La prise en compte du microbiote intestinal porcin est une approche de plus en plus considérée dans la qualification des mesures de contrôle des pathogènes alimentaires issus de cette filière de production. Toutefois, ces études, en conditions protégées, sont généralement réalisées in vivo, nécessitent des installations spécialisées, coûteuses en fonctionnement. Une alternative possible à l’utilisation des animaux serait la disponibilité d’un système in vitro mimant le microbiote intestinal cultivé en bioréacteur. Ce projet de recherche vise la mise au point d’un système de culture en bioréacteur pour la production d’un microbiote dérivé du microbiote intestinal porcin, puis la mesure de l’effet de deux huiles essentielles sur le microbiote. Un système, original par son alimentation continue par un digestat d’aliment conventionnel porcin, a été utilisé dans le cadre de ce projet. En effet, ce système est composé de huit réacteurs, dont un réacteur mère permettant la croissance du microbiote qui a été distribué dans les sept réacteurs fils afin de disposer de conditions reproductibles. Les résultats obtenus par séquençage métagénomique 16S par Illumina MiSeq des échantillons démontrent une grande évolution de la composition des échantillons à 48 h par rapport au contenu intestinal utilisé pour l’inoculation. Toutefois, cette variation a diminué considérablement entre 48h et 72h, pour offrir une fenêtre d’analyse de microbiotes complexes d’origine intestinale porcine pour l’évaluation d’additifs alimentaires. Dans le cadre de cette étude, l’introduction de deux huiles essentielles, le Thymol et le Carvacrol, a été testée dans le système à 48h, pour deux concentrations (200 ou 1000 ppm). Les résultats de PCR quantitative ont démontré une augmentation significative des populations de Lactobacilles dans les réacteurs contenant du Thymol à 1000 ppm en 24h (entre l’ajout à 48h et la fin de l’expérience, à 72 h) ou par comparaison avec le réacteur contrôle sans huile à la fin de l’essai, mais aucune différence significative n’a été observée pour le Carvacrol. Toutefois, aucune différence significative n’a été observée au niveau de la composition du microbiote entre les réacteurs comportant des additifs différents. Cette étude a permis le développement d’un système de bioréacteur permettant de maintenir un microbiote dérivé du microbiote intestinal porcin sur 72h, ainsi que sa mise en oeuvre pour mesurer l’effet de l’addition d’une huile essentielle dans un réacteur. / Pig intestinal microbiota is an approach more considered in the foodborne pathogen control qualification in the pig production. However, these studies are commonly conducted in vivo needing specific installation and significant costs. A possible alternative to the use of animals would be the used of an in vitro system to mimic the intestinal microbiota, in a bioreactor. This research project aims to setup a bioreactor system to produce a microbiota derived from the pig intestinal microbiota, and to assess the effect of two essentials oils on this microbiota. The system used in this project is unique by its design, continuously supplied using digested piglet feed as a culture media. This system is composed of eight reactors, including a mother reactor for the growth of the microbiota that was divided between seven daughter reactors to obtain reproducible conditions. Results obtained by 16S metagenomic sequencing using Illumina MiSeq of the samples showed an evolution of the sample composition at 48h compared to intestinal content used for inoculation. However, this variation decreases between 48h and 72h, offering a window for the analysis of food additives effect on the microbiota from piglet origin. In this study, two essentials’ oils, Thymol and Carvacrol, were added to the system at 48h, at a concentration of 200 and 1000 ppm, respectively. Quantitative PCR showed a significant increase of Lactobacilli in reactors containing Thymol at 1000 ppm in 24h (between the addition at 48h and the end of the experiment at 72h) or when comparing with the control reactor without oils at the end of the experiment, but no significative difference was observed for the Carvacrol. However, no significative difference was observed in microbiota composition between the reactors containing the different additives. This study enabled the development of a bioreactor system to maintain a microbiota derived from the pig intestinal microbiota over 72h, and the possibility to assess the effect of essential oils addition in a reactor.

