A imobilização de fotossensibilizadores (FS) em materiais nanométricos tem se mostrado uma excelente alternativa ao seu emprego na forma molecular para terapia fotodinâmica (PDT). O presente trabalho descreve uma série de estratégias sintéticas desenvolvidas para a imobilização de FS em nanoesferas de sílica contendo núcleos magnéticos, bem como o estudo das propriedades foto-químicas, foto-físicas e morfológicas dos nanomateriais obtidos. Os FS utilizados foram o azul de metileno, tionina, azure A, protoporfirina IX, hematoporfirina IX e clorofilina. As metodologias de imobilização empregadas envolveram a adição do FS durante o crescimento da camada de sílica ou a ligação do FS na superfície do nanomaterial já formado. Em alguns casos foi necessário modificar previamente o FS com organossilanos. Os núcleos magnéticos foram preparados por co-precipitação de sais de ferro(II) e ferro(III) em meio básico e o revestimento com sílica foi realizado utilizando-se tetraetilortossilicato em uma microemulsão. Os núcleos magnéticos revestidos com uma camada de sílica mantiveram o comportamento superparamagnético. Para a tionina e o azul de metileno não foi detectada geração de oxigênio singlete após a imobilização. Para o azure A, protoporfirina IX e clorofilina imobilizados, a geração de oxigênio singlete foi detectada e caracterizada por métodos químicos e físicos. O material contendo clorofilina mostrou-se bastante promissor e foi empregado em estudos preliminares com células HeLa, levando à morte celular após irradiação, o que comprova o potencial para PDT. O comportamento do fotossensibilizador imobilizado e a possível proteção extra fornecida pela camada de sílica foram estudados pela supressão de fluorescência com íons brometo e supressão da geração de oxigênio singlete com albumina de soro bovino. Hematoporfirina IX é mais afetada na forma livre do que imobilizada em nanoesferas de sílica, o que indica que o FS imobilizado é capaz de gerar oxigênio singlete e está mais protegido de interferentes. / The immobilization of photosensitizers (PS) in nanometric materials is an excellent alternative to their use in molecular forms for photodynamic therapy (PDT). The present work describes a series of synthetic strategies for the immobilization of PS on silica nanospheres containing magnetic nucleous, as well as the studies of the photochemical, photophysical and morphological properties of the obtained materials. The studied PS were methylene blue, thionin, azure A, protoporphyrin IX, hematoporphyrin IX and chlorophyllin. The immobilization methodologies involve the addition of PS during the growth of the silica shell or the attachment of PS to the material surface. Often, a previous modification of the PS with organosilanes was necessary. The magnetic cores were prepared by co-precipitation of iron(II) and iron(III) salts in basic media and the coating with silica was performed by a microemulsion using TEOS. After coating with silica, the magnetic nanomaterial maintained the superparamagnetic behavior. The generation of singlet oxygen by thionin and methylene blue was not detect after immobilization. The generation of singlet oxygen by immobilized azure A, protoporphyrin IX and chlorophyllin was detected and characterized by chemical and physical methods. The material containing chlorophyllin is promising for PDT and was applied in preliminary studies with HeLa cells, causing cell death after irradiation. The behavior of the immobilized PS and the possible extra protection given by the silica shell were investigated by fluorescence quenching with bromide ions and by suppression of singlet oxygen generation with bovine serum albumin. Hematoporphyrin IX was more affected in the free form than immobilized in silica nanospheres, which indicates that the immobilized FS still generates singlet oxygen and is more protected against interfering species

A cápsula endoscópica é um instrumento revolucionário, que permite a realização de um exame livre de desconfortos para o paciente e possibilitou a técnica de endoscopia chegar a partes do sistema gastrointestinal que antes não era possível, como grande parte do intestino delgado. Este trabalho apresenta um módulo fotônico para realizar Terapia Fotodinâmica (PDT, Photodynamic Therapy) em cápsulas endoscópicas. A PDT é uma forma de tratamento para lesões que envolve a administração prévia de um medicamento fotossensível (PS, Photosensitizer) e posterior ativação com irradiação de luz em um comprimento de onda (λ) específico. Geralmente para a ativação do PS utiliza-se λ na região vermelha do espectro visível, pois a penetração nos tecidos é elevada. Células de adenocarcinoma gástrico humano (AGS, Adenocarcinoma Gastric of Stomach) foram preparadas com ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) que é um Pró-fármaco precursor do agente fotossensível Protoporfirina IX (PpIX) com máximo de absorção nos 635 nm. Para realizar a irradiação com luz vermelha nas células, 16 LEDs do modelo LRQ396-P1Q2-1 da Osram Opto Semiconductors com dimensões muito reduzidas foram selecionados, caracterizados, montados em uma PCB (Printed Circuit Board) e alimentados por um Arduino Mega 2560. Este sistema de iluminação foi eficaz em seu propósito e causou morte celular nas células submetidas ao tratamento com o ALA em uma concentração de 2 milimol por litro e dose de luz em 5 Joules por centímetro quadrado que resulta em uma exposição de 49 minutos. Com o objetivo de se construir um módulo para controle de iluminação em cápsulas endoscópicas, foi desenvolvido em tecnologia CMOS 0.7 μm da ON Semiconductor um dispositivo capaz de controlar a intensidade dos LEDs utilizando PWM (Pulse Width Modulation). Unindo este componente com os LEDs selecionados é perfeitamente possível construir o módulo e inseri-lo CEs para realizar PDT em locais do trato gastrointestinal (GI) não acessíveis pela endoscopia convencional. / The endoscopic