Abstract Streptococcus pneumoniae, pneumococcus, is a common cause of respiratory tract infections and also a common inhabitant of the upper respiratory tract of healthy people. At present, 93 different polysaccharide types have been identified and in addition to them, unencapsulated pneumococci are found especially in healthy carriers. Pneumococci are usually identified by using a bacterial culture combined with biochemical or immunochemical tests. Recently, new DNA-based methods, such as PCR, have been applied. Many PCR methods that detect pneumococci are targeted at genes which encode virulence factors such as pneumolysin, autolysin and pneumococcal surface antigen A. S. pneumoniae is a common causative agent of otitis media. In clinical trials, xylitol has been shown to decrease the occurrence of otitis media but the mechanism of action is not known. Xylitol has been shown to reduce pneumococcal growth and adherence to nasopharyngeal cells and its effect on the appearance of the pneumococcal polysaccharide structure has been shown by electron microscopy. Xylitol has also been demonstrated to inhibit biofilm formation of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Biofilms have been associated with otitis media and pneumococci have been shown to form biofilms. The purpose of this work was to study the role of capsular and other virulence genes in pneumococcal infection and biofilm formation. A new PCR method was developed to detect the pneumococcal capsule and it appeared to have potential when studying the pneumococcal etiology of pneumonia. Widely used PCR methods were used to study pneumococcal isolates, and conflicting results were obtained when the results were compared with conventional immunochemical methods. In addition, xylitol was shown to inhibit capsular gene expression and biofilm formation of pneumococci. Glucose and fructose appeared to enhance biofilm formation. The conflicting results between PCR and immunochemical methods suggest that further identification methods are needed in the diagnosis of pneumococcal infection. The observed inhibitory effect of xylitol on pneumococcal capsule gene expression and biofilm formation may partly explain the efficacy of xylitol in preventing acute otitis media in previous clinical trials. / Tiivistelmä Streptococcus pneumoniae, pneumokokki, on yleinen hengitystieinfektioiden aiheuttaja, joka esiintyy myös hengitysteiden normaalifloorassa. Pneumokokilla tunnetaan 93 kapselityyppiä ja näiden lisäksi etenkin oireettomilta nielukantajilta löytyy kapselittomia pneumokokkeja. Pneumokokin tunnistamiseen käytetään yleensä viljelyä sekä bio- ja immunokemiallisia testejä ja sittemmin tunnistuksen tukena on käytetty geeniteknologisia menetelmiä, kuten PCR. Useissa pneumokokin tunnistuksessa käytettävissä PCR-menetelmissä on käytetty kohdegeeninä virulenssitekijöitä, kuten pneumolysiiniä, autolysiinia ja pneumokokin pinta-antigeeni A:ta koodaavia geenejä. Pneumokokki on yleinen korvatulehdusten aiheuttaja. Kliinisissä tutkimuksissa ksylitolin on havaittu vähentävän korvatulehduksia, mutta vaikutusmekanismi on vielä epäselvä. Ksylitolin on osoitettu vähentävän pneumokokin kasvua ja kiinnittymistä nenänielun soluihin ja sen vaikutus polysakkaridikapselin ulkomuotoon on osoitettu elektronimikroskopialla. Ksylitolin on myös todettu vähentävän biofilminmuodostusta Staphylococcus aureus, ja Pseudomonas aeruginosa –bakteereilla. Biofilmin muodostuksen on ehdotettu liittyvän krooniseen korvatulehdukseen. Aiemmissa tutkimuksissa pneumokokin on osoitettu muodostavan biofilmejä. Työn tarkoituksena oli tutkia kapseli- ja muiden virulenssigeenien merkitystä pneumokokki-infektion diagnostiikassa ja biofilminmuodostuksessa. Työssä kehitettiin uusi PCR-menetelmä pneumokokin kapselin osoittamiseksi ja sillä todettiin olevan käyttömahdollisuuksia keuhkokuumeen pneumokokkietiologiaa tutkittaessa. Yleisesti käytettyjä PCR-menetelmiä tutkittiin pneumokokki-isolaateilla ja havaittiin vakavia ristiriitoja näiden ja perinteisten, immunokemiallisten tunnistusmenetelmien välillä. Lisäksi tutkimuksessa havaittiin ksylitolin vähentävän pneumokokin kapseligeenien ekspressiota ja biofilmin muodostusta. Sen sijaan glukoosi ja fruktoosi lisäsivät biofilmin muodostusta. Tutkimustulokset osoittivat ristiriidan perinteisten immunokemiallisten ja PCR-menetelmien välillä ja antavat aihetta uusien, tarkempien menetelmien käyttöönotolle pneumokokki-infektion diagnostiikassa. Tutkimuksen havainnot ksylitolin vaikutuksesta pneumokokin kapseligeeniekspressioon ja biofilmin muodostukseen voivat osittain selittää kliinisissä tutkimuksissa havaittua ksylitolin ehkäisevää vaikutusta korvatulehduksiin.

