Contexte : Les tests de marche de 6 minutes (TM6) et de stepper de 6 minutes (TS6) permettent d’évaluer et de suivre en routine la tolérance à l’effort des patients porteurs pneumopathies interstitielles idiopathiques fibrosantes (PII-f). En général, les programmes de réhabilitation respiratoire (RR), améliorent la tolérance à l’effort et la performance à ces tests, la qualité de vie et les symptômes chez les patients atteints de PII-f, qu’ils soient réalisés en centre ou au domicile des patients. Peu d’études rapportent un maintien des bénéfices de la RR plusieurs mois après la fin de celle-ci chez les patients PII-f.Objectif : L’objectif général de la thèse était d’évaluer comparativement les adaptations cardioventilatoires au TM6 et TS6 chez les patients PII-f à différentes étapes de leur prise en charge en RR (pré et post-RR). Nous avions également pour objectif majeur d’évaluer la faisabilité et l’efficacité d’un programme de maintenance réalisé dans des structures proposant des activités physiques adaptées (APA) proches du domicile des patients PII-f sur le maintien des bénéfices à six mois post-RR.Matériel et méthodes : L’ensemble des patients atteints de PII-f ont réalisé un programme de RR au domicile de 8 semaines. Durant la période de suivi post-RR, les patients avaient le choix de bénéficier d’un suivi en APA dans une structure extérieure au domicile (groupe APA) ou de continuer la pratique d’une activité physique régulière en autonomie (groupe contrôle). Pré et post-RR, nous avons mesuré la tolérance à l’effort (TM6 et TS6) avec mesure des paramètres cardioventilatoires, les fonctions pulmonaires, la qualité de vie, la dyspnée, l’anxiété/dépression et la motivation des patients. Ces évaluations ont été réalisées aussi après 6 et 9 mois de suivi post-RR.Résultats : Parmi les 21 patients PII-f recrutés, 19 PII-f ont réalisé le programme de RR et sont revenus pour l’évaluation après 6 mois de suivi. Le TM6 et le TS6 induisent des adaptations cardioventilatoires différentes chez les patients atteints de PID, notamment une réponse ventilatoire supérieure au TS6 susceptible de jouer un rôle important sur la moindre désaturation en O2 observée comparé au TM6. A la suite d’un programme de RR, nous avons observé une amélioration des capacités physiques chez les patients PII-f. De manière individuelle, cependant, 58% des patients ne s’amélioraient pas post-RR, et 32% ne continuaient pas de pratiquer régulièrement les exercices physiques recommandés post-RR. La mise en place d’un programme de maintenance dans différentes structures locales proposant des APA proches du domicile chez des patients PII-f est réalisable et permet d’optimiser le maintien des bénéfices post-RR, qu’ils soient répondeurs ou non-répondeurs à la RR.Conclusion : Nos travaux ont souligné l’importance du choix du test d’effort, de la typologie de la PII-f et de la sévérité de l’hypoxémie sur les adaptations cardioventilatoires à l’effort, les adaptations physiologiques et l’évolution de la tolérance à l’effort post-RR. De plus, nous avons constaté que la réalisation de programmes de maintenance en APA, en s’appuyant sur des structures locales est réalisable et favorise un maintien des bénéfices à long terme chez les patients PII-f. Ainsi, l’évaluation des freins à l’activité physique chez un tiers des patients PII-f qui reste non-observant et arrête la pratique d’exercices physiques post-RR, est ainsi d’actualité. De plus, étudier plus précisément les différents profils de patients PII-f (répondeurs/non-répondeurs) pourrait être intéressant afin de comprendre les mécanismes potentiellement responsables de l’absence d’amélioration des capacités physiques post-RR chez les patients non-répondeurs, qu’elle soit liée à la pathologie, la médication ou une éventuelle pathologie musculaire associée. / Context: The 6-minute walk test (6MWT) and 6-minute stepper test (6MST) are routinely performed to measure and monitor exercise tolerance in patients with fibrosis interstitial idiopathic pneumonia (f-IIP). In those patients, exercise capacity, quality of life and symptoms are usually improved after a pulmonary rehabilitation (PR) program which can either