A dermatite digital (DD) é uma das principais doenças podais que acomete bovinos leiteiros, destacando-se negativamente pela queda na produção o volume de leite produzido e pelo seu oneroso tratamento. Como alternativa ao uso de antibióticos, a terapia fotodinâmica (PDT) se apresenta como uma opção interessante no tratamento de infecções cutâneas em animais de produção, evitando a seleção de micro-organimos resistentes. O objetivo deste estudo foi investigar o uso da PDT para tratar a DD em bovinos leiteiros. Para compor os grupos experimentais, 20 lesões de DD, localizadas nos membros pélvicos de 16 animais, foram tratadas com PDT (350mW/Led; = 660nm ± 10nm; A = 13,20 cm2; I = 120mW/cm2) associado à aplicação tópica do fotossenbilizador azul de metileno (300µM; apresentação em gel; com 5 min de tempo de pré-irradiação) ou com aplicação tópica de oxitetraciclina (500 mg em solução à 20%). Cada lesão foi tratada duas vezes com intervalo de 14 dias entre elas. A caracterização macroscópica das lesões foi realizada no momento inicial, e fotografias digitais foram realizadas semanalmente para análise da redução da área das lesões. Além disto, foram coletadas biópsias de cada lesão nos dias 1, 7, 21 e 28, sendo posteriormente analisadas para diferentes colorações histológicas, as quais objetivaram a detecção de micro-organismos e a análise comparativa do processo de cicatrização. Ainda, biópsias de pele realizadas na região dos bulbos dos talões de 10 animais que não apresentavam lesões foram usadas como controle histológico. Em ambos os tratamentos houve redução da área da lesão, sendo que não houve diferença significante entre os tratamentos. Apesar da regressão significante ao longo do período, no último dia de avaliação, três animais tratados com oxitetraciclina ainda apresentavam pequenas lesões, algo que não foi observado nos animais tratados com PDT. Adicionalmente, o tratamento com oxitetraciclina resultou em leve aumento de colágeno do tipo III e diminuição de colágeno do tipo I, enquanto a PDT promoveu aumento significante da área total de colágeno, em especial do tipo I, em relação ao momento inicial. Espiroquetas foram observadas em todas as lesões, no momento que antecedeu os tratamentos, entretanto não foram visualizadas na pele dos animais saudáveis. Ao término do período de avaliação, cinco lesões tratadas com oxitetraciclina ainda apresentavam espiroquetas, enquanto no grupo tratado com PDT não foi possível evidenciar estes micro-organismos em nenhuma das lesões. Portanto, a PDT mostrou ser uma opção mais eficaz do que a oxitetraciclina no tratamento da DD. / Bovine digital dermatitis (BDD) stands out as one of the most important diseases that affect dairy cows, being responsible for negative economic implications. Photodynamic therapy (PDT) has emerged as an interesting therapeutic option to treat superficial infections on livestock animals, avoiding the overuse of antibiotics, and consequently, the selection of multidrug-resistant pathogens. The aim of this study was to investigate the use of PDT to treat BDD. Twenty BDD lesions located in the pelvic limbs of 16 animals were treated by PDT (350mW / Led; = 660nm ± 10nm; A = 13, 20 cm2, I = 120mW/cm2) associated with topical application of methylene blue photosensitizer (300µM; gel presentation; 5 min of pre-irradiation time) or topical application of oxytetracycline (500 mg in 20% solution). Each lesion was treated twice with an interval of 14 days. Lesions were individually classified, and digital photographs were weekly performed to evaluate the reduction of lesions. Additionally, biopsies of each lesion were collected on days 1, 7, 21 and 28; and different histological stains were used to detect microorganisms and compare the healing process after treatmens. Yet, skin biopsies from 10 healthy animals, colleted in the area between heel bulbs, were used as controls. In both treatments, we observed the reduction of lesions area, but there were no significant difference between them. At the last day, three animals treated by topical oxytetracycline still presented small lesions, whereas no lesions were evidenced in the group treated by PDT. The treatment with oxytetracycline resulted in a slight increase in type III collagen and decreased type I collagen levels, while PDT treatment led to a significant increase in the total area of both collagen (mostly type I). Spirochetes were observed in all lesions before treatments but were not detected in the skin of healthy animals. At the end of evaluation period, five lesions treated by topical oxytetracycline still presented spirochetes, whereas in PDT group no spirochetes were evidenced. Therefore, PDT was shown to be a more effective option for BDD when it was compared to topical oxytetracycline treatment.