capsule is a revolutionary instrument that gives a free examination of discomforts for patient and allows the endoscopic technique to reach parts of the gastrointestinal system that were previously not possible, such as a large part of the small intestine. This work presents a photonic module to perform Photodynamic Therapy (PDT) in endoscopic capsules. PDT is a form of treatment for injuries involving prior administration of a photosensitive drug (PS, Photosensitizer) and subsequent activation with light irradiation at a specific wavelength (λ). Usually for PS activation, λ is used in the red region of the visible spectrum, because the tissue penetration is high. Human gastric adenocarcinoma cells (AGS) were prepared with 5-aminolevulinic Acid (5-ALA) which is a Pro-drug precursor of the photosensitive agent Protoporphyrin IX (PpIX) with maximum absorption at 635 nm. To perform red light irradiation on the cells, 16 LEDs, model LRQ396-P1Q2-1 of the Osram Opto Semiconductors with very small dimensions were selected, characterized, mounted on a PCB (Printed Circuit Board) and powered by an Arduino Mega 2560. This system was effective in its purpose and caused cell death in cells treated with ALA at a concentration of 2 mMol/L and dose of light at 5 J/cm² resulting in a 49 minutes exposure. With the objective of build a module for control of lighting in endoscopic capsules, a device able to controlling the intensity of the LEDs using PWM (Pulse Width Modulation) was developed in CMOS technology 0.7 μm of the ON Semiconductor. Combining this component with the selected LEDs, it is perfectly possible to construct the module and insert in CEs to perform PDT at sites of the gastrointestinal tract (GI) not accessible by conventional endoscopy.

Os benefícios gerados pela luz do sol foram observados desde a origem da humanidade. A terapia fotodinâmica é a mais nova modalidade de tratamento com luz, que envolve a administração do fármaco fotossensível, o qual se deposita preferencialmente nas células que se deseja a ação, seguido por seletiva iluminação da lesão com luz na região do visível. A ftalocianina de cloro-alumínio (AlClPc) e a indocianina verde são apontados como potenciais fármacos nesta terapia, sendo bastante utilizados atualmente. Foram preparados complexos de ciclodextrinas de ftalocianina de cloro-alumínio e hidroxipropil-beta ciclodextrina e beta-ciclodextrina, incorporados em lipossomas com a indocianina verde, com o propósito de avaliar o sinergismo da ação, proporcionado pela associação de sistemas de liberação e de fármacos fotossensíveis, na terapia fotodinâmica. Quando avaliado isoladamente os complexos de ftalocianina e ciclodextrinas demonstraram valores diferentes da constante de associação demonstrando maior complexação com hidroxipropil-beta ciclodextrina. No entanto, os derivados de ciclodextrinas estudados melhoraram as propriedades fotofísicas do fármaco. Na avaliação das propriedades fotobiológicas, nenhuma toxicidade foi observada para a ftalocianina complexada com ciclodextrinas nem com lipossomas. Na avaliação do complexo de ftalocianina de cloro-alumínio/ciclodextrinas na presença de luz, houve um alto índice de morte celular. No caso da associação dos complexos de AlClPc incorporados nos lipossomas juntamente com a ICV as preparações também demonstraram que as modificações geradas pela incorporação dos fármacos fotossensíveis favoreceram as propriedades espectroscópicas necessárias para a ação dos fármacos na PDT, com conseqüente redução da agregação e alterações significativas nas propriedades fotofísicas e fotobiológicas dos fármacos. Os complexos de ciclodextrinas incorporados nos lipossomas com indocianina verde se apresentaram estáveis como sistemas de liberação, após liofilização, garantindo a característica de vesícula unilamelar pequena. Neste trabalho observa-se claramente o sinergísmo garantido por associação dos dois fármacos fotossensíveis e de sistemas de liberação sugerindo uma nova área de pesquisa na terapia fotodinâmica. / The benefits generated by sunlight were observed from the origin of humanity. Photodynamic therapy is the new form treatment of light, which involves the administration of the photosensitizer drug which is targeting preferentially in diseased cells, followed by selective illumination of the lesion with visible light. The aluminum chloride phthalocyanine and indocyanine green are studied as potential drugs this therapy and often used. Were development complex of hydroxypropyl-beta cyclodextrin and beta-cyclodextrin with aluminum chloride phthalocyanine entrapment in liposomes with indocyanine green in order to studed the synergism of action, provided by association of both release and photosensitizer drugs, in photodynamic therapy. Complexes of phthalocyanine with different cyclodextrins derivatives showed different values of the association constant showing greater complexation with hydroxypropyl-beta cyclodextrin.However the derivatives of cyclodextrins studied improved the drug photophysical properties. In evaluating the photobiological properties, no toxicity was observed for phthalocyanines complexed with cyclodextrins or liposomes.Althought the evaluation of phthalocyanine complex excited by light, showed a higher rate of cell death. When the complexes where incorporated in liposomes plus indocyanine green photosensitizer drugs improved the spectroscopic properties necessary for the action of drugs in PDT reduced aggregation and significant improved in the photophysical and photobiological properties of drugs. Complexes of cyclodextrins incorporated in liposomes with indocyanine green showed stable drug delivery systems, after freeze-drying and keeping a small unilamellar vesicle.This work showed that there is clearly synergism by the association two photosensitizers and drug delivery systems and represents a great contribution for a new area of research in photodynamic therapy.

