores metabólicos da protoporfirina IX (PpIX) e apresentam uma penetração limitada no estrato córneo. Portanto, o objetivo desse trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar o efeito fotodinâmico das nanopartículas de quitosana contendo os pró-fármacos 5-ALA e seu éster derivado 8-ALA e investigar a produção efetiva de PpIX. Concomitantemente, o efeito sinérgico da Eletroquimioterapia (ECT) com a TFD também foi estudado com a finalidade de aumentar a permeação dos fármacos fotossensibilizantes através da pele, aumentando a eficiência da TFD no tratamento de neoplasias cutâneas. As nanopartículas de quitosana foram obtidas pelo método de gelificação ionotrópica, produzindo nanopartículas em tamanho nanométrico (636,0 nm ± 6,5), com uma distribuição de tamanho homogênea (0,37), além de apresentar um potencial zeta significantemente positivo + 35,3 mV (± 2,21). Seu perfil de liberação e capacidade de incorporação de 80% dos pró-fármacos também foi determinado. Os estudos de citotoxicidade na ausência de luz demonstraram o caráter biocompatível das nanopartículas de quitosana desenvolvidas, assim como a produção significativa de PpIX e foi possível comprovar o excelente efeito fototóxico da formulação desenvolvida. Os estudos de sinergismo da ECT com a TFD comprovaram que a combinação das nanopartículas de quitosana contendo os pró-fármacos, com aplicação de microcorrentes de 400 ?A e dose de luz de 3 J/cm2, nestas condições apresentou uma morte celular significativa. / This study investigated the photodynamic action of the prodrug 5-ALA and 8-ALA into chitosan nanoparticles, through the light incidence in melanoma cells, using synergistically the Electrochemotherapy and Photodynamic Therapy. The 5- aminolevulinic acid (5-ALA) and its ester derivatives are metabolic precursors of protoporphyrin IX (PpIX) and have a limited penetration in the stratum corneum. Therefore, the objective of this study was to develop, characterize and evaluate the photodynamic effect of chitosan nanoparticles containing the prodrug 5-ALA and its ester derivative 8-ALA. Besides, was investigated the effective production of PpIX. Concomitantly, the synergistic effect of Electrochemotherapy (ECT) with PDT was also studied for the purpose of increasing the permeation of drugs through the skin, enhancing the efficiency of the PDT in the treatment of skin cancers. Chitosan nanoparticles were obtained by the ionotropic gelation producing nanoparticles in nanosize (636.0 ± 6.5 nm), with a homogenous size distribution (0.37), and present a significantly positive zeta potential + 35.3 mV (± 2.21). Release profile and ability to incorporate 80% of the prodrug was also determined. The cytotoxicity studies demonstrated in the absence of light the biocompatible nature of chitosan nanoparticles developed, as well as the significant production of PpIX and it was possible to demonstrate the excellent effect of phototoxic formulation developed. The synergism studies of ECT with PDT have shown that the combination of chitosan nanoparticles containing prodrugs, applying microcurrents 400 ?A and light dose of 3 J/cm2 under these conditions showed a significant cell death.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um método de tratamento em que um composto fotossensibilizador (FS) é introduzido no organismo do paciente e, posteriormente, a região de tratamento é irradiada com luz. A combinação de oxigênio, luz e FS produz espécies que geram um efeito curativo. Os FS utilizados atualmente, embora eficazes, apresentam desvantagens. Neste trabalho, foram estudados os corantes ciânicos com dois cromóforos ou biscianinas (BCD) que apresentam características favoráveis na aplicação como FS na TFD. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos da concentração, da composição do ambiente e da própria estrutura de três BCDs, com ângulos entre os seus cromóforos de 180°, 150° e 90°, nas características das suas fototransformações em tampão e na interação com micelas de SDS e DNA. A fototransformação pode causar a perda da fotoatividade do FS e gerar fotoprodutos (FPs) que tanto podem ser tóxicos como fotoativos. Os processos de tratamento na TFD e os de fototransformação são paralelos. Isso permite utilizar o monitoramento do processo de fototransformação para determinar o grau do processo de tratamento em tempo real. Por esse motivo, também foi estudada a fototransformação dos FPs formados durante a irradiação. A análise da fototransformação foi realizada utilizando técnicas espectroscópicas de absorção óptica e de fluorescência estática. Mudanças nos espectros de absorção óptica dos corantes indicaram a formação de agregados. A agregação diminui a velocidade de fototransformação devido ao aumento da probabilidade de dissipação da energia de excitação por processos não radiativos. Não houve formação de agregados na irradiação dos FPs, pois estes possuem menor tendência de agregação em comparação com o próprio corante. Semelhanças nos espectros dos FPs dos três corantes indicaram que eles possuem a mesma estrutura do cromóforo. Na ausência do oxigênio a velocidade de fototransformação diminui. Este fato juntamente com a relação entre os tempos da fotólise e os rendimentos quânticos do estado tripleto dos BCDs sugeriram a participação do oxigênio singleto na fototransformação. Na presença de sistemas biomiméticos em altas concentrações, os corantes estão em suas formas monoméricas. Nestas interações, os corantes também sofreram fototransformação, com velocidades diferentes daquelas em tampão, com formação de fotoprodutos. Na fototransformação dos corantes na presença de micelas de SDS, sugerimos que as moléculas dos corantes ficam mais protegidas do contato do oxigênio. Por outro lado, na interação com o DNA, as moléculas dos corantes ligadas na superfície do DNA se tornam mais suscetíveis ao ataque do oxigênio, fazendo com que a fototransformação seja mais rápida. / Photodynamic therapy (PDT) is a treatment that a photosensitizer compound (PS) is inserted into the patient\'s body and, subsequently, the treatment area is irradiated with light. The combination of oxygen, light and FS produce species that generate a curative effect. The FS currently used, although can be effective, have disadvantages. In this study, the cyanine dyes with two chromophores (BCD) or biscyanines that have favorable characteristics in the application as FS in PDT were studied. The aim of this study was to analyze the effects of concentration, environmental composition and the structure of three BCDs, with angles between chromophores 180, 150 and 90 degrees, in the characteristics of phototransformation of the dyes molecules in phosphate buffer and in the interaction with SDS micelles and DNA. The phototransformation can cause the loss of the FS photoactivity and generate photoproducts (PPs) that are both toxic as photoactive. The treatment processes in PDT and phototransformation are parallel. It allows the use of phototransformation monitoring process to determine the degree of realtime treatment process. For this reason, it was also studied the phototransformation of PPs formed during irradiation. The phototransformation analysis was performed using optical absorption and fluorescence spectroscopies. Changes in the optical absorption spectra of the dyes indicated the formation of aggregates. The aggregation reduces phototransformation rate due to the increased probability of dissipation of the excitation energy by non-radiative processes. There was no aggregate formation on irradiation of PPs because they have less tendency to aggregate compared with the dye. Similarities in the spectra of the three PPs indicated that they have the same structure of the chromophore. In the absence of oxygen phototransformation rate decreases. This fact together with the relationship between photolysis time and the quantum yields of the triplet state of the BCDs suggested the involvement of singlet oxygen in their phototransformation. The dyes were in their monomeric form at high SDS and DNA concentrations. In these interactions, the dyes also were phototransformed, with different rates compared with phosphate buffer, with formation of photoproducts. In the phototransformation of dyes in the presence of SDS micelles, we suggest that the dye molecules were more protected from oxygen contact. On the other hand, in the interaction of dyes and DNA molecules, the dye molecules bound on DNA surface become more available to oxygen attack, and the phototransformation becomes faster.