Métodos de desinfecção da água destinam-se à inativação de patógenos a fim de minimizar o risco de doenças transmitidas pela água. Estes métodos incluem tratamento com luz ultravioleta e processos químicos, para o qual cloro, dióxido de cloro, hipoclorito e ozônio são comumente utilizados. No entanto, métodos analíticos modernos revelam que estes métodos padrão de desinfecção da água podem levar à formação de produtos tóxicos e potencialmente cancerígenos. Desse modo, desenvolver métodos mais adequados para a desinfecção de água é uma necessidade. Inativação Fotodinâmica é uma nova abordagem para a eliminação de microrganismos patogênicos. Basicamente, esse processo utiliza fotossensibilizadores e luz para promover uma resposta fototóxica, normalmente oxidativa, capaz de danificar biomoléculas e estruturas celulares, provocando a morte dos microrganismos. No entanto, o fotossensibilizador não pode permanecer livre como um contaminante neste tipo de aplicação. Assim, o objetivo desse estudo foi o desenvolvimento de membranas de quitosana com fotossensibilizadores incorporados visando à desinfecção microbiológica da água. As membranas foram preparadas incorporando-se o azul de metileno, a rosa de bengala, meso-tetrakis (4-N-metilpiridil)-porfirina ou a 5,10,15,20-tetrakis(p-aminofenil)-porfirina. A eficiência do processo de Inativação Fotodinâmica com os fotossensibilizadores incorporados as membrana foi investigada empregando-se a bactéria Escherichia coli como modelo, já que esta bactéria está comumente presente em águas de abastecimento. Os resultados mostraram que, dentre os quatro fotossensibilizadores incorporados em membranas de quitosana, o processo fotodinâmico empregando a TMPyP se mostrou mais efetivo: 5 log de redução após 120 minutos de irradiação com LED branco e 4 log de redução após 120 e 140 minutos de irradiação com LED azul e amarelo, respectivamente. Além disso, com o intuito de simular uma situação real de desinfecção, um sistema circulatório de água, contendo membranas de quitosana/TMPyP reforçadas com nylon, foi empregado. Os resultados mostraram que o processo de fotoinativação dinâmico foi efetivo, apresentando 3 log de redução em 80 minutos de irradiação com LED branco. Estes resultados sugerem que o processo é efetivo para inativar bactérias contaminantes na água, empregando-se fotossensibilizadores incorporados em quitosana como suporte polimérico. / Methods of water disinfection aim to inactivate pathogens in order to minimize the risk of waterborne diseases. These methods include treatment with ultraviolet light and chemical processes, for which chlorine, chlorine dioxide, hypochlorite and ozone are commonly used. However, modern analytical methods reveal that these standard methods of water disinfection may lead to the formation of toxic and potentially carcinogenic products. Thus, developing suitable methods for water disinfection is a necessity. Photodynamic inactivation is a new approach to eliminate pathogenic microorganisms. Basically, this process uses photosensitizers and light to promote a phototoxic response, normally oxidative, capable of damaging biomolecules and cellular structures, causing the death of microorganisms. However, the photosensitizer cannot remain free as a contaminant in this type of application. The objective of this study was to develop chitosan membranes with incorporated photosensitizers aiming the microbiological water disinfection. The membranes were prepared by incorporating methylene blue, rose bengal, meso-tetrakis (4-N-methylpyridyl)-porphine or the 5,10,15,20-tetrakis(p-aminophenyl)- porphyrin. The efficiency of the Photodynamic Inactivation with photosensitizers incorporated into the membrane was investigated using the bacteria Escherichia coli as a model, since this bacteria is commonly present in drinking water. The results showed that, among the four photosensitizers incorporated into chitosan membranes, the process employing the TMPyP was more effective: 5 log reduction after 120 minutes of irradiation with white LED and 4 log reduction after 120 and 140 minutes of irradiation with blue and yellow LED, respectively. Moreover, in order to simulate a real situation of disinfection, a water circulation system, containing TMPyP/chitosan membranes reinforced with nylon, was employed. The results showed that the process of photoinactivation using a dynamic system was effective, with about 3 log reduction in 80 minutes of irradiation with white LED. These results suggest that the process is effective to inactivate bacterial contaminants in water using photosensitizers incorporated into chitosan as a polymeric support.