A mastite bovina destaca-se negativamente no cenário mundial em decorrência aos prejuízos ocasionados pelo seu dispendioso tratamento, sendo considerada a principal doença que acomete a pecuária leiteira. Como alternativa ao uso de antibióticos, a terapia fotodinâmica se apresenta como uma opção terapêutica no tratamento de infecções locais, que atua sem que haja seleção de micro-organismos resistentes. Seu mecanismo de ação resulta da interação entre uma substância fotossensibilizadora e luz em comprimento de onda ressonante, promovendo a formação de espécies reativas de oxigênio que apresentam ação citotóxica contra micro-organismos. O objetivo deste estudo foi investigar a habilidade da terapia fotodinâmica, in vitro, para inativar cepas causadoras da mastite bovina. Culturas de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Corynebacterium bovis e Prototheca zopfii suspensas em PBS foram estimadas por meio da turbidez da suspensão correspondendo à concentração de 107 UFC/mL, caracterizando desta forma, oito grupos avaliados: controle (C), luz LED vermelho (L) =660nm/2 minutos de irradiação (12,22J/cm2), AM (azul de metileno - 1mM), PDT 5 segundos (0,50J/cm2), PDT 10 segundos (1,01J/cm2), PDT 30 segundos (3,05J/cm2), PDT 1 minuto (6,11J/cm2) e PDT 2 minutos (12,22J/cm2) de irradiação. Os grupos tratados com AM e Luz isoladamente não apresentaram ação citotóxica sobre os micro-organismos avaliados. S. dysgalactiae, S. aureus, C. bovis foram inativados sob 30 segundos de irradiação (3,05J/cm2); S. agalactiae e P. zopfii foram inativados sob 2 minutos de irradiação (12,22J/cm2). / Bovine mastitis stands out negatively on the world scenario due to the damage caused by its expensive treatment, being considered the main disease affecting dairy cattle. As an alternative to antibiotics, photodynamic therapy is presented as a therapeutic option in the treatment of local infections, which acts without any selection of resistant microorganisms. Its mechanism of action results from the interaction between a photosensitizing substance and light in the resonant wavelength, promoting the formation of reactive oxygen species, which have cytotoxic activity against micro -organisms. The aim of this study was to investigate, in vitro, the ability of photodynamic therapy to inactivate strains that cause bovine mastitis. Cultures of Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Corynebacterium bovis and Prototheca zopfii suspended in PBS were estimated by the turbidity of the suspension corresponding to a concentration of 107 CFU / mL, characterizing eight study groups: control (C), light - red LED (L) = 660nm / 2 minutes of irradiation (12.22J/cm2), BM (methylene blue - 1 mM ), PDT 5 seconds (0.50 J/cm2 ), PDT 10 seconds (1.01J/cm2), PDT 30 seconds (3.05 J/cm2 ), PDT 1 minute (6.11 J/cm2) and PDT 2 minutes (12.22 J/cm2) of irradiation. The groups treated with methylene blue and light alone had no cytotoxic effect on microorganisms evaluated. S. dysgalactiae, S. aureus, C. bovis were inactivated after 30 seconds of irradiation (3.05 J/cm2 ); S. agalactiae and P. zopfii were inactivated after 2 minutes of irradiation (12.22 J/cm2).