In dieser Dissertation wurden am Ferkelmodell (8-15 kg, drei Gruppen: „Kontrolle“ n=7, „Herz-Lungen-Maschine (HLM)“ n=10, „(-)-Epigallocatechin-3-Gallat (EGCG)“ n=6, die Kontrollgruppe wurde thorakotomiert, die HLM- und die EGCG-Gruppe wurden thorakotomiert und für 90 Minuten an eine HLM angeschlossen, die EGCG-Gruppe erhielt vor und nach der HLM-Zeit EGCG) drei Fragestellungen behandelt: Erstens wurde untersucht, ob die Verwendung einer HLM während eines kardiochirurgischen Eingriffes unter hypothermen Bedingungen mit nicht-pulsatilem Blutfluss und Kardioplegie die Niere schädigte. Dafür wurden Paraffinschnitte der Niere aus der Kontroll- und der HLM-Gruppe mit Hämatoxylin-Eosin (HE) angefärbt und unterschiedliche Strukturen betrachtet, wobei histopathologische Veränderungen in der HLM-Gruppe auffielen. Paraklinisch fanden sich erhöhte nierenspezifische Blutwerte (Serumkreatinin und -harnstoff) in der HLM-Gruppe. Diese Ergebnisse waren hinweisend für eine funktionell relevante Schädigung der Niere durch die HLM. Unterstützend kam ein Absinken des Gesamteiweißes im Serum der HLM-Gruppe hinzu, was auf eine generelle Schädigung des Organismus durch die HLM hindeutete. Zweitens wurde betrachtet, ob die gesetzten Schäden die Merkmale eines Ischämie-Reperfusionsschadens aufwiesen. Hierzu wurden Paraffinschnitte der Niere aus der Kontroll- und der HLM-Gruppe immunhistochemisch (Hypoxie-induzierter-Faktor-1-alpha-Tyramide- Signal-Amplification (HIF-1-alpha-TSA)-, Nitrotyrosin-3-Amino-9-Ethylcarbazol (Nitrotyrosin-AEC)- und Apoptose-induzierender-Faktor-Tyramide-Signal-Amplification (AIF-TSA)-Färbung) angefärbt. Dabei zeigte sich, dass sich die HLM-Gruppe in einer hypoxischen Situation befand (HIF-1-alpha Akkumulation in den Zellkernen), nitrosativem Stress ausgesetzt war (Nitrotyrosin in den Tubuli) und dass sie teilweise so stark geschädigt wurde, dass Apoptose induziert wurde (AIF in Zellkernen) – alle drei Färbungsergebnisse waren hinweisend für einen ischämischen Zustand, in dem sich die HLM-Gruppe befunden hat. Auch die Ergebnisse der durchgeführten renalen Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) deuteten auf ebendies hin. Unterstützend wirkten die Ergebnisse des arteriellen Laktats – die HLM-Gruppe zeigte eine Hyperlaktämie – und die Tatsache, dass einige der histologischen Merkmale für eine frühe Schockniere (welche ischämischen Ursprungs sein kann) in der HLM-Gruppe gefunden wurden. Dies alles zeigte, dass der HLM-assoziierte Nierenschaden vorrangig die Natur eines Ischämie-Reperfusionsschadens aufwies. Drittens wurde untersucht, ob EGCG diese HLM-assoziierte Schädigung abmildern konnte. Dafür wurden bei der EGCG-Gruppe alle oben genannten Untersuchungen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass EGCG in der Dosierung 10 mg/kg eine renoprotektive Wirkung gegen die HLM-assoziierten Schäden hatte, und diese abmildern bzw. ihnen entgegenwirken konnte. Diese Ergebnisse sind für die pädiatrische Kardiochirurgie interessant, welche zum Beispiel bei der Korrektur angeborener Herzdefekte auf die Verwendung der HLM angewiesen ist. Komplikationen wie eine Nierenschädigung post operationem sind nicht selten und verkomplizieren den Verlauf. Die vorliegende Dissertation zeigt das renoprotektive Potential des in grünem Tee vorkommenden Katechins EGCG im Umfeld eines kardiochirurgischen Eingriffes mit Verwendung einer HLM. Die Wirksamkeit dieser Substanz ist wahrscheinlich darin begründet, dass sie mehr als ein Antioxidans ist. Neben seiner Radikalfänger- und Stickstoffmonoxidscavenger-Fähigkeiten ist EGCG außerdem antiapoptotisch wirksam. Derzeit wird die Kardiochirurgie mit Verwendung einer HLM in der Veterinärmedizin nur in wenigen Zentren angewendet. Es besteht für die Zukunft jedoch die Hoffnung, dass gerade für Kleintierbesitzer, die ihre Tiere als Familienmitglied betrachten, und auch für zoologische Einrichtungen bei der Diagnose eines Herzfehlers die Kardiochirurgie mit Verwendung einer HLM als Therapiemöglichkeit eine interessante und realistische Alternative zur bislang angewandten palliativen medikamentösen Therapie darstellen kann. / In this dissertation a piglet model (8-15 kg, three groups: “control” n=7, “extracorporeal circulation (EC)” n=10, “EGCG” n=6, the control-group was thoracotomized, the EC- and the EGCG-group were thoracotomized and underwent cardiopulmonary bypass (CPB) for 90 minutes, and the EGCG-group received EGCG before and after the CPB) is presented. Three questions were raised and answered: Firstly, it was investigated if the use of a CPB during cardiac surgery with hypothermia, non-pulsatile blood flow and cardioplegia caused damage to the kidney. In order to answer this question, paraffin slices of the kidney of the control- and the EC-group were stained with hematoxylin-eosin (HE), and different structures were evaluated – this staining showed histopathological changes in the EC-group. Paraclinical, the EC-group showed elevated kidney-specific blood parameters (serumcreatinine and -urea). These findings indicated a functionally relevant impairment of the