A proteômica é uma técnica muito importante e amplamente utilizada na elucidação de diversos mecanismos biológicos. Essa técnica pode ser usada, por exemplo, na avaliação da resposta celular a estímulos ou na determinação de modificações proteicas resultantes de um tratamento. Neste trabalho, a abordagem proteômica foi utilizada em dois sistemas diferentes: (1) na elucidação da resposta à luz no fungo Metarhizium acridum e (2) na determinação dos danos proteicos causados pelo tratamento fotodinâmico da levedura Candida albicans. (1) O fungo entomopatogênico M. acridum, quando crescido na presença de luz, produz conídios com elevada tolerância à radiação ultravioleta-B (290-315 nm). Essa elevada resistência é altamente desejada para aplicação de M. acridum no controle biológico de pragas na agricultura. É possível que esse fenômeno seja decorrente do acúmulo diferencial de proteínas nos conídios produzidos na presença de luz em comparação com aqueles produzidos no escuro. Assim, foi utilizada uma abordagem proteômica para determinar quais proteínas poderiam estar diferencialmente acumuladas nos conídios. Os resultados mostraram que, de um total de 501 proteínas identificadas, somente quatro estavam diferencialmente acumuladas. Apesar de não ser possível estabelecer uma relação clara entre o acúmulo dessas proteínas e a elevada tolerância à radiação ultravioleta-B, dados de proteínas homólogas em Aspergillus fumigatus obtidos da literatura mostraram que essas proteínas são reguladas em condições de estresse. Adicionalmente, experimentos foram conduzidos para expandir o conhecimento sobre a fotobiologia de M. acridum. Estabeleceu-se que, dentro do espectro da luz visível, a luz azul é responsável por induzir o aumento da tolerância à radiação ultravioleta-B, enquanto a luz vermelha não produz o mesmo resultado. Conclui-se que o estudo da resposta à luz através da proteômica de conídios requer o uso de técnicas que resultem na identificação de uma fração maior do proteoma, já que o acúmulo diferencial de proteínas aparentemente não envolve as proteínas mais abundantes. (2) Candida albicans é um importante patógeno humano responsável por micoses superficiais e sistêmicas, principalmente em indivíduos imunocomprometidos. O uso contínuo dos fungicidas tradicionais vem resultando na seleção de linhagens tolerantes. Nesse cenário, o tratamento fotodinâmico antimicrobiano surgiu como importante alternativa no tratamento das micoses causadas por C. albicans. Apesar da efetividade desse tratamento ter sido observada em diversos trabalhos, um estudo no nível proteico ainda não havia sido realizado. A abordagem proteômica por eletroforese bidimensional revelou que, após o tratamento das células, muitos spots nos géis sofreram um desvio ácido, ou seja, um deslocamento para regiões de menor ponto isoelétrico. Por outro lado, foram observados spots resistentes a essa modificação. Proteínas pertencentes a ambos os grupos foram identificadas por espectrometria de massas. A análise de aminoácidos mostrou que o conteúdo de histidina nas células de C. albicans foi reduzido em aproximadamente 60% após o tratamento, o que é uma possível explicação para o desvio ácido observado. Conclui-se, após extensa revisão e discussão da literatura, que os danos em proteínas dependem da interação entre proteína e fotossensibilizador e também da presença de aminoácidos fotooxidáveis nas proximidades dos sítios de interação. / Proteomics is a very important and largely employed technique for the elucidation of a series of biological mechanisms. This technique can be used, for instance, on the evaluation of cellular responses to stimulus or in determining protein modification resulting from a treatment. In the present work, a proteomic approach was used in two distinct biological systems: (1) to evaluate the light response in the fungus Metarhizium acridum, and (2) to determine the protein damage resulting from photodynamic treatment of the yeast Candida albicans. (1) The entomopathogenic fungus M. acridum, when grown in the presence of light, produces conidia with increased tolerance to ultraviolet-B radiation (290-315 nm). This increased resistance is desired for the application of this fungus on the biological control of agricultural pests. It is possible that this phenomenon results from the differential accumulation of proteins in conidia produced in the presence of light as compared to those produced in the dark. Therefore, a proteomic approach was used to determine which proteins could be differentially accumulated in conidia. The results showed that, out of a total of 501 identified proteins, only four were found to be differentially accumulated. Even though establishing a direct relationship between the observed accumulation and the increased tolerance to ultraviolet-B radiation was not possible, data from the literature on homolog proteins in Aspergillus fumigatus have shown that these proteins are regulated under stress conditions. Additionally, experiments were performed to gain further insight on the photobiology of M. acridum. It was stablished that, within visible light spectrum, blue light is responsible for inducing the increased tolerance to ultraviolet-B, while red light does not produce the same effect. It is concluded that a light-response study employing proteomics should rely on techniques yielding a higher number of identified proteins, as the differential accumulation does not seem to affect high abundance proteins. (2) Candida albicans is an important human pathogen responsible for superficial and systemic mycoses mainly in immunocompromised patients. The continuous use of the traditional fungicides has resulted in the selection of tolerant strains. In this scenario, antimicrobial photodynamic treatment became an important alternative on the treatment of C. albicans infections. Although the effectiveness of this treatment has been observed in multiple studies, an evaluation at the protein level had not been performed. A proteomic approach by two-dimensional electrophoresis revealed that, after cell treatment, many spots underwent an acidic shift, that is, a shift towards lower isoelectric point. On the other hand, protein spots resistant to modification were also observed. Proteins belonging to both groups were identified by mass spectrometry. Amino acid analysis revealed that the histidine content in C. albicans cells decreased by up to 60% after the treatment, which is a possible explanation to the observed acidic shift. It is concluded, after extensive literature review and discussion, that protein damage depends on protein-photosensitizer interaction and also on the presence of photooxidazible amino acids in the proximity of the interaction site.