Abstract The aims of this work were to study the carriage of respiratory bacteria and to identify risk factors affecting pharyngeal colonisation by these pathogens among young Finnish men during military service, and also to investigate the role of mannose-binding lectin (MBL) concentrations and MBL2 gene polymorphisms in the carriage of respiratory bacteria. A total of 892 military recruits entering the Kainuu Brigade, including 224 men with asthma, were followed up prospectively to the end of their military service. Carriage of Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis and beta-haemolytic streptococci appeared to be higher during and at the end of military service than at the beginning. Smoking was found to be a significant risk factor for colonisation by these bacteria. S.pneumoniae was more common in the asthmatic than military conscripts in the non-asthmatic ones at the beginning of military service. A low MBL level increased the risk of carrying N. meningitidis and beta-haemolytic streptococci during military service among non-smokers but not among smokers. Low MBL levels producing MBL2 haplotypes seemed to be associated with the carriage of N. meningitidis and S. pneumoniae. Characterisation of all the oropharyngeal N.meningitidis isolates obtained (n=215) by phenotypic and genotypic methods showed that most of them belonged to the carriage-associated ST-60 clonal complex. Clonal complexes ST-41/44, ST-32, and ST-23, which have previously been associated with disease, also accounted for a third of the carriage strains. Furthermore, a significant association was indicated between an acute upper respiratory infection and oropharyngeal carriage of the virulent meningococcal ST-23 clone. In conclusion, the results reported here show a significant increase in bacterial carriage during military service and provide new information on the association between MBL and carriage of respiratory bacteria. These findings also highlight the importance of smoking cessation, especially among military conscripts, who have been found to be a risk group for invasive bacterial diseases, and they also point to the importance of meningococcal vaccination for military recruits and the need for an efficacious vaccine against serogroup B meningococci. / Tiivistelmä Hengitystieinfektiot ovat yleisiä varusmiespalvelun aikana. Myös oireeton bakteerien nielukantajuus on lisääntynyt. Useimmiten infektiot ovat lieviä virusinfektioita, mutta bakteerien nielukantajuus voi johtaa myös vaikeisiin bakteeritulehduksiin. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia bakteerien nielukantajuutta varusmiespalveluksen alkaessa ja päättyessä sekä mahdollisten hengitystieinfektioiden aikana ja näin saada uutta tietoa bakteerien nielukantajuuteen vaikuttavista tekijöistä. Lisäksi tavoitteena oli selvittää mannoosia sitovan lektiinin (MBL) sekä MBL2-geenin polymorfismien yhteyttä bakteerien nielukantajuuteen. Työn tarkoituksena oli myös feno- ja genotyypittää varusmiehiltä palveluksen aikana eristetyt meningokokkikannat ja verrata niitä vastaavana ajankohtana invasiivista tautia sairastaneista henkilöistä eristettyihin meningokokkikantoihin. Tutkimuksessa seurattiin prospektiivisesti 892 varusmiestä, jotka suorittivat asepalveluksen Kainuun Prikaatissa vuosina 2004–2006. Tutkimukseen osallistuneista varusmiehistä 224:llä oli astma. Tutkimuksessa havaittiin, että oireeton bakteerien nielukantajuus lisääntyy merkitsevästi varusmiespalveluksen aikana. Lisäksi havaittiin, että tupakointi oli merkittävä itsenäinen riskitekijä pneumokokin, meningokokin sekä beta-hemolyyttisten streptokokkien nielukantajuudelle varusmiespalveluksen aikana. Astmaatikkojen pneumokokin nielukantajuus varusmiespalveluksen alussa oli yleisempi kuin terveiden varusmiesten. Tutkimuksessa osoitettiin myös pienen seerumin MBL-pitoisuuden sekä MBL2-geenin polymorfismin eksoni 1:n alueella ja geenin säätelyalueella olevan riskitekijöitä meningokokin, pneumokokin sekä beta-hemolyyttisten streptokokkien nielukantajuudelle tupakoimattomilla varusmiehillä. Meningokokin nielukannoista jopa kolmasosa kuului genotyyppiryhmään, jonka on aiemmissa tutkimuksissa havaittu liittyvän invasiiviseen tautiin. Tutkimuksessa osoitettiin myös tietyn hyperinvasiivisen meningokokin genotyypin (ST-23) liittyvän hengitystieinfektioepisodeihin. Tässä väitöskirjatyössä osoitettiin, että bakteerien nielukantajuus lisääntyy merkitsevästi varusmiespalveluksen aikana ja että oireettomilla varusmiehillä tavataan myös hyperinvasiivisia meningokokkikantoja. Tutkimus antoi myös uutta tietoa hyperinvasiivisten meningokokin genotyyppien liittymisestä hengitystieinfektioihin sekä MBL:n vaikutuksesta bakteerien nielukantajuuteen. Tutkimushavainnot tukevat tupakoimattomuuden edistämisen tärkeyttä myös varusmiespalveluksen aikana.