A peri-implantite acomete um número crescente de indivíduos e os protocolos de tratamento objetivam descontaminar as superfícies dos implantes e torná-las novamente osseointegráveis. Porém, ainda não foi estabelecido um padrão ouro de tratamento para peri-implantite. Este estudo testa o poder de descontaminação do laser em baixa intensidade (LBI), da terapia fotodinâmica (PDT) e do azul de toluidina O (TBO). Sobre discos de titânio de 1,5 mm de espessura e 4,0 mm de diâmetro de superfícies lisas ou rugosas foi permitida a deposição natural de biofilme microbiano por 7 dias após os quais os discos foram divididos em grupos experimentais (15 discos por grupo), de acordo com o método de descontaminação: grupo LBI (laser de InGaAlP de 660 nm, 30 mW, 45 J/cm2 no modo continuo por 30 s); grupo PDT; grupo TBO (aplicação de TBO por 60 s); grupo controle positivo (C) sem tratamento e grupo controle negativo (NC) estéril. Os discos foram implantados em tecido conjuntivo subcutâneo de ratos e, após 7, 28 e 84 dias, foram obtidas 5 biópsias de cada grupo para análise em microscopia óptica. Implantes lisos e rugosos não diferiram com relação ao grau de fibrosamento e severidade do infiltrado inflamatório, mas a área do tecido reacional perimaterial foi maior nos rugosos (2,6 ± 3,7 x 106 µm2) do que nos lisos (1,9 ± 2,6 x 106 µm2). O grupo C foi o que apresentou menor grau de fibrosamento do tecido reacional (1), mas somente houve diferença estatisticamente significante (p = 0,0230) entre os grupos C e NC. A severidade do infiltrado inflamatório somente diferiu significantemente entre os grupos aos 7 dias, quando o grupo NC apresentou o menor escore (2) em comparação aos demais grupos (3). Com relação à área do tecido reacional perimaterial, só houve diferenças entre os grupos aos 7 dias, quando o grupo C apresentou maior área que os demais grupos (9,11 ± 2,10 x 106 µm2), porém, sem diferença estatisticamente significante em comparação aos grupos LBI e TBO. A área apresentada pelo grupo PDT (4,34 ± 1,49 x 106 µm2) só foi inferior ao grupo NC (0,65 ± 0,23 x 106 µm2). A espessura do tecido reacional não confirmou a diferença entre os discos de superfície lisa e os de superfície rugosa (p = 0,2801), mas confirmou todas as demais comparações relativas à área, sendo que o grupo NC apresentou menor espessura que os demais somente aos 7 dias. O grupo NC apresentou menor espessura de tecido reacional do que os demais grupos, mas essa diferença foi estatisticamente significante somente aos 7 dias. Os demais grupos não diferiram entre si quanto a esse parâmetro. Concluiu-se que implantes rugosos ou lisos contaminados por biofilme microbiano e tratados com LBI, PDT e TBO não diferem entre si quanto aos parâmetros inflamatórios teciduais, parecendo haver leve superioridade da PDT sobre os demais tratamentos apenas no período mais precoce de observação. Porém, com o passar do tempo, todos os tratamentos se equiparam a implantes estéreis quanto à reação tecidual perimaterial. / The peri-implantitis is a disease that is increasing in a number of individuals and the protocols of treatment has intended to decontaminate the implant surfaces and makes this biocompatible again. However, until this moment, a gold standard for peri-implantitis treatment was not established. The present study tests the power of decontamination of low intensity laser (LBI), photodynamic therapy (PDT) and toluidine blue O (TBO). The natural deposition of microbian biofilm was allowed on titanium discs with 1,5 mm of thickness and 4,0 mm of diameter and smooth and grooved surfaces during 7 days when the discs were separated in experimental groups (15 discs each group), in accordance with the decontamination method: LBI group (decontamination with InGaAlP laser, 660 nm, 30 mW, 45 J/cm2 in continuous way during 30 s); PDT group; TBO group (application of TBO during 60 s); controlled positive group (C) without any kind of treatment and controlled negative group (NC), sterile. The discs had been implanted in rats subcutaneous connective tissue and, after 7, 28 and 84 days, had been gotten 5 biopsies from each group for histology processing. Smooth and grooved implants did not differ on fibrosis grade and severity of the inflammatory infiltrate, however the perimaterial reaction tissue area was bigger on grooved implants (2,6 ± 3,7 x 106 µm2) that on smooth implants (1,9 ± 2,6 x 106 µm2). The C group was the one that showed the smallest reaction tissue fibrosis grade (1), but only was significant statistical difference (p = 0,0230) between C and NC groups. The severity of inflammatory infiltrate only significant differed between the groups on 7 days, when the NC group showed the smallest score (2) in comparison to the others groups (3). In relation to the perimaterial reaction tissue area, only were differences between the groups on 7 days, when C group showed bigger area than the others (9,11 ± 2,10 x 106 µm2), nevertheless, without significant statistical difference in Comparison to LBI and TBO groups. The area presented by PDT group (4,34 ± 1,49 x 106 µm2) only was inferior to NC group (0,65 ± 0,23 x 106 µm2). The reaction tissue thickness did not confirmed the difference between smooth and grooved surfaces discs (p = 0,2801), however it confirmed all the comparisons related to the area parameter, where NC group showed smaller thickness than the others only on 7 days. NC group showed smaller thickness than the others, but this difference was statistical significant only on 7 days. The other groups did not differ among them in this parameter. It was concluded that grooved and smooth implants contaminated by a microbian biofilm ant treated with LBI, PDT and TBO did not differed among them in relation to tissue inflammatory parameters, seems that is a light superiority of PDT in relation to the others only in the earliest period of observation. Nevertheless, with the time, all the treatments were equally to sterile implants in relation to perimaterial reaction tissue.