Um híbrido inorgânico-orgânico formado por nanozeólita L (nZeol-L) funcionalizada em sua superfície com ftalocianina de silício (SiPC) foi investigado visando uma potencial aplicação para descontaminação de água, via geração de oxigênio singleto (1O2), que por sua vez é citotóxico para sistemas biológicos. Ftalocianinas são corantes orgânicos que possuem comprovada eficiência na geração de oxigênio singleto. No entanto, estes corantes possuem tendência para formar agregados, o que torna ineficiente a formação de 1O2. nZeol-L constitui-se como um material apropriado para suportar SiPC covalentemente em sua superfície com o objetivo de prevenir o processo de agregação, mantendo assim as propriedades fotofísicas dos monômeros do corante. Neste estudo, um híbrido foi preparado visando a fotoinativação da bactéria E. coli (facilmente encontrada em água contaminada) através da luz solar natural. A superfície da nanozeólita L foi funcionalizada com o fotossensitizador (SiPC) e com moléculas de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) para criar cargas positivas na superfície do material, tornando o híbrido capaz de interagir eletrostaticamente com a superfície negativa das bactérias. Testes de viabilidade celular foram realizados com dois tipos de células: BALB/c 3T3 clone A31 e células de E. coli suspensos em uma solução de PBS (pH 7,4) com a presença do híbrido (nZeol-SiPC/APTES). Foi verificada uma alta eficiência de nZeol-SiPC/APTES em induzir a morte de ambas as células em grande quantidade e dentro de um curto período de tempo. Estes resultados indicam que o nanomaterial (nZeol-SiPC/APTES) possui uma potencial aplicação para a descontaminação de água, quando ativado pela luz do sol. / An inorganic-organic hybrid based on nanozeolite L (nZeol-L) surface-functionalized with silicon phthalocyanine (SiPC) has been investigated aiming its future use in water decontamination by singlet oxygen generation, which is cytotoxic for biological systems. Phthalocyanines are dyes with great efficacy in singlet oxygen generation. However, these dyes have tendency to form aggregates, and hence, the formation of this reactive species of molecular oxygen turns to be inefficient. nZeol-L is an appropriate material to covalently support SiPC on its surface to avoid the aggregation process, thereby maintaining the photophysical properties of the monomer. In this study, a hybrid was prepared aiming the photoinactivation of E. coli bacteria (which is easily found in contaminated water) by natural sunlight. The nanozeolite L surface was functionalized with the photosensitizer (SiPC) and then with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) molecules to create a positive charge on the material surface, enabling the hybrid to interact with the negative charge to the E. coli bacteria. Cell viability tests were performed with two types of cells: BALB/c 3T3 clone A31 and E. coli cells suspended in PBS solution (pH 7.4) in the presence of the hybrid (here called nZeol-SiPC/APTES). It was verified that nZeol-SiPC/APTES gives rise to the death of the both cells in a large quantity and within a short time interval. These results indicate that the nanomaterial (nZeol-SiPC/APTES) has potential application for water decontamination when activated by sunlight.

Um híbrido inorgânico-orgânico formado por nanozeólita L (nZeol-L) funcionalizada em sua superfície com ftalocianina de silício (SiPC) foi investigado visando uma potencial aplicação para descontaminação de água, via geração de oxigênio singleto (1O2), que por sua vez é citotóxico para sistemas biológicos. Ftalocianinas são corantes orgânicos que possuem comprovada eficiência na geração de oxigênio singleto. No entanto, estes corantes possuem tendência para formar agregados, o que torna ineficiente a formação de 1O2. nZeol-L constitui-se como um material apropriado para suportar SiPC covalentemente em sua superfície com o objetivo de prevenir o processo de agregação, mantendo assim as propriedades fotofísicas dos monômeros do corante. Neste estudo, um híbrido foi preparado visando a fotoinativação da bactéria E. coli (facilmente encontrada em água contaminada) através da luz solar natural. A superfície da nanozeólita L foi funcionalizada com o fotossensitizador (SiPC) e com moléculas de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) para criar cargas positivas na superfície do material, tornando o híbrido capaz de interagir eletrostaticamente com a superfície negativa das bactérias. Testes de viabilidade celular foram realizados com dois tipos de células: BALB/c 3T3 clone A31 e células de E. coli suspensos em uma solução de PBS (pH 7,4) com a presença do híbrido (nZeol-SiPC/APTES). Foi verificada uma alta eficiência de nZeol-SiPC/APTES em induzir a morte de ambas as células em grande quantidade e dentro de um curto período de tempo. Estes resultados indicam que o nanomaterial (nZeol-SiPC/APTES) possui uma potencial aplicação para a descontaminação de água, quando ativado pela luz do sol. / An inorganic-organic hybrid based on nanozeolite L (nZeol-L) surface-functionalized with silicon phthalocyanine (SiPC) has been investigated aiming its future use in water decontamination by singlet oxygen generation, which is cytotoxic for biological systems. Phthalocyanines are dyes with great efficacy in singlet oxygen generation. However, these dyes have tendency to form aggregates, and hence, the formation of this reactive species of molecular oxygen turns to be inefficient. nZeol-L is an appropriate material to covalently support SiPC on its surface to avoid the aggregation process, thereby maintaining the photophysical properties of the monomer. In this study, a hybrid was prepared aiming the photoinactivation of E. coli bacteria (which is easily found in contaminated water) by natural sunlight. The nanozeolite L surface was functionalized with the photosensitizer (SiPC) and then with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) molecules to create a positive charge on the material surface, enabling the hybrid to interact with the negative charge to the E. coli bacteria. Cell viability tests were performed with two types of cells: BALB/c 3T3 clone A31 and E. coli cells suspended in PBS solution (pH 7.4) in the presence of the hybrid (here called nZeol-SiPC/APTES). It was verified that nZeol-SiPC/APTES gives rise to the death of the both cells in a large quantity and within a short time interval. These results indicate that the nanomaterial (nZeol-SiPC/APTES) has potential application for water decontamination when activated by sunlight.