be performed in a rehabilitation centre or at home.Aim: First, we aimed, to compare the cardio-pulmonary adaptations during a 6MWT and a 6MST in patients with f-IIP, before and after PR. We aimed to assess patients’ adhesion to physical activity maintenance programs which are offered and located near the f-IIP patient's homes. And their efficiency in maintaining benefits observed post-PR.Methods: All the f-IIP patients included followed a 8-week PR program at home. During the post-PR follow-up period, patients voluntarily chose to perform physical activity in a structure proposed by the investigator (APA group), or by themselves at home (control group). Before and after the PR program, we quantified the patient's exercise capacity (6MWT and 6MST) and measured cardiopulmonary parameters during both tests, pulmonary function at rest, quality of life, dyspnoea at rest and after each exercise, anxiety/depression and patients’ motivation. The same evaluations were repeated at 6 and 9 months post-PR.Results: Among the 21 recruited f-IIP patients, 19 finished the PR program and had an evaluation at 6 months post-PR. The 6MST was characterized by a higher minute ventilation compared with the 6MWT, and this may have contributed to the lower O2 desaturation also observed during the 6MST. Following the PR program, there was a mean improvement of exercise tolerance in f-IIP patients. However, among the patients, 58% showed no improvement in the 6MWT distance post-PR nor in the cardiorespiratory parameters during the test, and 32% did not continue to practise a regular physical activity post-PR. Finally, the individual support from the investigators for the patients to follow a maintenance program in local structures, near the f-IIP patient's home, probably contributed to their voluntary inscription in these programs, which allowed the patients to maintain the post-PR benefits, whether they patients initially responded to the PR program or not.Conclusion: Our works emphasized the importance of selecting an appropriate test, according to the fixed objective; of the f-IIP clinicopathological entities, and of the hypoxemia severity on exercise cardiorespiratory and physiological adaptations and changes of exercise tolerance post-PR. Moreover, we observed that patients from the APA group regularly attended the chosen physical maintenance program in local structures, which contributed to the maintenance the post-PR benefits in f-IIP. The evaluation of physical activity engagement barriers, that lead to the non-participation of a third of f-IIP patients to physical activities post-PR, remains to be conducted. Further studies should also focus on the explanation for the absence of improvement of exercise tolerance and cardiorespiratory parameters in about half of f-IIP patients post-RR, either due to their pathology, medication, or possible muscle disorders.

Les pneumopathies d'hypersensibilité sont des maladies respiratoires liées à l'inhalation répétée de substances antigéniques. Le diagnostic nécessite la présence d'un ensemble d'arguments cliniques, radiologiques, fonctionnels et immunologiques car les symptômes sont peu spécifiques. La mise en évidence d'immunoglobulines G (IgG) spécifiques des agents étiologiques est un élément essentiel dans la prise en charge diagnostique et thérapeutique. L'objectif de ce travail de thèse était d'identifier des protéines bactériennes et fongiques reconnues par les IgG des patients atteints de la maladie du poumon de fermier (PDF) et du poumon de mécanicien (FDM), et de produire ces protéines de façon recombinante afin de développer des tests sérologiques standardisés de type ELISA. Deux micro-organismes impliqués dans le PDF (Saccharopolyspora rectivirgula et Eurotium amstelodami, un Aspergillus), et un micro-organisme impliqué dans le PDM (Mycobacterium immunogenum) ont été étudiés. L'approche immunoprotéomique développée a permis de sélectionner les protéines d'intérêt, puis de produire les antigènes recombinants correspondants par génie génétique. Des sérums de patients PDF, PDM et de témoins exposés ont été recueillis dans le cadre de protocoles cliniques multicentriques. Les performances (sensibilité, spécificité, aire sous la courbe) des tests ELISA-IgG utilisant les antigènes recombinants produits ont été évaluées par l'analyse en courbe ROV (Receiver operating characteristics). A partir des trois micro-organismes étudiés, 71 protéines immuno-réactives ont été identifiées et 28 protéines recombinantes ont été produites et testées en ELISA. Pour le diagnostic du PDM, deux antigènes recombinants, la dihydrolipoyl déshydrogénase and Facyl-CoA déshydrogénase, étaient particulièrement performants avec une sensibilité de 90% lorsqu'ils étaient utilisés en combinaison. Pour le diagnostic du PDF, deux antigènes recombinants à'Aspergillus, la Glu/Leu/Phe/Val déshydrogénase et la glucose-6-phosphate isomérase, ont permis d'obtenir une sensibilité de 89% et une spécificité de 84%. L'utilisation de trois antigènes recombinants de S. rectivirgula,SRl¥A (protéine de fonction inconnue), SRI? (catalase) et SR22 (kétol acide réducto-isomérase), ont permis d'obtenir une sensibilité et spécificité optimales de 83% et 77%. Les protéines identifiées étaient majoritairement des protéines enzymatiques, dont certaines ont été mis en évidence comme facteurs de virulence dans d'autres pathologies. Des études complémentaires, sur des modèles animaux et sur des modèles cellulaires, devront être mennées pour explorer l'implication de ces protéines dans l'induction de la maladie. Ce travail a permis d'améliorer les connaissances sur les protéines bactériennes et fongiques reconnues par les anticorps des patients atteints de PDF et de PDM, de développer des antigènes recombinants, et de mettre au point des tests sérologiques standardisés et performants. Ces tests pourront faire l'objet d'une valorisation vers l'industrie. En effet, les sérologies pour le diagnostic des PHS sont des demandes courantes dans les laboratoires d'analyse médicale. / The hypersensitivity pneumonitis is a pulmonary disease caused by repetitive inhalation of antigens. The diagnosis requires clinical, radiological, functional and immunological features because of unspecific symptoms. The identification of specifie antibodies to causative antigens is an essential way for the diagnosis and therapeutic management.The aims of this thesis work were to identify bacterial and fungal immunogenic proteins specifie to patient with farmer's lung (FL) and machine operator's lung (MOL) diseases, to synthesize specifie recombinant antigens for the development of a standardized ELISA. Two microorganisms involved in FL (Saccharopolyspora rectivirgula and Eurotium amstelodami (Aspergillus sp)), and one involved in MOL had been srudied. The immunoproteomics approach has permit to select interesting proteins and to synthesize recombinant antigens by genomics techniques. The sera from FL patients (n=52), MOL patients (n=16) and sera from exposed control subjects were recruited. ELISA-IgG using recombinant antigens efficacies were evaluated by Receiver operating characteristics analysis (sensitivity, specifïcity, area under the curve).From the three srudied microorganisms, 71 immunogenic proteins were identified and 28 recombinant antigens were produced and tested by ELISA. For the MOL diagnosis, the recombinants dihydrolipoyl dehydrogenase and acyl-CoA dehydrogenase were useful with a sensitivity of 90% when used in combination. For the FL diagnosis, two recombinant proteins from Aspergillus, Glu/Leu/Phe/Val dehydrogenase and glucose-6-phosphate isomerase had a sensitivity of 89% and a specifïcity of 84%. A combination of the three recombinant antigens from S. rectivirgula, SRI FA (unknown function), SRI 7 (catalase) and SR22 (ketol acid reductoisomerase) allowed to obtain a sensitivity of 83% and a specificity of 77%. The immunogenic proteins were mainly enzymes, and some of these have been implicated in important functions for survival or the virulence of others pathogens. Further studies are required to determine the role of these proteins in immunological or virulence processes by animal and cellular model application. This present work has improved our knowledge about bacterial and fungal proteins recognized by FL and MOL patient's antibodies, and to develop useful standardized serological tests with new recombinant antigens. These tests could be exported to the health management in industry. Indeed, hypersensitivity pneumonitis serodiagnosis tests are common requests in medical analysis laboratories

