Nox4 est une source de ROS constitutive et ubiquitaire intervenant dans la signalisation intracellulaire. Une dérégulation de son activité a été associée à l'athérosclérose, la fibrose pulmonaire, le diabète et nous suspectons son rôle dans l'arthrose. L'arthrose est la résultante de phénomènes mécaniques et biologiques conduisant à la dégradation du cartilage et de l'os sous-chondral. Le chondrocyte, synthétisant et libérant des métalloprotéases matricielles (MMP), principales effectrices de la protéolyse matricielle, en est l'acteur principal. Dans la lignée de chondrocytes C-20/A4, l'IL-1β induit la synthèse de la collagénase MMP-1 de manière dépendante de l'activité de Nox4.Ces données suggèrent que Nox4 pourrait jouer un rôle dans la physiopathologie de l'arthrose. De manière à éclaircir le rôle de Nox4 dans le chondrocyte mais également pour proposer des pistes permettant de moduler cette activité, ce projet à été découpé en trois parties étroitement liées.1- Une meilleure connaissance de la topologie de Nox4 permettrait de mieux comprendre son fonctionnement pour mieux appréhender le développement d'inhibiteurs de son activité. L'étude de la topologie membranaire de Nox4 a été abordée en préparant des protéines de fusion avec l'ubiquitine marquée à la GFP. Cette méthode (ToDUFA) a permis pour la première fois de proposer expérimentalement une topologie de Nox4 avec 6 passages transmembranaires. 2- L'indentification de nouveaux partenaires modulateurs de l'activité de Nox4 pourrait être une première étape vers le traitement de l'arthrose. L'hème oxygénase (HO-1) est l'enzyme limitante dans le catabolisme de l'hème, molécule indispensable à l'activité catalytique des Nox. Les résultats montrent que HO-1 est capable de réprimer l'activité de Nox4 et suggèrent un mécanisme dépendant de la libération de monoxyde de carbone (CO) produit au cours de l'activité de HO-1. Ces résultats soulèvent également le rôle de l'hème dans le processus de maturation du complexe Nox4/p22phox. 3- Le rôle de Nox4 dans la physiopathologie de l'arthrose doit être validé sur des cultures primaires. Les résultats montrent que Nox4 est la seule Nox exprimée dans les chondrocytes primaires humains. Nox4, stabilisée par une augmentation protéique de p22phox après stimulation des chondrocytes par IL-1β, conduirait à la synthèse des MMP-1, MMP-13 et de l'ADAMTS4. Ces travaux montrent enfin que l'activité de Nox4 est impliquée dans le rétrocontrôle positif conduisant à la néosynthèse de l'IL-1β et à la persistance du catabolisme.En conclusion, les résultats suggèrent un rôle significatif de Nox4/p22phox dans la dégénérescence cartilagineuse. Nous décrivons un nouveau mécanisme de régulation de l'activité de Nox4 par HO-1 dans la lignée C-20/A4 et dans les chondrocytes primaires humains, préfigurant d'un rôle thérapeutique potentiel de HO-1. Enfin, le premier modèle topologique de Nox4 basé sur nos données expérimentales pourrait constituer une base pour le développement d'inhibiteurs ou de peptides compétiteurs. / Nox4 is a ubiquitous and constitutive source of ROS involved in intracellular signaling. However, a dysregulation of its activity has been shown to be involved in atherosclerosis, pulmonary fibrosis, diabetes, and we suspect its role in osteoarthritis (OA). OA is the consequence of mechanical and biological processes leading to the breakdown of cartilage and subchondral bone. Chondrocytes by synthesizing and releasing matrix metalloproteinases (MMP) mediates proteolysis of the extracellular matrix and is therefore the main actor of OA. In the C-20/A4 chondrocytes cell line, IL-1β leads to the synthesis of the MMP-1 collagenase in a Nox4 dependent manner suggesting that Nox4 might be a good therapeutic candidate for osteoarthristis treatment.In order to shed light on the role of Nox4 in the chondrocyte and to propose new strategies to modulate its activity, 3 mains objectives have been developed in this work.1 - A better understanding of the topology of Nox4 could allow a better comprehension of its function and the development of inhibitors: Membrane topology of Nox4 was assessed by preparing fusion proteins with ubiquitin fused with GFP's tag. This method (ToDUFA) allowed us for the first time to determine experimentally a topology organization for Nox4 with 6 transmembrane domains.2 - The identification of novel partners of modulation of Nox4 activity might be a first step toward the treatment of osteoarthritis: Heme oxygenase (HO-1) is the rate limiting enzyme in heme catabolism, an essential molecule for the catalytic activity of Nox. Our results showed that HO-1 was able to inhibit Nox4 activity and suggest a mechanism involving the release of carbon monoxide (CO) that was produced during the activity of HO-1. These findings also highlight the role of heme in the maturation process of Nox4/p22phox hetero-complex.3 - The role of Nox4 in the pathophysiology of osteoarthritis must be validated in primary cultures: Our results showed that Nox4 is the sole Nox isoform expressed in human primary chondrocytes. Nox4 activity, stabilized by the induced expression of p22phox in the IL-1β-stimulated chondrocytes, might mediate the synthesis of MMP- 1, MMP-13 and ADAMTS4. Finally, our data demonstrated that the activity of Nox4 is involved in the positive feedback leading to the neo-synthesis of IL-1β, mechanism that sustains the catabolism.In conclusion, our data suggest a significant role of Nox4/p22phox in cartilage degeneration. We describe a new mechanism by which HO-1 regulates the activity of Nox4 in C-20/A4 cell line and in primary human chondrocytes, predicting a potential therapeutic effect of HO-1. Finally, the first topological model of Nox4 based on our experimental data might provide a basis for the development of inhibitors or competitor peptides.