A proteômica é uma técnica muito importante e amplamente utilizada na elucidação de diversos mecanismos biológicos. Essa técnica pode ser usada, por exemplo, na avaliação da resposta celular a estímulos ou na determinação de modificações proteicas resultantes de um tratamento. Neste trabalho, a abordagem proteômica foi utilizada em dois sistemas diferentes: (1) na elucidação da resposta à luz no fungo Metarhizium acridum e (2) na determinação dos danos proteicos causados pelo tratamento fotodinâmico da levedura Candida albicans. (1) O fungo entomopatogênico M. acridum, quando crescido na presença de luz, produz conídios com elevada tolerância à radiação ultravioleta-B (290-315 nm). Essa elevada resistência é altamente desejada para aplicação de M. acridum no controle biológico de pragas na agricultura. É possível que esse fenômeno seja decorrente do acúmulo diferencial de proteínas nos conídios produzidos na presença de luz em comparação com aqueles produzidos no escuro. Assim, foi utilizada uma abordagem proteômica para determinar quais proteínas poderiam estar diferencialmente acumuladas nos conídios. Os resultados mostraram que, de um total de 501 proteínas identificadas, somente quatro estavam diferencialmente acumuladas. Apesar de não ser possível estabelecer uma relação clara entre o acúmulo dessas proteínas e a elevada tolerância à radiação ultravioleta-B, dados de proteínas homólogas em Aspergillus fumigatus obtidos da literatura mostraram que essas proteínas são reguladas em condições de estresse. Adicionalmente, experimentos foram conduzidos para expandir o conhecimento sobre a fotobiologia de M. acridum. Estabeleceu-se que, dentro do espectro da luz visível, a luz azul é responsável por induzir o aumento da tolerância à radiação ultravioleta-B, enquanto a luz vermelha não produz o mesmo resultado. Conclui-se que o estudo da resposta à luz através da proteômica de conídios requer o uso de técnicas que resultem na identificação de uma fração maior do proteoma, já que o acúmulo diferencial de proteínas aparentemente não envolve as proteínas mais abundantes. (2) Candida albicans é um importante patógeno humano responsável por micoses superficiais e sistêmicas, principalmente em indivíduos imunocomprometidos. O uso contínuo dos fungicidas tradicionais vem resultando na seleção de linhagens tolerantes. Nesse cenário, o tratamento fotodinâmico antimicrobiano surgiu como importante alternativa no tratamento das micoses causadas por C. albicans. Apesar da efetividade desse tratamento ter sido observada em diversos trabalhos, um estudo no nível proteico ainda não havia sido realizado. A abordagem proteômica por eletroforese bidimensional revelou que, após o tratamento das células, muitos spots nos géis sofreram um desvio ácido, ou seja, um deslocamento para regiões de menor ponto isoelétrico. Por outro lado, foram observados spots resistentes a essa modificação. Proteínas pertencentes a ambos os grupos foram identificadas por espectrometria de massas. A análise de aminoácidos mostrou que o conteúdo de histidina nas células de C. albicans foi reduzido em aproximadamente 60% após o tratamento, o que é uma possível explicação para o desvio ácido observado. Conclui-se, após extensa revisão e discussão da literatura, que os danos em proteínas dependem da interação entre proteína e fotossensibilizador e também da presença de aminoácidos fotooxidáveis nas proximidades dos sítios de interação. / Proteomics is a very important and largely employed technique for the elucidation of a series of biological mechanisms. This technique can be used, for instance, on the evaluation of cellular responses to stimulus or in determining protein modification resulting from a treatment. In the present work, a proteomic approach was used in two distinct biological systems: (1) to evaluate the light response in the fungus Metarhizium acridum, and (2) to determine the protein damage resulting from photodynamic treatment of the yeast Candida albicans. (1) The entomopathogenic fungus M. acridum, when grown in the presence of light, produces conidia with increased tolerance to ultraviolet-B radiation (290-315 nm). This increased resistance is desired for the application of this fungus on the biological control of agricultural pests. It is possible that this phenomenon results from the differential accumulation of proteins in conidia produced in the presence of light as compared to those produced in the dark. Therefore, a proteomic approach was used to determine which proteins could be differentially accumulated in conidia. The results showed that, out of a total of 501 identified proteins, only four were found to be differentially accumulated. Even though establishing a direct relationship between the observed accumulation and the increased tolerance to ultraviolet-B radiation was not possible, data from the literature on homolog proteins in Aspergillus fumigatus have shown that these proteins are regulated