Les mutations du gène codant pour la protéine C (SP-C) du surfactant pulmonaire (SFTPC) sont à l’origine de pathologies interstitielles chroniques du nourrisson, de l’enfant mais également de l’adulte. Une importante hétérogénéité phénotypique est cependant observée, y compris au sein d’une même famille. Par un épissage alternatif, le gène SFTPC permet la synthèse de deux isoformes du précurseur protéique de SP-C (proSP-C) pour aboutir à la protéine mature après plusieurs modifications post-traductionnelles. Les conséquences des mutations de SFTPC sur l'homéostasie du surfactant ne sont pas clairement élucidées, mais il semble que le mauvais repliement de la protéine soit une caractéristique commune. A l’issue de nos travaux antérieurs, nous avons mis en évidence un effet de certaines mutations et de polymorphismes sur l’épissage de SFTPC faisant ainsi varier significativement l’expression de chacune des deux isoformes protéiques, sans qu’à l’heure actuelle nous ne connaissions le rôle de chacune dans la synthèse de la protéine SP-C mature. Notre projet, s’inscrivant dans la continuité de mon master 2, a pour but de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques pré et post-transcriptionnels associés aux variations de SFTPC et leurs conséquences sur le développement des pneumopathies interstitielles. Le premier axe de notre projet repose sur l’étude in vitro (lignées cellulaires) et in vivo (modèle murin, ARN des patients) des variations de chacun des isoformes. Dans un second axe, nous souhaitons poursuivre l'étude de facteurs pouvant influencer le phénotype des patients porteurs de mutations du gène SFTPC, qu'ils soient d'origine externes (infections virales et bactériennes ou environnementaux comme le tabac) ou génétique. Collectivement, ces études nous permettrons de fournir une signature moléculaire pour cette maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’en améliorer le pronostic mais également la prise en charge et la qualité de vie des patients. / Surfactant pathologies linked to mutations in the SFTPC gene, via autosomal dominant transmission, are most commonly associated with diffuse interstitial diseases in infants, children and adults, and may also be responsible for acute respiratory distress syndrome in newborns. They are most often accompanied by a high morbidity and mortality rate, thus rendering early diagnosis essential for ideal intervention and support. Mutations in the SFTPC gene lead to alveolar and intracellular accumulation of an abnormal form of the precursor protein SP-C (ProSP-C), which is responsible for the resulting tissue damage. However, the pathophysiological mechanisms are not yet completely deciphered. The gene encodes two isoforms of ProSP-C from three alternative transcripts. The expression level of each is currently unknown and the vast majority of studies evaluating the effect of mutations are performed on only one isoform. Incidentally, our preliminary results on the analysis of RNA extracted from bronchoalveolar washing, both from control subjects and patients harboring a mutation, show that the all three SFTPC transcripts are expressed and that the presence of a mutation is associated with a variation in the expression levels of the transcripts. The aim of my project is to study the expression level of SFTPC transcripts and ProSP-C isoforms from the heterologous expression of the SFTPC gene (exons and introns) in cell lines. I will beanalyzing the post-translational maturation profile of these pro-proteins and evaluating the effect of the mutations on their expression and maturation in both our cellular models and in vivo with two Knock-in mice models.A better understanding of the pathophysiology of genetic abnormalities associated with mutations in the SFTPC gene will not only greatly contribute to earlier management of patients, but also it will help in modifying the progression of lung injury and its prognosis.