A acne é a mais comum doença de pele encontrada pelos dermatologistas, representando cerca de 30% das consultas, onde esta é considerada crônica, pois apresenta alto grau de recidiva podendo acometer 50% da população na vida adulta. Diversos estudos evidenciam bons resultados para tratamento da acne através de fototerapias, entretanto, alguns trabalhos enfatizam que esta modalidade terapêutica é ainda recente e que estudos adicionais e mais detalhados devam ser realizados. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho é o estudo da viabilidade de um protótipo integrado para o diagnóstico e tratamento da acne por técnicas ópticas, visando o desenvolvimento de um equipamento para diagnóstico por imagens de fluorescência e um sistema de tratamento por fototerapia para a eliminação das bactérias causadoras da acne, assim, propondo novas soluções para o diagnóstico e tratamento da acne. Para isso foi realizado o desenvolvimento do protótipo-v1 que é constituído pelo sistema de diagnóstico por imagens de fluorescência composto por 01 LED violeta em 405 nm para excitação das amostras (80 mW/cm2), um sistema de filtros e lentes para formação das imagens de fluorescência e uma câmera para a captura das imagens. O sistema de tratamento é composto por 01 LED UV em 405 nm que proporciona uma intensidade de irradiação de 150 mW/cm2 com um diâmetro de 40 mm. Para validação do protótipo-v1 foram realizados seis experimentos distintos, sendo: 1 – Avaliou-se as configurações iniciais do protótipo eram adequadas para a visualização de bactérias presentes no rosto, foram adquiridas imagens de fluorescência na região do nariz; 2 – Avaliou-se a detecção de bactérias presentes em quatro diferentes regiões da face; 3 – Avaliou-se somente com uma lavagem simples é possível fazer a remoção e eliminação das bactérias presentes no rosto; 4 – Avaliou-se a detecção da presença de bactérias no couro cabeludo que são possíveis causadoras de caspa e se ocorre uma maior formação de bactérias no couro cabeludo ao longo do tempo. 5 – Avaliou-se in vivo, em um voluntário, o sistema de diagnóstico e tratamento da acne do protótipo-v1; 6 – Avaliou-se in vitro e in vivo, 40 voluntários, o sistema de diagnóstico e tratamento da acne do protótipo-v1. Como resultado foi possível realizar a detecção da bactéria P. acnes e fazer uma análise de sua presença, formação e declínio em seis experimentos, através de processamento de imagens e análises comparativas. Sendo que no experimento 1 a 4 avaliou-se a qualidade e as configurações do equipamento de diagnóstico por fluorescência e os experimento 5 e 6 avaliaram tanto o sistema de diagnóstico como o sistema de tratamento. Assim, através destes experimentos realizados foi possível demostrar uma viabilidade da utilização do protótipo-v1 como sistema de diagnóstico e tratamento da acne, demonstrando que é possível se realizar o monitoramento das bactérias causadoras da acne através das imagens de fluorescência e o tratamento da acne utilizando técnicas ópticas. / Acne is the most common skin disease found by dermatologists, representing about 30% of the consultations, where it is considered chronic, because has a high degree of recurrence and can affect 50% of the population in adult life. Several studies have shown good results for treatment of acne via phototherapy, however, some studies emphasize that this type of treatment is still new and additional and more detailed studies should be conducted.In this context, the aim of this work is the viability study of an integrated prototype for acne diagnosis and treatment by optical techniques, aiming at the development of a system for diagnosis by fluorescence imaging and phototherapy for treatment and elimination of bacteria that cause the acne, therefore offering new solutions for the acne diagnosis and treatment. For this, the prototype v1 was developed, which is constituted for diagnostic system by fluorescence image composed of one violet LED at 405 nm for excitation of the samples (80 mW / cm2), a system of filters and lenses for the formation images of fluorescence and a CCD camera to capture the images. The treatment system is composed of one violet LED at 405 nm which provides an irradiation intensity of 150 mW/cm2 with a diameter of 40 mm. For validation of prototype v1 were conducted six different experiments, as follows: 1 - Were evaluated initial prototype settings for the visualization of bacteria in the face for that, were acquired fluorescence images in the nose; 2 - Were evaluated detection of bacteria in four different regions of the face; 3 - Was evaluated only with simple washing can make removal and elimination of bacteria from the face; 4 - Was evaluated detecting the presence of bacteria on the scalp which are possible cause of dandruff and there is a greater formation of bacteria in the scalp along of the time; 5 - Was evaluated in vivo, in a voluntary, the prototype of the system of diagnosis and treatment of acne; 6 - Was evaluated in vitro and in vivo, 40 volunteers, the prototype of the system of diagnosis and treatment of acne. As a result, was possible to detect the P. acnes bacteria and do an analysis of their presence, formation and decline in six experiments, through image processing and comparative analysis. Where in experiment 1 to 4 was evaluated the quality and configurations of diagnostic fluorescence prototype and 5 to 6 experiments evaluating both the diagnostic and treatment system. Thus, through these experiments it was possible to demonstrate the viability of using one prototype v1 as diagnostic system and acne treatment, demonstrating that it is possible to perform the monitoring of acne causing bacteria via fluorescence imaging and treatment of acne using optical techniques.