kidney caused by the CPB. Supporting this, the EC-group also showed a decline of the total amount of proteins in the serum, which was suggestive of a generalized injury of the body by the CPB. Secondly, it was investigated whether the injury of the kidney might have been caused by an ischemia/reperfusion injury. Therefore, paraffin slices of the kidney of the control- and the EC-group were immunhistochemically stained (hypoxia-induced-factor-1-alpha-tyramidesignal-amplification (HIF-1-alpha-TSA)-, nitrotyrosine-3-amino-9-ethylcarbazole (nitrotyrosine-AEC)- and apoptosis-inducing-factor-tyramide-signal-amplification (AIF-TSA)-staining). These stainings revealed, that the EC-group had suffered from a hypoxemic situation (accumulation of HIF-1-alpha in the nuclei), from nitrosative stress (presence of nitrotyrosine in the tubuli), and that the kidney was partly damaged to the point of an induction of apoptosis (presence of AIF in the nuclei) – all three of these findings indicated, that the kidneys of the EC-group were put into an ischemic situation. The findings of the renal reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) indicated the same thing. This was also supported by the blood parameter of lactate – the EC-group showed a hyperlactemia – and by some histological findings in the EC-group, which were characteristical for an early shock-kidney (which may be caused by ischemia). Taken together, these findings showed that the CPB-associated kidney injury was primarily caused by an ischemia/reperfusion injury. Thirdly, it was investigated, whether EGCG might attenuate the CPB-associated kidney injury. For that purpose, all of the investigation methods mentioned above were carried out with the samples of the EGCG-group. The findings showed that EGCG (dose: 10 mg/kg) had a protective effect on the kidney, protecting it against the damage caused by the CPB, and was able to partly attenuate this damage and partly even fully counteract it. These findings are of interest for pediatric cardiac surgery, which for example for the correction of innate heart defects depends on the use of CPB. Complications – like acute renal injury post operationem – occur frequently and complicate the recovery. This dissertation demonstrates the renoprotective potential of the natural compound EGCG in the setting of cardiac surgery with the use of CPB. The reason for the effectiveness of EGCG in this situation probably is that EGCG is more than an antioxidant. EGCG not only works as a radical- and nitric-oxide-scavenger, but also is antiapoptotic. In veterinary medicine cardiac surgery with CPB is done by few centers only. However for the future there is hope that people – especially pet owners who view their companion animals as family members, and zoos – become more and more willing to and interested in having an animal diagnosed with a heart defect treated with cardiac surgery including the use of an CPB, instead of – like its usually done nowadays – only giving palliative medication to the animal.

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Los receptores β-adrenérgicos (βAR) y de serotonina (5-HT4) median sus efectos en tejidos cardiacos a través de la ruta receptor-Gs-AC-AMPc. Las fosfodiesterasas (PDE) son una amplia familia de enzimas cuya función es la degradación del AMPc. Se desconocía que isoenzimas de PDEs son responsables de la hidrólisis de AMPc en las diferentes regiones cardiacas. El objetivo de esta tesis doctoral es investigar que isoenzimas de PDEs tienen actividad en el miocardio humano, porcino y de roedores. Se han realizado estudios cronotrópicos, inotrópicos, lusitrópicos, bioquímicos y electrofisiológicos. Los principales resultados son: Las PDEs se comportan de manera distinta en las diferentes regiones cardiacas y compartimentos celulares; y La frecuencia basal de nódulo sinusal está controlada por PDEs pero en ninguna especie estudiada las PDEs controlan la taquicardia causada por los βARs y los receptores 5-HT4. La extrapolación de la función de las PDEs al humano debe h acerse con cautela. / Myocardial β-adrenoceptors (βAR) and serotonin receptors (5-HT4) mediate their signals through the receptor-Gs-AC-cAMP pathway. Phosphodiesterases (PDEs) are a large enzyme family that degrade cAMP. It was unknown which PDE isoenzymes are responsible for the hydrolysis of the cAMP in different cardiac regions. The aim of this doctoral thesis is to investigate which isoenzymes have a role in human, porcine and rodent myocardium. We performed chronotropic, inotropic, lusitropic, biochemical and electrophysiological studies. The key results are: PDEs have different roles in different cardiac regions and cellular compartments; and the basal beating rate of the sinoatrial node is controlled by PDE3 and/or PDE4, but these PDEs do not limit the tachycardia mediated through the stimulation of β1AR, β2AR and 5-HT4. Given the diverse roles of PDE3 and PDE4 and their dependence on species, extrapolation to humans should be done cautiously because these animal models usually do not reflect the human myocardium.