under stress conditions. Additionally, experiments were performed to gain further insight on the photobiology of M. acridum. It was stablished that, within visible light spectrum, blue light is responsible for inducing the increased tolerance to ultraviolet-B, while red light does not produce the same effect. It is concluded that a light-response study employing proteomics should rely on techniques yielding a higher number of identified proteins, as the differential accumulation does not seem to affect high abundance proteins. (2) Candida albicans is an important human pathogen responsible for superficial and systemic mycoses mainly in immunocompromised patients. The continuous use of the traditional fungicides has resulted in the selection of tolerant strains. In this scenario, antimicrobial photodynamic treatment became an important alternative on the treatment of C. albicans infections. Although the effectiveness of this treatment has been observed in multiple studies, an evaluation at the protein level had not been performed. A proteomic approach by two-dimensional electrophoresis revealed that, after cell treatment, many spots underwent an acidic shift, that is, a shift towards lower isoelectric point. On the other hand, protein spots resistant to modification were also observed. Proteins belonging to both groups were identified by mass spectrometry. Amino acid analysis revealed that the histidine content in C. albicans cells decreased by up to 60% after the treatment, which is a possible explanation to the observed acidic shift. It is concluded, after extensive literature review and discussion, that protein damage depends on protein-photosensitizer interaction and also on the presence of photooxidazible amino acids in the proximity of the interaction site.

Métodos de desinfecção da água destinam-se à inativação de patógenos a fim de minimizar o risco de doenças transmitidas pela água. Estes métodos incluem tratamento com luz ultravioleta e processos químicos, para o qual cloro, dióxido de cloro, hipoclorito e ozônio são comumente utilizados. No entanto, métodos analíticos modernos revelam que estes métodos padrão de desinfecção da água podem levar à formação de produtos tóxicos e potencialmente cancerígenos. Desse modo, desenvolver métodos mais adequados para a desinfecção de água é uma necessidade. Inativação Fotodinâmica é uma nova abordagem para a eliminação de microrganismos patogênicos. Basicamente, esse processo utiliza fotossensibilizadores e luz para promover uma resposta fototóxica, normalmente oxidativa, capaz de danificar biomoléculas e estruturas celulares, provocando a morte dos microrganismos. No entanto, o fotossensibilizador não pode permanecer livre como um contaminante neste tipo de aplicação. Assim, o objetivo desse estudo foi o desenvolvimento de membranas de quitosana com fotossensibilizadores incorporados visando à desinfecção microbiológica da água. As membranas foram preparadas incorporando-se o azul de metileno, a rosa de bengala, meso-tetrakis (4-N-metilpiridil)-porfirina ou a 5,10,15,20-tetrakis(p-aminofenil)-porfirina. A eficiência do processo de Inativação Fotodinâmica com os fotossensibilizadores incorporados as membrana foi investigada empregando-se a bactéria Escherichia coli como modelo, já que esta bactéria está comumente presente em águas de abastecimento. Os resultados mostraram que, dentre os quatro fotossensibilizadores incorporados em membranas de quitosana, o processo fotodinâmico empregando a TMPyP se mostrou mais efetivo: 5 log de redução após 120 minutos de irradiação com LED branco e 4 log de redução após 120 e 140 minutos de irradiação com LED azul e amarelo, respectivamente. Além disso, com o intuito de simular uma situação real de desinfecção, um sistema circulatório de água, contendo membranas de quitosana/TMPyP reforçadas com nylon, foi empregado. Os resultados mostraram que o processo de fotoinativação dinâmico foi efetivo, apresentando 3 log de redução em 80 minutos de irradiação com LED branco. Estes resultados sugerem que o processo é efetivo para inativar bactérias contaminantes na água, empregando-se fotossensibilizadores incorporados em quitosana como suporte polimérico. / Methods of water disinfection aim to inactivate pathogens in order to minimize the risk of waterborne diseases. These methods include treatment with ultraviolet light and chemical processes, for which chlorine, chlorine dioxide, hypochlorite and ozone are commonly used. However, modern analytical methods reveal that these standard methods of water disinfection may lead to the formation of toxic and potentially carcinogenic products. Thus, developing suitable methods for water disinfection is a necessity. Photodynamic inactivation is a new approach to eliminate pathogenic microorganisms. Basically, this process uses photosensitizers and light to promote a phototoxic response, normally oxidative, capable of damaging biomolecules and cellular