Abstract Streptococcus pneumoniae, pneumococcus, is a common cause of respiratory tract infections and also a common inhabitant of the upper respiratory tract of healthy people. At present, 93 different polysaccharide types have been identified and in addition to them, unencapsulated pneumococci are found especially in healthy carriers. Pneumococci are usually identified by using a bacterial culture combined with biochemical or immunochemical tests. Recently, new DNA-based methods, such as PCR, have been applied. Many PCR methods that detect pneumococci are targeted at genes which encode virulence factors such as pneumolysin, autolysin and pneumococcal surface antigen A. S. pneumoniae is a common causative agent of otitis media. In clinical trials, xylitol has been shown to decrease the occurrence of otitis media but the mechanism of action is not known. Xylitol has been shown to reduce pneumococcal growth and adherence to nasopharyngeal cells and its effect on the appearance of the pneumococcal polysaccharide structure has been shown by electron microscopy. Xylitol has also been demonstrated to inhibit biofilm formation of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Biofilms have been associated with otitis media and pneumococci have been shown to form biofilms. The purpose of this work was to study the role of capsular and other virulence genes in pneumococcal infection and biofilm formation. A new PCR method was developed to detect the pneumococcal capsule and it appeared to have potential when studying the pneumococcal etiology of pneumonia. Widely used PCR methods were used to study pneumococcal isolates, and conflicting results were obtained when the results were compared with conventional immunochemical methods. In addition, xylitol was shown to inhibit capsular gene expression and biofilm formation of pneumococci. Glucose and fructose appeared to enhance biofilm formation. The conflicting results between PCR and immunochemical methods suggest that further identification methods are needed in the diagnosis of pneumococcal infection. The observed inhibitory effect of xylitol on pneumococcal capsule gene expression and biofilm formation may partly explain the efficacy of xylitol in preventing acute otitis media in previous clinical trials. / Tiivistelmä Streptococcus pneumoniae, pneumokokki, on yleinen hengitystieinfektioiden aiheuttaja, joka esiintyy myös hengitysteiden normaalifloorassa. Pneumokokilla tunnetaan 93 kapselityyppiä ja näiden lisäksi etenkin oireettomilta nielukantajilta löytyy kapselittomia pneumokokkeja. Pneumokokin tunnistamiseen käytetään yleensä viljelyä sekä bio- ja immunokemiallisia testejä ja sittemmin tunnistuksen tukena on käytetty geeniteknologisia menetelmiä, kuten PCR. Useissa pneumokokin tunnistuksessa käytettävissä PCR-menetelmissä on käytetty kohdegeeninä virulenssitekijöitä, kuten pneumolysiiniä, autolysiinia ja pneumokokin pinta-antigeeni A:ta koodaavia geenejä. Pneumokokki on yleinen korvatulehdusten aiheuttaja. Kliinisissä tutkimuksissa ksylitolin on havaittu vähentävän korvatulehduksia, mutta vaikutusmekanismi on vielä epäselvä. Ksylitolin on osoitettu vähentävän pneumokokin kasvua ja kiinnittymistä nenänielun soluihin ja sen vaikutus polysakkaridikapselin ulkomuotoon on osoitettu elektronimikroskopialla. Ksylitolin on myös todettu vähentävän biofilminmuodostusta Staphylococcus aureus, ja Pseudomonas aeruginosa –bakteereilla. Biofilmin muodostuksen on ehdotettu liittyvän krooniseen korvatulehdukseen. Aiemmissa tutkimuksissa pneumokokin on osoitettu muodostavan biofilmejä. Työn tarkoituksena oli tutkia kapseli- ja muiden virulenssigeenien merkitystä pneumokokki-infektion diagnostiikassa ja biofilminmuodostuksessa. Työssä kehitettiin uusi PCR-menetelmä pneumokokin kapselin osoittamiseksi ja sillä todettiin olevan käyttömahdollisuuksia keuhkokuumeen pneumokokkietiologiaa tutkittaessa. Yleisesti käytettyjä PCR-menetelmiä tutkittiin pneumokokki-isolaateilla ja havaittiin vakavia ristiriitoja näiden ja perinteisten, immunokemiallisten tunnistusmenetelmien välillä. Lisäksi tutkimuksessa havaittiin ksylitolin vähentävän pneumokokin kapseligeenien ekspressiota ja biofilmin muodostusta. Sen sijaan glukoosi ja fruktoosi lisäsivät biofilmin muodostusta. Tutkimustulokset osoittivat ristiriidan perinteisten immunokemiallisten ja PCR-menetelmien välillä ja antavat aihetta uusien, tarkempien menetelmien käyttöönotolle pneumokokki-infektion diagnostiikassa. Tutkimuksen havainnot ksylitolin vaikutuksesta pneumokokin kapseligeeniekspressioon ja biofilmin muodostukseen voivat osittain selittää kliinisissä tutkimuksissa havaittua ksylitolin ehkäisevää vaikutusta korvatulehduksiin.