Récemment, les microbiotes pulmonaires bactériens d’un nombre très limité de patients atteints de mucoviscidose et de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) ont été étudiés en utilisant l'amplification du gène 16S rDNA bactérien suivie par la construction de librairies de clones et différentes approches de séquençage. Ces études ont montré que la population microbienne de patients atteints de maladies respiratoires était plus diversifiée que prévue. Dans l'étude actuelle, nous utilisons une approche comparable pour identifier exhaustivement les agents pathogènes (bactéries, virus, et champignons) composant le microbiote pulmonaire associé aux pneumopathies développées en unités de réanimation. L'étude a inclus des patients admis en réanimation et présentant des formes de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (n = 106), de pneumopathies communautaires (n = 32), de pneumopathies nosocomiales sans ventilation mécanique (n = 22) et de pneumopathies d’aspiration (n = 25). Une cohorte de 25 patients admis en réanimation et ne présentant pas de symptômes de pneumopathie a été étudiée comme contrôle. Cette première partie du travail amènera ainsi à réaliser un catalogue exhaustif des agents de pneumopathies nosocomiales ; à connaître la prévalence des agents identifiés et d’identifier les co-infections fréquemment observées, et surtout à vérifier si ces agents peuvent être identifiés ou pas dans les prélèvements respiratoires profonds de patients non symptomatiques. Pour réaliser cette partie du travail, des séries de prélèvements, incluant des prélèvements de lavage broncho-alvéolaire (LBA), des prélèvements de sang et d'urine ont été étudiés. Ces prélèvements ont été testés par des moyens d’identification moléculaire moderne basés sur l’amplification de gènes conservés (gènes16S rDNA des bactéries et gène 18S rDNA des champignons) suivie par clonage et séquençage à grande échelle. D’autres pathogènes atypiques sont ciblés par des tests de PCR avec utilisation d’amorces spécifiques. Nous avons également inclus la culture, la co-culture d’amibes, la détection sérologique d'anticorps dirigés contre des agents sélectionnés et des tests d'antigène urinaire, afin de comparer ces tests de routine aux approches moléculaires. Comme résultats, les tests moléculaires nous ont permis d’identifier un vaste répertoire de 160 espèces bactériennes dont 73 n'ont jamais été précédemment rapportées à l’étiologie des pneumopathies. En outre, nous avons trouvé 37 phylotypes bactériens potentiellement nouveaux. Nous avons également identifié 24 espèces de champignons dont 6 n'ont pas été précédemment rapportées à l’étiologie des pneumopathies, 7 virus et étonnamment 6 espèces de plantes. De plus, certains agents pathogènes considérés comme typiques aux pneumopathies nosocomiales tels que Pseudomonas aeruginosa et des Streptococci ont été détectés chez les contrôles comme chez les patients. Cet étonnant résultat souligne l'existence d'un noyau de microbiote pulmonaire.Dans un deuxième travail, faisant suite aux travaux effectués dans notre laboratoire et qui ont pu mettre en évidence que 19% des pneumopathies nosocomiales étaient déterminées par des microorganismes associés aux amibes (MAAs) de l’eau préalablement ignorés ou négligés, nous avons utilisé un test d'immunofluorescence multiplexe pour tester la prévalence des anticorps contre les MAAs dans le sang de patients admis en réanimation et atteints de pneumopathies et la comparer à la prévalence au moment de l'admission. Comme résultat, nous démontrons que certains MAAs peuvent être plus fréquemment détectés après des épisodes de pneumopathies nosocomiales que lors de l’admission. En outre, la réponse immunitaire aux MAAs semble augmenter lorsque le séjour en réanimation est prolongé. Enfin, nous avons mis au point une stratégie de metagénomique pour tester les prélévements pour lesquels aucune étiologie n’a été retrouvée. [...] / Recently, bacterial microbiota from a limited number of patients with cystic fibrosis and ventilator-associated pneumonia (VAP) was studied using 16S rDNA gene amplification followed by clone libraries construction and sequencing. These studies have showed that the microbial population of patients with respiratory infections was more diverse than expected. In the current study, we use a similar approach to identify exhaustively the pathogens (bacteria, viruses, and fungi) comprising the microbiota associated with episodes of pneumonia developed in the intensive care units (ICU). Our study included patients admitted to ICUswith with episodes of ventilator-associated pneumonia (n = 106), community-acquired pneumonia (n = 32), nosocomial pneumonia without mechanical ventilation (n = 22) and aspiration pneumonia (n = 25). A cohort of 25 patients admitted to ICUs without symptoms of pneumonia were studied as controls. This first part of the work enables to prepare an exhaustive repertoire of nosocomial pneumonia pathogenes; to know the prevalence of the pathogens identified and to identify co-infections frequently observed, and