structures, causing the death of microorganisms. However, the photosensitizer cannot remain free as a contaminant in this type of application. The objective of this study was to develop chitosan membranes with incorporated photosensitizers aiming the microbiological water disinfection. The membranes were prepared by incorporating methylene blue, rose bengal, meso-tetrakis (4-N-methylpyridyl)-porphine or the 5,10,15,20-tetrakis(p-aminophenyl)- porphyrin. The efficiency of the Photodynamic Inactivation with photosensitizers incorporated into the membrane was investigated using the bacteria Escherichia coli as a model, since this bacteria is commonly present in drinking water. The results showed that, among the four photosensitizers incorporated into chitosan membranes, the process employing the TMPyP was more effective: 5 log reduction after 120 minutes of irradiation with white LED and 4 log reduction after 120 and 140 minutes of irradiation with blue and yellow LED, respectively. Moreover, in order to simulate a real situation of disinfection, a water circulation system, containing TMPyP/chitosan membranes reinforced with nylon, was employed. The results showed that the process of photoinactivation using a dynamic system was effective, with about 3 log reduction in 80 minutes of irradiation with white LED. These results suggest that the process is effective to inactivate bacterial contaminants in water using photosensitizers incorporated into chitosan as a polymeric support.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-06-16T12:02:55Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Vargas Teles - 2016.pdf: 2056252 bytes, checksum: 368e99b26e688ce89da00fe5b604b179 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-28T13:14:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Vargas Teles - 2016.pdf: 2056252 bytes, checksum: 368e99b26e688ce89da00fe5b604b179 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T13:14:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Vargas Teles - 2016.pdf: 2056252 bytes, checksum: 368e99b26e688ce89da00fe5b604b179 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) is a virus of the family Herpesviridae and the subfamily Alphaherpesvirinae, known to cause several diseases worldwide in cattle, including rhinotracheitis, vaginitis, balanoposthitis, abortion, conjunctivitis, and enteritis. O BoHV-1 is a source of economic loss for both dairy and beef producer due to a decrease in dairy production, decrease in animal weight gain, a higher susceptibility to secondary infections, and the occurrences of abortions. Aiming at new alternatives for the treatment and disposal of these cattle pathogen, the photoinactivation becomes a viable alternative because this treatment has shown to be effective against animal and human microorganisms. The technique is based on the synergistic combination of a photosensitizer (PS), oxygen, and light. When irradiated by a light source, the photosensitizer undergoes a series of photophysical processes, which culminate in the generation of reactive oxygen species (ROS), which in large amounts are toxic to pathogens. Aiming at a better efficiency of photoinactivation is necessary to know the characteristics of each photosensitizer, analyzing the molecular structure, quantum yield, lifetime, toxicity, stability, and absorption at specific wavelengths. The irradiation time has shown to be very important because each PS reacts differently at a given time. To evaluate the effect of the electrical charges present on PS, zinc insert ring in the central ring of the molecule and the irradiation time in the photodynamic inactivation, BoHV-1 aliquots were used with initial viral titer from 105.75 incubated for one hour with four different photosensitizers: TPPS4, ZnTPPS4, TMPyP, and ZnTMPYP. Subsequently, they we irradiated for two hours and sampled every 15 minutes. As control, we used virus without any treatment, virus irradiated in the absence of PS, and virus with PS without radiating. After irradiation, the sample was added to cultures of cells permissive to the virus, which was analyzed for the presence of cytopathic effect (CPE), and the results were expressed as viral titers. Although all treatments had significant differences, all PSs used in the study were effective in the treatment of BoHV-1. The ZnTMPYP was the most efficient, fully inactivating the virus with 30 minutes of irradiation, and the TPPS4 showed the worst result unable to inactivate the virus after the period of irradiation, but considerably reduced the viral load of BoHV -1. We also analyzed the photodegradation of a plasmid DNA using the same photosensitizers. Again, ZnTMPYP showed better results. / O herpesvírus bovino 1 (BoHV - 1) é um vírus da família Herpesviridae e da subfamília Alphaherpesvirinae, conhecido por causar diversas doenças em bovinos no mundo todo, incluindo a rinotraqueíte, vaginite, balanopostite, aborto, conjuntivite e