Abstract Urinary tract infections (UTIs) are among the most common bacterial infections in childhood and have a tendency to recur. The ability of uropathogens to form biofilm may be important in the pathogenesis of UTI. Although childhood UTIs are thought to increase the risk of chronic kidney disease (CKD), evidence showing this association is scarce. Cranberry juice has been shown to prevent UTIs in women, but evidence of its efficacy in children is lacking. The aim of this work was to evaluate the significance of biofilm formation for the clinical presentation of UTI, the long-term consequences of UTI in childhood and the efficacy, safety and acceptability of cranberry juice in the prevention of UTIs in children. The formation of biofilm in clinical samples was assessed in vitro with optical density measurements and verified by scanning electron microscopy and confocal scanning laser microscopy. A systematic literature search on the association between childhood UTIs and CKD was conducted, and data on patients with CKD treated or monitored at Oulu University Hospital were reviewed. The efficacy of cranberry juice in preventing recurrences of UTIs in children and its effects on the normal flora were evaluated with two randomized controlled trials. About one third of the uropathogenic E. coli strains were capable of forming biofilm, and the strains isolated from patients having pyelonephritis formed biofilm better than those from cystitis cases. We did not find any cases among the 1576 reviewed in the literature search or the 366 in our patient series who had structurally normal kidneys in their first kidney imaging and in whom childhood UTIs could have been the cause of subsequent CKD. The aetiological fraction of childhood UTIs as a cause of CKD was at most 0.3%. The administering of cranberry juice did not reduce the number of children who experienced a recurrence of UTI, but it did reduce the number of recurrences per person year at risk by 39% (0.25 vs. 0.41 episodes, 95% CI for difference -0.31 to -0.01) and the number of days on antimicrobials per patient year by 34% (11.6 vs. 17.6 days, 95% CI for difference -7 to -5). Cranberry juice was well accepted and tolerated by the children and did not cause harmful changes in the normal flora. The ability of bacteria to persist and grow in a biofilm seems to be one of the significant factors in the pathogenesis of UTIs. A child with normal kidneys is not at risk of developing CKD because of UTIs in childhood, so that imaging procedures after the first UTI can be focused on finding severe urinary tract abnormalities. Taking into account the relatively innocent nature of childhood UTIs, cranberry juice offers an alternative to antimicrobials for preventing UTIs in children. The mechanism of action of cranberry juice may be associated with biofilm formation by uropathogens. / Tiivistelmä Virtsatieinfektio (VTI) on yksi tavallisimpia lasten bakteeri-infektioita, ja sillä on taipumus uusiutua. Bakteerien biofilminmuodostuskyky voi olla merkittävä tekijä VTI:n synnyssä. Lapsuudessa sairastetun VTI:n ajatellaan lisäävän kroonisen munuaisten vajaatoiminnan riskiä, mikä ei kuitenkaan perustu tieteelliseen näyttöön. Karpalomehu ehkäisee aikuisten naisten VTI:n uusiutumisia, mutta sen tehoa lapsilla ei tiedetä. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli selvittää bakteerien biofilminmuodostuskyvyn yhteyttä VTI:n kliiniseen kuvaan, lapsuudessa sairastetun VTI:n pitkäaikaisvaikutuksia sekä karpalomehun tehoa, turvallisuutta ja käyttökelpoisuutta lasten VTI:n ehkäisyssä. Kliinisistä virtsanäytteistä viljeltyjen E. coli –kantojen muodostama biofilmi mitattiin optisen tiheyden perusteella, ja elävien biofilmirakenteiden muodostuminen varmistettiin elektronimikroskooppi- ja konfokaalimikroskooppikuvauksilla. Lapsena sairastetun VTI:n yhteyttä munuaisten vajaatoimintaan tutkittiin systemaattisella kirjallisuuskatsauksella ja selvittämällä OYS:ssa munuaisten vajaatoiminnan vuoksi hoidossa olevien potilaiden munuaissairauden etiologia. Karpalomehun tehoa, turvallisuutta ja käyttökelpoisuutta lasten VTI:n ehkäisyssä selvitettiin kahdella lumekontrolloidulla tutkimuksella. Kolmasosa E. coli –kannoista muodosti biofilmiä, ja pyelonefriittipotilailta eristetyt kannat olivat parempia biofilminmuodostajia kuin kystiittipotilailta eristetyt. Kirjallisuuskatsauksen 1576:n ja OYS:n 366:n tapauksen joukossa ei ollut potilaita, joilla olisi ollut ensimmäisessä kuvantamistutkimuksessa rakenteeltaan normaalit munuaiset ja lapsuuden VTI:t olisivat johtaneet munuaisten vajaatoimintaan. Lapsuuden VTI:n etiologinen fraktio munuaisten vajaatoiminnan syynä oli teoriassakin korkeintaan 0.3 %. Karpalomehu ei vähentänyt uusintainfektion saaneiden lasten määrää, mutta se vähensi uusintaepisodeja 39 % riskiaikaa kohti (0,25/vuosi vs. 0,41/vuosi) ja antibioottipäiviä 34 % potilasvuotta kohti (11,6 vs. 17,6 päivää). Lapset joivat karpalomehua mielellään, eikä sillä ollut haitallisia vaikutuksia normaaliflooraan. Aiheuttajabakteerien biofilminmuodostuskyky vaikuttaa olevan merkittävä tekijä VTI:n patogeneesissä. Lapsi, jolla on rakenteellisesti normaalit munuaiset, ei ole lapsuuden VTI:n vuoksi riskissä sairastua munuaisten vajaatoimintaan. Siten ensimmäisen VTI:n jälkeiset kuvantamistutkimukset voidaan suunnata toteamaan vaikeat rakenteelliset poikkeavuudet. Koska lapsuuden VTI on suhteellisen vaaraton sairaus, karpalomehu on hyvä vaihtoehto VTI:n ehkäisyyn myös lapsilla. Biofilminmuodostuksen esto on sen yksi mahdollinen vaikutusmekanismi.

Abstract Periodic fever, aphthous stomatitis, pharyngitis, and adenitis (PFAPA) is a syndrome characterized by regular, high-fever episodes with healthy periods in between. In a classic phenotype of the syndrome, the fevers begin in childhood before the age of five, and fever flares are accompanied by aphthous stomatitis, pharyngitis, and/or cervical adenitis. The etiology of the syndrome is unknown, but tonsillectomy (TE) has been shown to be an effective treatment for the disease. The purposes of this study were as follows: (1) to assess the long-term outcome of PFAPA patients treated by TE with either the classic or incomplete phenotype (later onset of the disease and/or missing oropharyngeal symptoms), (2) to compare the health and growth of PFAPA patients with healthy controls, and (3) to compare the histological and microbiological findings of the tonsils of PFAPA patients with controls via conventional and modern sequencing technologies. In this approximately 9-year follow up, 97% (n = 56) of patients with the classic phenotype and all patients (n = 50) with the incomplete phenotype achieved a prompt and constant response after TE. There were no differences in either the length of fever episodes or flares between patients with both the classic and incomplete phenotypes. The health and growth of 119 PFAPA patients was compared to that of sex- and age-matched controls (n = 230), and no differences in prevalence of chronic diseases or growth were found between the groups. Infections, oral thrush, and pollen allergy were more common in the history of the PFAPA patients than in