Um conceito central na dosimetria da terapia fotodinâmica (TFD) é o limiar de dose (Dth do inglês threshold dose). O Dth é definido como a quantidade mínima de luz que deve ser absorvida pelas moléculas de fotossensibilizador (FS) dentro das células malignas a serem tratadas para que ocorra a morte celular por necrose ou apoptose. Os resultados do estudo da captação de FS por células Hep G2 demonstraram que uma população celular de linhagem, cultivada em monocamada, apresenta captação de Photogem (PG) heterogênea, ou seja, algumas células têm maior capacidade de captar moléculas de PG, outras células captam o PG em menor quantidade. A captação heterogênea de PG pode ser a causa para fenômenos de seleção de células mais resistentes à TFD. É razoável supor que as subpopulações celulares de uma mesma massa de células malignas possam apresentar diferentes valores de Dth. Definiu-se uma função de distribuição das doses limiares (g()) como uma função de distribuição gaussiana, e para a sua parametrização desenvolveu-se um método para o cultivo in vitro de culturas tridimensionais (culturas 3D), mais fidedignas ao tecido neoplásico maligno que as culturas tradicionais. Utilizando-se o método de levitação magnética (MLM) e o método de impressão magnética (MIM) para a dosimetria da TFD, foi possível parametrizar a g(Dth), investigar a resistência celular à TFD. O MLM demonstrou ser facilmente manuseável na rotina experimental, e consistente para o teste in vitro de novos FS. Comparando-se as culturas MDA-MB-231e Hep G2, obtidas por MLM por mais de 185 horas de levitação, pode-se concluir que as células Hep G2 formaram uma estrutura celular mais densa e que ofereceu mais resistência ao dano causado pela TFD. É notável como as células Hep G2 retomaram o crescimento, e restabeleceram-se em cultura de modo semelhante ao grupo controle, por meio da reconstrução da matriz extracelular (MEC). Enquanto isso, no caso das células MDA-MB-231, a integridade da cultura não foi restabelecida após a aplicação da TFD, formando uma cultura fragmentada. O dano mais evidente, para ambas as culturas, foi observado nas margens dos tumores, evidenciando que os componentes importantes da reação fotodinâmica, como o fotossensibilizador, a luz e o oxigênio, estavam presentes em maiores quantidades na superfície da cultura, em comparação às outras regiões tumorais. Os resultados obtidos demonstram que para o Photogem (PG) é necessária uma fluência de luz da ordem de 40 J.cm-2, para que o efeito fotodinâmico promova morte celular nas culturas 3D obtidas pelo MLM. O resultado da combinação de dois tipos celulares, o maligno (MDA-MB-231) e o sadio (HPF), demonstrou que o efeito fotodinâmico é efetivo quando se tem controle adequado da entrega dos agentes da terapia, independentemente do tipo celular. Algumas células sobreviveram ao tratamento, e existe um forte indicativo de que a presença de fibroblastos HPF esteja relacionada a esta pequena parcela de células que receberam dose de luz inferior ao seu Dth. Os resultados demonstraram que quanto maior a fluência de luz, menor é o IC50 do PG. Para a fluência de luz de 60 J.cm-1 obteve-se um IC50 de 3,1 &mu;g.mL-1, e para a fluência de luz de 30 J.cm-1 obteve-se um IC50 de 18,0 &mu;g.mL-1. / Photodynamic therapy (PDT) dosimetry includes a central concept: the threshold dose (Dth), which is the minimum amount of light to be absorbed by the photosensitizer (PS) molecules to induce irreversible oxidative damage, and hence to cause cell death by necrosis or apoptosis. It is reasonable to assume that cells subpopulation in one individual tumor cell mass may present different Dth values, which implies the existence of a distribution of Dth values defined by a Gauss distribution function (g(Dth)). Developing methods for more realistic tissue emulation with in vitro cultures, such as three-dimensional (3D) cultures, have been encouraged aiming to avoid the above-mentioned dissimilarities. A 3D cell culture is preferable compared to monolayer cell cultures, because it provides cell-cell and cell-substrate interaction, and makes evaluating a culture and its volumetric dimension (which resembles the tumor morphology) possible. This study also includes the development of a 3D model, using the magnetic levitation method (MLM) and the magnetic printing method (MIM, from Portuguese método de impressão magnetic) for PDT dosimetry. The aim is to define parameters for g(Dth), to investigate cell resistance to PDT, and to achieve a fast and consistent method for new PS in vitro tests. By comparing cultures from the different cell types studied, the ones obtained by MLM for more than 185 hours were found to present a denser cellular structure, which provided improved resistance to PDT-induced damage. Hep G2 cells showed a remarkable behavior by being able to recover culture integrity; meanwhile MDA-MB-231 cells were not able to do so. The most evident damage, for both cell culture types, was observed on tumor margins, showing that the main elements to play a role in PDT reaction (PS, light and oxygen) were present in larger quantities, at culture surface, when compared with internal regions of the cell culture. Results obtained for PG show that a light fluence of about 40 J.cm-2 is required to induce cell death by photodynamic effect on 3D cells obtained by MLM. A combination of two different cell types - a tumor cell line and a healthy cell line - shows clearly that there is no difference for the photodynamic outcome if one holds enough control on the therapeutic parameters. The results presented in this thesis show that even a strain cell population, grown in a monolayer cell culture, results in a non-homogeneous PG uptake, which means that part of the cells seems to be able to collect PG molecules more efficiently than other cells. This difference in collection among cells may be the cause of a selection of cells that are more \"resistant\" to PDT. There were cells that survived treatment, and the presence of HPF fibroblasts might be the cause of these surviving cells, since their Dth might have not been achieved. The results showed that as higher is the light fluence, as lower is the IC50 of PG. The fluence of 60 and 30 J.cm-1 resulted in IC50 of 3.1 and 18.0 &mu;g.mL-1, respectively.

O ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) é empregado como pró-fármaco, precursor de um agente fotossensibilizador na terapia fotodinâmica (TFD). Após a aplicação de 5-ALA topicamente, a incidência de luz visível de comprimento de onda apropriado induz a formação de uma substância altamente fluorescente e fotodinamicamente ativa, a Protoporfirina IX (PpIX).Todavia,devido a sua característica hidrofílica o 5-ALA apresenta reduzida penetração na epiderme e derme, limitando sua aplicação tópica. O presente trabalho apresenta o desenvolvimento de sistemas de veiculação nanoestruturados para o 5-ALA, visando maior penetração na pele e aumento da eficácia fotodinâmica. Além do 5-ALA, foram testados outros fármacos hidrofílicos, incluindo um anti-inflamatório, uma vitamina e um anti-microbiano, para validação do sistema de liberação controlada e ação sítio-específica. Foi realizado um estudo de desenvolvimento de formulação e processo para obtenção dos nanocarreadores placebo e posterior incorporação dos fámacos, além da caracterização completa dos sistemas obtidos, resultando no depósito de uma patente dos novos sistemas: Nanocarreadores Poliméricos Coloidais. Como principais resultados deste trabalho destaca-se a obtenção de sistemas em escala nanométrica, com alta eficiência de encapsulação e perfil de liberação controlado, além dos nanocarreadores proporcionarem o aumento da permeação cutânea e ação sítio específica dos fármacos, seja na célula cancerígena ou mesmo na lesão causada por microorganismos. A relevância deste trabalho baseou-se na necessidade de um tratamento prático, altamente seletivo e moderno, que seja otimizado mediante a administração do pró-farmaco 5-ALA em sistemas de liberação apropriados, pois a barreira epidérmica do tecido canceroso constitui ainda uma limitação para a TFD tópica. / The 5-aminolevulinic acid (ALA) is a pro-drug, precursor of a photossensitizer agent employed in the photodynamic therapy (PDT). The topical application of ALA combined with the visible light irradiation in an appropiate wavelenght, promove the yielding of a highly fluorescent and photodynamically active agent, the protophoriryn IX (PpIX). However, due to its hydrophilic propertie 5-ALA has reduced penetration of the epidermis and dermis, limiting its topical application. This work presents the development of a nanostructured drug delivery system for ALA aiming to increase the skin permeation and the photodynamic efficacy. Beyond 5-ALA, other hydrophilic drugs were tested, including an anti-inflammatory, a vitamin and an anti-microbial drug to validate the controlled release and site-specific action. A study was performed to develop the composition and the process of preparation of the unload-nanocarriers and subsequent incorporation of drugs, besides a complete characterization of the nanocarriers, resulting in a patent application of the new systems: Colloidal Polymeric Nanocarriers. As the main results of this study can be highlighted the achievement of nanometer-scale system with high efficiency of encapsulation and controlled release profile, in addition to providing increased permeation and site-specific action of drugs, whether in the cancer cell or even in the lesion caused by microorganisms. The relevancy of this work is based on the necessity of a practical, sophisticated and selective treatment through the administration of the prodrug ALA using a suitable drug delivery system, because the epidermal barrier of the cancerous tissue is still a main limitation for topical PDT.