enterite. O BoHV - 1 é responsável por grande perda econômica, tanto para produtores de leite quanto de carne, devido a uma diminuição na produção de leite, diminuição na taxa de ganho de peso animal, uma maior susceptibilidade às infecções secundárias e as ocorrências de abortos. Visando novas alternativas para o tratamento e eliminação deste patógeno do rebanho, a fotoinativação se torna uma alternativa viável devido ao fato deste tratamento ter se mostrado eficiente contra vários microrganismos de interesse animal e humano. A inativação fotodinâmica (PDI) é baseada na combinação de três componentes: fotossensibilizador (PS), oxigênio e luz. Ao ser irradiado por uma fonte de luz no comprimento de onda específico, o fotossensibilizador sofre uma série de processos fotofísicos que culminarão na geração de espécies reativas do oxigênio (ROS) que em grandes quantidades são tóxicos a patógenos. Visando uma melhor eficiência da fotoinativação, é necessário conhecer as características de cada fotossensibilizador, analisando a estrutura molecular, rendimento quântico, tempo de vida, toxicidade, estabilidade e absorção em comprimentos de onda específicos. O tempo de irradiação tem se mostrado muito importante, porque cada PS reage de uma maneira diferente em determinado período. Para avaliar a interferência das cargas elétricas presentes nos PS, a inserção de zinco no anel no anel central da molécula e o tempo de irradiação na inativação fotodinâmica, foram utilizadas alíquotas do BoHV-1 com título viral inicial de 105,75, incubadas durante uma hora com quatro diferentes porfirinas como fotossensibilizadores: TPPS4, ZnTPPS4, TMPYP e ZnTMPYP. Posteriormente, foram irradiadas durante duas horas, sendo retiradas amostras a cada 15 minutos. Como controle foram utilizados vírus sem qualquer tipo de tratamento, vírus irradiado sem a presença de PS e vírus com PS sem irradiar. Após a irradiação a amostra foi adicionada em culturas de células permissíveis ao vírus, onde foi analisada a presença de efeito citopático (CPE) e os resultados foram expressos em títulos virais. Apesar de todos os tratamentos possuírem diferenças significativas, todos os PSs utilizados no estudo se mostraram eficazes no tratamento do BoHV-1. A ZnTMPYP foi a mais eficiente, inativando totalmente o vírus com 30 minutos de irradiação, e a TPPS4 apresentou o pior resultado não conseguindo inativar o vírus após o período de irradiação, porém reduziu consideravelmente a carga viral do BoHV-1. Analisamos também a fotodegradação de um DNA plasmidial utilizando os mesmos fotossensibilizadores. Novamente, a ZnTMPYP apresentou melhores resultados.

L'étude de l'influence des pharmacocinétiques de la mTHPC dans la tumeur, le plasma et les leucocytes sur la réponse à la PDT a montré que l'accumulation du photosensibilisant dans les leucocytes exhibaient une bonne corrélation avec l'efficacité de la PDT. Ces résultats suggèrent que les leucocytes pourraient jouer un rôle important dans le mécanisme de la PDT induisant des dommages vasculaires. L'étude de la monomérisation de la mTHPC au cours des interactions avec des protéines plasmatiques démontrent un taux lent de cinétique de désagrégation. La fraction de mTHPC agrégée à l'équilibre et le taux de désagrégation du photosensibilisant dépendent fortement de la teneur en protéines et de la température d'incubation. Les résultats ont démontré la formation d'agrégats libres à grande échelle avec une interaction forte entre les molécules du photosensibilisant. L'analyse cinétique démontre que la mTHPC est caractérisée par des taux très lents de redistribution depuis les complexes avec les protéines plasmatiques. Les faibles taux de redistribution de la mTHPC comparés aux autres photosensibilisants correspondent aux propriétés de liaisons uniques de la mTHPC. L'existence à la fois du transfert de la mTHPC par collision et par milieu aqueux a été supposée. L'étude en microscopie confocale indique des modèles de localisation diffus de la mTHPC à 3h et la formation de taches fortement fluorescentes du photosensibilisant à 24h d'incubation dans des cellules MCF. Les paramètres d'absorption, de temps de durée de vie de fluorescence et de photoblanchiment ont montré qu'à 24h d'incubation la mTHPC est beaucoup plus agrégée qu'à 3h. Le rendement de photoinactivation des cellules est environ 2 fois plus important pour le point à 3h. Une telle différence est attribuée à l'effet des différents états d'agrégation du photosensibilisant et aux interactions avec les composants cellulaires. L'étude théorique et spectroscopique de la mTHPC, la mTHPP et la mTHPBC nous a permis de définir leur structure agrégée dans des milieux aqueux À cette fin, nous avons développé une méthode semi-empirique de mécanique quantique basée sur le calcul des variations spectrales dans différents solvants. La mTHPC et la mTHPP forment des dimères linaires dans les millieux aqueux, tandis que la mTHPBC forme des dimères zigzag.