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento de câncer que consiste na interação de três componentes: fotossensibilizador (FS), luz para ativar o FS e o oxigênio presente nos tecidos. Os estudos da fototoxicidade e do potencial de agente terapêuticos utilizados no tratamento do câncer, dentre eles os FSs, são realizados utilizando culturas celulares bidimensionais (2D) ou modelos animais. No entanto, os modelos 2D apresentam limitações, como impossibilitar sinais tão importantes que ocorrem in vivo, dentre eles o contato célula-célula e célula-matriz. Além disso, busca-se reduzir cada vez mais o número de animais em pesquisas científicas. Diante dessas limitações, nos últimos 30 anos tem sido desenvolvidos métodos alternativos in vitro que possam mimetizar melhor as complexas estruturas e funcionalidade dos sistemas in vivo. O objetivo desse estudo foi desenvolver um modelo de cultura de células tridimensional (3D) e um modelo de plataforma de cultura microfluídica para avaliar a viabilidade de células de carcinoma humano (HEp-2) após aplicação da terapia fotodinâmica com hipericina. O modelo 3D foi produzido utilizando-se colágeno tipo I aniônico e a plataforma de cultura microfluídica foi produzida utilizando-se lâmina de plástico, que serviu como base para o adesivo biocompatível utilizado para delimitar o canal celular e o poliéster, servindo como uma espécie de tampa para os dois materiais. A caracterização do biomaterial utilizado no modelo 3D foi realizada pela determinação da porosidade e diâmetro dos poros por meio da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e por ensaios de citotoxicidade pelo método de difusão em ágar e pelo método do MTT (ISO 10993-5). Os ensaios de citotoxicidade comprovaram que o biomaterial utilizado é biocompatível e não causa nenhuma citotoxicidade as células. A viabilidade celular da linhagem HEp-2 foi acompanhada no modelo 2D e 3D durante 168 h (sete dias) utilizando o método do MTT e na plataforma microfluídica por 24 h através de microscopia de fluorescência com perfusão contínua de meio de cultura. Em ambos os modelos as células apresentaram-se capazes de se manter aderidas e em multiplicação. Nos ensaios fototóxicos realizados no modelo 3D por meio do método do MTT, observou-se que a viabilidade celular diminui à medida que se aumenta a concentração da hipericina, mantendo-se a dose de luz e o tempo de incubação constantes, sugerindo que as células HEp-2 em cultura 2D apresentaramse mais sensíveis à TFD do que as células em cultura 3D. Os ensaios fototóxicos na plataforma microfluídica mostraram através da análise das imagens de microscopia de fluorescência que o tipo de morte celular preponderante foi a apoptose. Portanto, os resultados apresentados sugerem que é possível a realização de estudos de terapia fotodinâmica no modelo de cultura tridimensional bem como na plataforma microfluídica de cultura de células. / Photodynamic Therapy (PDT) is a cancer treatment modality consisting of the interaction of three components: photosensitizer (PS), light to activate the PS and oxygen present in the tissues. The studies about the toxicity and potential of therapeutic agents used for cancer treatment, among them the PS, are performed using 2D cell cultures or animal models. However, the 2D models have several limitations, such as making it impossible that important signals which occur in vivo, such as cell-cell and cell-matrix contact occur. In addition, it is importatnt to reduce the number of animals in scientific research. Due of the limitations of the twodimensional cell culture models and the need to reduce the use of animals in research, in the last 30 years alternative in vitro methods have been developed which t can better mimic the complex structures and functionality of in vivo systems. Therefore, the objective of this study was to develop a three-dimensional (3D) cell culture model and a microfluidic culture platform model to evaluate the viability of human carcinoma cells (HEp-2) after photodynamic therapy with hypericin. The 3D support was produced using type I collagen and the microfluidic culture platform was produced using a plastic blade which served as the basis for the surgical adhesive, used to delimit the cell canal and the polyester, serving as a sort of cap for both materials. The characterization of the biomaterial used in the 3D model was performed by determination of the porosity and pore diameter by Scanning Electron Microscopy (SEM) and by cytotoxic assays using the agar diffusion method and the MTT method (ISO 10993-5). It was observed that the biomaterial used in the 3D model is biocompatible and does not cause any cytotoxicity to the cells. The cell viability of the HEp-2 cells was monitored in the 2D and 3D models for 168 h (seven days) using the MTT method and in the microfluidic platform for 24 h by fluorescence microscopy with continuous perfusion of culture medium. In both models the cells are able to remain adherent and in multiplication. In the phototoxic assays performed on the microfluidic platform, the analysis of fluorescence microscopy images showed that the preponderant cell death type was apoptosis. Results suggest that is possible to perform photodynamic therapy studies in the three-dimensional culture model as well as in the microfluidic cell culture platform.