especially to ascertain whether these agents can be identified or not in the respiratory samples of patients without symptoms of pneumonia. To perform this part of work, series of samples, including bronchoalveolar lavage (BAL) samples, blood samples and urine samples were collected. These samples were tested by means of modern molecular tools based on the amplification of conserved genes (bacterial 16S rDNA and fungal 18S rDNA genes), followed by highthroutput cloning and sequencing. The atypical pathogens are targeted by PCR tests using specific primers and probes. We also included culture, amoeba co-culture, serological detection of antibodies against selected agents and urinary antigen testing, to compare these routine tests to molecular approaches. Based on molecular testing, we identified a wide repertoire of 160 bacterial species of which 73 were never previously reported in pneumonia samples. Moreover, we found 37 putative new bacterial phylotypes. We also identified 24 fungal species of which 6 have not been previously reported in pneumonia, 7 viruses and surprisingly 6 plant species. Some pathogens considered being typical for ICU pneumonia such as Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus species may be detected as commonly in controls as in pneumonia patients which strikingly highlight the existence of a core of pulmonary microbiota.In a second work, following previous works performed in our laboratory which were able to show that 19% of nosocomial pneumonia were determined by micro-organisms associated to amoebae (AAMs) previously ignored or neglected, we used a recent test based on multiplex serology to test for the prevalence of antibodies against the AAMs in the blood of patients admitted to ICU and developed episodes of pneumonia and compare it to the prevalence at the time of admission (controls). As a result, we demonstrate that some AAMs may be more frequently detected after episodes of nosocomial pneumonia than at the admission. In addition, the immune response to AAMS appears to increase when the ICU stay is prolonged.Finally, in order to explore samples for which no microbial aetiology was found, we have developed a subtractive hybridization metagenomic strategy and tested it on different clinical samples. The sensitivity of this strategy was also evaluated. We have demonstrated that our method, based on the detection of DNA and RNA of microorganisms in a single test, allows sensitive detection of different types of microorganisms.

En infectiologie, comme en cancérologie, la médecine personnalisée se développe. Ainsi, les traitements antibiotiques probabilistes cèdent leur place à des traitements adaptés aux pathologies et aux patients. En plus des risques d’échecs liés à une thérapie non adaptée, le traitement probabiliste d’une infection est associé à l’augmentation des résistances acquises chez les bactéries. Cependant, cette orientation nécessite de disposer de tests compagnons, c’est-à-dire des tests diagnostiques sensibles et spécifiques pouvant précocement identifier les bactéries et les marqueurs de résistance à partir des liquides biologiques. A côté des méthodes moléculaires largement développées mais ayant des limites de multiplexage, les techniques protéomiques ont récemment été intégrées dans le diagnostic en infectiologie. Ce travail de thèse a consisté à développer des méthodes de spéctrométrie de masse et à les appliquer à la détection de pathogènes et de marqueurs de résistance. Ce travail s’est focalisé sur trois applications : 1) l’identification, la caractérisation et la quantification précoce de micro-organismes dans des échantillons primaires (aspirats endotrachéaux (AET)) de patients atteints de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (PAVM), 2) la détection d’éléments génétiques de la résistance aux antibiotiques : les intégrons, 3) la détection de phénotypes de résistance aux antibiotiques chez Staphylococcus aureus. / Personalized medicine for infectious diseases or cancer becomes more and more important in modern therapy. Furthermore, probabilistic treatment has been associated with the development of resistant bacteria causing infectious diseases. As a result, probabilistic treatments are replaced by adapted treatment for pathologies and patients. However, this new approach needs available companion diagnosis tests that are sensitive but also specific tests able to provide rapid pathogen and resistance markers identification in biological fluids. Beside molecular methods, widely developed but with multiplex limits, proteomic technics have recently joined the infectious diagnosis. This work consisted in developing mass spectrometry technics for bacteria and resistance marker identifications. This work focused on 3 applications: 1) identification and quantitation of microorganisms in crude samples (endotracheal aspirates (ETA)) from patient suffering of ventilator associated pneumonia (VAP), 2) detection of genetic elements involved in antibiotic resistance : the integrons, 3) detection of antibiotic resistance phenotypes in S. aureus.