the controls. Microbiological and histological findings of the tonsils of PFAPA patients (n = 31) were compared with the findings of the controls (n = 24) who had undergone TE for other reasons. Biofilm formation and Candida albicans were more frequently found among PFAPA patients than the controls, but Staphylococcus aureus, varicella zoster, and herpes simplex viruses were more common in the controls. While comparing the bacterial microbiota between the groups, we found significant differences in the presence and relative abundance of many bacteria. For example, Cyanobacteria were more common and abundant in the case samples than in the controls. Because the long-term outcome after TE was excellent, both in classic and incomplete PFAPA patients; a new diagnostic criteria for the syndrome is proposed. The microbes of the tonsils in PFAPA patients differ from that of the controls, which may play an important role in triggering the inflammatory processes that lead to symptoms of PFAPA. / Tiivistelmä Periodic fever, aphthous stomatitis, pharyngitis, adenitis (PFAPA) syndrooma, on oireyhtymä, jossa potilaat kärsivät hyvin säännöllisesti ilmaantuvista, toistuvista kuumejaksoista, joiden välillä potilaat ovat terveitä. Klassisessa tautimuodossa kuumeilut alkavat lapsuudessa ennen viiden vuoden ikää ja kuumevaiheeseen liittyy liitännäisoireita: suun limakalvojen rakkuloita, nielutulehdusta ja/tai kaulan imusolmukkeiden suurentumista. Oireyhtymän syytä ei tiedetä, mutta nielurisaleikkaus (TE) on osoittautunut tehokkaaksi hoidoksi. Tutkimuksen tarkoituksena oli (1) arvioida PFAPA potilaiden vointia pitkäaikaisseurannassa TE:n jälkeen ja vertailla taudinkuvaa niiden PFAPA potilaiden välillä, joilla oli klassinen PFAPA tai epätyypillinen PFAPA. (2) Lisäksi tutkimme myös TE:lla hoidettujen PFAPA potilaiden sairastuvuutta, yleistä terveydentilaa ja kasvua vertaamalla näitä sukupuoli- ja ikävakioituihin kontrolleihin ja (3) selvitimme mikrobiologisia ja histologisia löydöksiä PFAPA potilaiden nielurisoissa verrattuna muista syistä TE:ssa käyneiden lasten nielurisoihin. Tässä noin yhdeksän vuoden seurannassa TE:n jälkeen oli täysin parantunut 97% (n = 56) potilaista, joilla oli klassinen PFAPA, ja kaikki (n = 50) potilaat, joilla oli epätyypillinen PFAPA (tauti oli alkanut viiden ikävuoden jälkeen ja/tai klassiset liitännäisoireet puuttuivat). Kuumeprofiilit eivät muilta osin eronneet ennen nielurisaleikkausta näissä ryhmissä. PFAPA potilaiden (n = 119) kasvu ja yleinen terveydentila eivät eronneet väestökontrolleista (n = 230). Krooniset ja autoimmuunisairaudet olivat yhtä harvinaisia molemmissa ryhmissä. Potilaat raportoivat sairastaneensa enemmän infektioita ja sammasta lapsuudessa ja heillä oli enemmän siitepölyallergioita. PFAPA potilaiden (n = 31) ja muista syistä TE:ssa käyneiden lasten (n = 24) nielurisojen mikrobiologiaa ja histologiaa tutkittiin ja vertailtiin. Biofilmimuodostusta nielurisan pinnalla ja Candida albicansia löytyi enemmän tapauksilta kuin kontrolleilta, kun taas Staphylococcus aureusta, varicella zoster- ja herpes simplex -viruksia tavattiin enemmän kontrolleilla. Myös mikrobiomi erosi ryhmien välillä, esimerkiksi syanobakteerit olivat yleisempiä PFAPA risoissa kuin kontrolleilla. Klassisten ja epätyypillisten PFAPA potilaiden terveydentila TE:n jälkeen oli pitkäaikaisseurannassamme erinomainen ja siksi ehdotamme, että PFAPA –syndrooman diagnostisia kriteereitä tulisi muuttaa. Nielurisojen mikrobisto on erilainen kontrolleihin verrattuna ja tällä voi olla merkitystä PFAPA syndrooman inflammatorisessa prosessissa.