Poldip2 est une protéine ubiquitaire initialement identifiée comme étant un partenaire de la sous unité p50 de la polymerase δ intervenant dans la réplication et la réparation de l’ADN. Depuis sa découverte en 2003, beaucoup d’autres partenaires et fonctions lui ont été attribués. Elle joue, entre autre, un rôle régulateur de l’isoforme NADPH oxydase NOX4. A ce jour, le mode d’action de cette régulation n’a pas encore été identifié. Seul fait connu est que Poldip2 augmente l’activité de NOX4 en s’associant au partenaire membranaire de NOX4, la protéine p22phox. L’association de p22phox à d’autres isoformes de NADPH Oxydase (NOX1, NOX2 ou NOX3) suggère une interaction possible entre ces derniers et Poldip2. Par ailleurs la co-localisation de NOX4 et NOX2 dans plusieurs types cellulaires, tels que les cellules du muscle lisse et l’endothélium mais également la coexpression de Poldip2 et NOX2 dans les artérioles rénale font de NOX2 un bon candidat pour l’étude de l’effet régulateur possible de Poldip2 de cet isoforme. Dans cette perspective, la protéine recombinante Poldip2 (rat) a été produite de manière hétérologue dans un système d’expression de levure P. pastoris. Grace à un vecteur d’expression spécifique de cette levure, Poldip2 est sécrété dans le milieu extracellulaire. La protéine a été purifiée à partir du milieu de culture. L’analyse de la séquence par spectrométrie de masse a permis de confirmer l’identité du Poldip2 recombinant produit par la levure. Après avoir caractérisé structuralement Poldip2 et confirmé sa capacité à augmenter l’activité de NOX4, nous avons étudié son effet sur NOX2 des phagocytes. De manière surprenante, nos études en système cell-free ont montré des propriétés inhibitrices de Poldip2 sur NOX2 avec des interactions privilégiées avec certaines des composantes du complexe oxydase. Nos résultats suggèrent que l’interaction de Poldip2 avec le complexe pourrait constituer une nouvelle voie de régulation de NOX2 en perturbant l’assemblage du complexe NADPH oxydase. / Poldip2 is an ubiquitous protein initially identified as a partner for polymerase δ p50 subunit and is involved in DNA replication and repairing. Since its discovery in 2003, many partners and functions has been assigned to it. Poldip2 is also involved in NADPH Oxidase NOX4 isoform regulation. The enhancement of NOX4 activity was attributed to Poldip2 interaction with the membrane partner p22phox. However the mechanism by which it regulates NOX4 has not been identified yet. The association of p22phox with other Nox isoform (NOX1, NOX2 or NOX3) questions the possible interaction of Poldip2 with NOX2. Furthermore the colocalization of NOX4 and NOX2 in several cell types as the smouth muscle cells and endothelium cells but also Poldip2 and NOX2 coexpression in renal arterioles, makes NOX2 a good candidate for studying the possible regulatory effect of Poldip2 on the NOX2 isoform. On this purpose the recombinant protein Poldip2 (rat) was produced in the yeast P. pastoris. Using a specific expression vector Poldip2 was secreted in the extracellular media. The protein was purified from culture media. Sequence analysis by mass spectrometry allowed to confirm the recombinant protein identity produced in yeast. After the structural characterization of poldip2 and the confirmation of its functionality on NOX4, the protein was used to study its effect on NOX2 phagocyte. Surprisingly our study on cell free assay shows that Poldip2 has inhibiting properties regarding NOX2 and interacts in a privileged manner with certain components of the NADPH Oxidase complex. Our result suggest that the interaction of Poldip2 and the complex might constitute a new regulation for NOX2 by disturbing the NADPH Oxidase assembly.