Pour améliorer la sélectivité cellulaire tumorale et/ou l'efficacité anti-tumorale de la thérapie photodynamique (PDT), des molécules actives (peptides, pseudopeptides, agent alkylant) ont été conjuguées à la molécule photo-activable. Dans une 1ère partie, l'effet vasculaire de la PDT a été favorisé par le ciblage de la vascularisation tumorale de phénotype angiogénique. Un photosensibilisateur de type chlorine a été couplé à un peptide ligand de neuropiline-1 (NRP-1) et a montré son efficacité anti-tumorale in vitro et in vivo en PDT. Cependant, la partie peptidique s'est avérée instable in vivo. Des pseudopeptides modifiés au niveau du site de clivage du peptide initial ont été synthétisés et testés in vitro, conjugués ou non à la chlorine. L'incorporation cellulaire de la chlorine a été améliorée après son couplage aux pseudopeptides. Une technique d'ARN interférence, visant à éteindre l'expression de NRP-1 dans les cellules MDA-MB-231, surexprimant NRP-1, a mis en évidence l'incorporation cellulaire récepteur-dépendante des conjugués et leur sélectivité cellulaire. Les pseudopeptides et conjugués se sont révélés affins pour NRP-1 et plus stables in vivo. Le ruthénium (Ru) s'affiche comme une molécule d'intérêt thérapeutique en oncologie. Dans une 2ème partie, nous avons appréhendé l'intérêt in vivo de coupler cet agent alkylant à des photosensibilisateurs de type porphyrine et chlorine. Les études d'efficacité in vivo sur un modèle de souris nude xénogreffées en ectopique avec des cellules de carcinome oral humain KB, ont été menées par une méthodologie de plans d'expérience. Deux conjugués [Ru(_6-p-PriC6H4Me)(5-(3-pyridyl)-10,15,20-triphenylporphyrin)Cl2, ou Rut1, et Ru4(_6-p-PriC6H4Me)4(5,10,15,20-tetra(3-pyridyl)porphyrin)Cl8, ou Rut4] efficaces in vitro ont été comparés in vivo. Le composé Rut4 est apparu comme le plus efficace. Des études de biodistribution par spectrofluorimétrie fibrée et de pharmacocinétique classique ont montré un intervalle drogue-lumière optimal de 24h. Néanmoins, malgré l'optimisation des modalités thérapeutiques, le couplage du Ru avec une molécule photo-activable (porphyrine ou chlorine) n'a pas conduit à une efficacité anti-tumorale significative in vivo / To improve tumor cells selectivity and/or photodynamic therapy (PDT) anti-tumor efficiency, active molecules (peptides, pseudopeptides, alkylating agents) have been conjugated to the photo-activable molecule. In a first part, vascular effect of PDT has been promoted by targeting the tumor vasculature with angiogenic phenotype. A chlorine-type photosensitizer have been coupled to a neuropilin-1 (NRP-1)-targeting peptide and has shown its in vitro and in vivo anti-tumor efficiency for PDT. However, the peptidic sequence has been degraded in vivo. Clivage site-modified pseudopeptides have been synthesized and tested in vitro, conjugated to TPC or not. Chlorine cellular uptake has been improved after coupling with pseudopeptides. A technique of RNA interference-mediated silencing of NRP-1 in MDA-MB-231, over-expressing NRP-1, has highlighted the receptor-dependent uptake of the conjugates and their cellular selectivity. Pseudopeptides and conjugates have shown their NRP-1 affinity and their in vivo stability. Ruthenium (Ru) is considered as an interest therapeutic molecule in oncology. In a second part, we have studied the in vivo interest of coupling an alkylating agent with porphyrine and chlorine-type photosensitizers. The in vivo efficiency studies on nude mice xenografted ectopically with KB cells have been carried using experimental design approach. Two in vitro efficient conjugates [Ru(_6-p-PriC6H4Me)(5-(3-pyridyl)-10,15,20-triphenylporphyrin)Cl2, or Rut1, and Ru4(_6-p-PriC6H4Me)4(5,10,15,20-tetra(3-pyridyl)porphyrin)Cl8, or Rut4] have been compared in vivo. Rut4 conjugate has appeared to be more efficient than Rut1. Biodistribution studies using fiber spectrofluorimeter and classic pharmacokinetic studies have shown an optimal drug-light interval of 24h. However, after PDT parameters optimization, the Ru coupling with a photo-activable molecule (porphyrin or chlorine) hasn?t shown any significant in vivo anti-tumor efficiency

L’objectif principal de ce travail de thèse a été de caractériser les effets de l’anti-VEGF Bevacizumab (Avastin) sur le réseau vasculaire tumoral in vivo, au cours du temps, à l’aide du modèle de la chambre dorsale chez la souris nude. Les images du réseau vasculaire tumoral acquises par microscopie intravitale ont été analysées par un algorithme de traitement d’images développé au sein de notre équipe, permettant de mettre en évidence les modifications morphologiques induites par le traitement et d’isoler des paramètres discriminants de la « normalisation » vasculaire, par comparaison à un réseau vasculaire sain. La période de « normalisation » vasculaire détectée par notre outil a été confortée par l’analyse de la fonctionnalité des vaisseaux sanguins au cours du temps, in vivo et par une analyse immunohistochimique des vaisseaux sanguins tumoraux et du tissu tumoral. A travers des essais préliminaires in vivo, en regard des résultats de ce travail concernant une fenêtre de "normalisation", nous avons cherché à vérifier l'hypothèse d'un bénéfice d'un traitement anti-VEGF préalablement à la thérapie photodynamique (PDT) sur des tumeurs de glioblastome xénogreffées en sous-cutané et en chambre dorsale. L'efficacité de la PDT est décrite comme étant dépendante d'une d'oxygénation tumorale suffisante et d'une distribution maximale de l'agent photosensibilisant au coeur des tumeurs. Parallèlement à ces travaux, nous avons cherché en équipe pluridiscilinaire à développer un modèle mathématique de la réponse au bevacizumab à partir de données biologiques réelles obtenues sur le même modèle in vivo et permettant pour l'avenir de simuler les réponses à différentes doses et différentes durées de traitement, toujours à des fins d'optimisation des protocoles thérapeutiques / The main aim of this work was to characterize the effects of the anti-VEGF Bevacizumab (Avastin) on the tumor vascular network, in vivo, over time, thanks to the skin fold chamber model on the nude mouse. Images of the vascular network obtained using intravital microscopy were analyzed par a dedicated image processing algorithm developed within our research team, allowing to highlight the morphological modifications induced by the treatment and to isolate discriminating parameters of the vascular "normalization", by comparison to healthy vascular networks. Le vascular "normalization" period detected with our tool was comforted by the analysis of the functionality of the blood vessels over time, in vivo and by an immunohistochemical analysis of the blood vessels and of the tumor tissue. In preliminary in vivo experiments, we tried to verify the hypothesis of the benefits of an anti-VEGF treatment prior to photodynamic therapy (PDT) on glioblastoma xenografts implanted subcutaneously or in the skin fold chamber. The efficacy of PDT is described as being dependent on tumor oxygenation and on the distribution of the photosensitizing agent within the tumor. In paralel to this work, we tried as a pluridisciplinary team to develop a mathematical model of the tumor response to bevacizumab using biological data obtained on the same in vivo model et that will allow in the future to simulate the response for different doses and different treatment durations, for the optimization of therapeutic protocols

La thérapie photodynamique (PDT) est un traitement alternatif à la chirurgie en oncologie utilisant un photosensibilisateur (PS), la lumière visible et l’oxygène moléculaire. La méta-tétra(hydroxyphényl)chlorine (mTHPC) est l’un des PS de deuxième génération les plus utilisés en clinique en raison de son absorption dans le rouge lointain et d’un rendement quantique en 1O2 élevé. De par sa nature hydrophobe, la mTHPC est partiellement agrégée dans la circulation sanguine diminuant sa biodistribution. Dans le but d’améliorer la sélectivité tumorale de la mTHPC, différentes stratégies de vectorisation ont été développées. La formulation liposomale de mTHPC non PEGylée (Foslip®) améliore la biodistribution ainsi que les propriétés pharmacocinétiques de la mTHPC. Cependant, une rapide destruction des liposomes en circulation ainsi qu’une rapide libération de la mTHPC sont des inconvénients majeurs. Une alternative possible est l’utilisation de vésicules extracellulaires (VE). Dérivées des cellules, les VE possèdent une stabilité naturelle dans la circulation sanguine et une capacité à transporter et délivrer leur contenu de manière spécifique aux cellules cancéreuses. Cette vectorisation est intéressante en PDT en raison d’une importante capacité d’encapsulation des porphyrines. Le but de cette étude était d’évaluer l’intérêt des VE en tant que nanovecteur de la mTHPC dans divers modèles précliniques comparé au Foslip®. Contrairement au Foslip®, l’intégrité membranaire des VE est conservée en présence de 20% de plasma. In vitro, les mTHPC-VE ont montré une internalisation cellulaire par un mécanisme actif d’endocytose. Dans un modèle cellulaire en 3D de sphéroïdes multicellulaires, les mTHPC-VE ont permis d’accroitre l’accumulation cellulaire, la diffusion au sein de ce modèle ainsi que l’efficacité PDT. In vivo, les mTHPC-VE apparaissent plus efficace au niveau PDT avec un retard de croissance tumorale significativement augmenté. En conclusion, l’intégration de la mTHPC au sein des VE améliore l’efficacité PDT dans les différents modèles d’étude. Le suivi des mTHPC-VE à l’aide d’un traceur radioactif chez la souris ainsi que l’étude du ciblage de la vascularisation tumorale seront étudiés dans la suite du travail / Photodynamic therapy (PDT) is an alternative treatment to surgery in oncology using photosensitizer (PS), light and oxygen. Meta-tetra(hydroxylphenyl)chlorin (mTHPC) is one of the most used PS in clinics due to its high absorption in the deep red and high 1O2 quantum yield. In order to improve the mTHPC tumor selectivity different attempts of nanovectorisation were conducted. Non-PEGylated liposomal mTHPC (Foslip®) increase biodistribution and pharmacokinetic properties. However, the rapid liposome destruction during circulation and rapid mTHPC release are obvious shortcomings. Alternatively, mTHPC vectorization could be realized by extracellular vesicles (EVs). Derived from the cell, EVs possess a natural stability in bloodstream and ability to transport and deliver cargo molecules into cancer cells. This formulation is interesting for PDT due to the ability to encapsulate porphyrins. The aim of the present study was to determine the interest of EVs as mTHPC nanocarriers in various preclinical models compared to Foslip®. In contrast to Foslip®, membrane integrity of mTHPC-EVs was conserved in 20% of plasma. In vitro, mTHPC-EVs showed cellular internalization by an active endocytosis mechanism. In a 3D model of spheroids, mTHPC-EVs have improved cellular uptake, better diffusion inside spheroid and increased PDT efficacy. In vivo, mTHPC-EVs appeared to be more potent in terms of PDT efficacy, with a tumor growth delay significantly higher. In conclusion, integration of mTHPC in EVs improves PDT efficacy in various preclinical models. The tracking of mTHPC-EVs using a radioactive tracer in xenografted rodents as well as the study of vascularization targeting will be studied in the next step of this work