There is considerable evidence that cigarette smoking is the primary etiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and that oxidative stress occurs in COPD with the family of tissue nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase (Nox) enzymes playing a significant role in lung pathogenesis. The purpose of this study was to determine the effects of cigarette smoke extract (CSE) on Nox signaling to epithelial sodium channels (ENaCs). Pre-treatment with diphenyleneiodonium (DPI), a pan-Nox inhibitor, prevented stimulatory effects of CSE on ENaC activity; open probability (Po) changed from 0.36 +/- 0.09 to 0.11 +/- 0.02; n=10, p=0.01 following CSE and DPI exposure. Likewise, Fulvene-5 (which inhibits Nox2 and Nox4 isoforms) decreased the number of ENaC per patch (from 2.75 +/- 0.25 to 1 +/- 0.5, n=9, p=0.002) and open probability (0.18 +/- 0.08 to 0.02 +/- 0.08, p=0.04). Cycloheximide chase assays show that CSE exposure prevented alpha-ENaC subunit degradation, whereas concurrent CSE exposure in the presence of Nox inhibitor, Fulvene 5, resulted in normal proteolytic degradation of alpha-ENaC protein in primary isolated lung cells. In vivo, co-instillation of CSE and Nox inhibitor promoted alveolar flooding in C57Bl6 mice compared to accelerated rates of fluid clearance observed in CSE alone instilled lungs. Real-time PCR indicates that mRNA levels of Nox2 were unaffected by CSE treatment while Nox4 transcript levels significantly increased 3.5 fold in response to CSE. Data indicate that CSE is an agonist of Nox4 enzymatic activity, and that CSE-mediated Nox4 plays an important role in altering lung ENaC activity.

Nox4 est une source de ROS constitutive et ubiquitaire intervenant dans la signalisation intracellulaire. Une dérégulation de son activité a été associée à l'athérosclérose, la fibrose pulmonaire, le diabète et nous suspectons son rôle dans l'arthrose. L'arthrose est la résultante de phénomènes mécaniques et biologiques conduisant à la dégradation du cartilage et de l'os sous-chondral. Le chondrocyte, synthétisant et libérant des métalloprotéases matricielles (MMP), principales effectrices de la protéolyse matricielle, en est l'acteur principal. Dans la lignée de chondrocytes C-20/A4, l'IL-1β induit la synthèse de la collagénase MMP-1 de manière dépendante de l'activité de Nox4.Ces données suggèrent que Nox4 pourrait jouer un rôle dans la physiopathologie de l'arthrose. De manière à éclaircir le rôle de Nox4 dans le chondrocyte mais également pour proposer des pistes permettant de moduler cette activité, ce projet à été découpé en trois parties étroitement liées.1- Une meilleure connaissance de la topologie de Nox4 permettrait de mieux comprendre son fonctionnement pour mieux appréhender le développement d'inhibiteurs de son activité. L'étude de la topologie membranaire de Nox4 a été abordée en préparant des protéines de fusion avec l'ubiquitine marquée à la GFP. Cette méthode (ToDUFA) a permis pour la première fois de proposer expérimentalement une topologie de Nox4 avec 6 passages transmembranaires. 2- L'indentification de nouveaux partenaires modulateurs de l'activité de Nox4 pourrait être une première étape vers le traitement de l'arthrose. L'hème oxygénase (HO-1) est l'enzyme limitante dans le catabolisme de l'hème, molécule indispensable à l'activité catalytique des Nox. Les résultats montrent que HO-1 est capable de réprimer l'activité de Nox4 et suggèrent un mécanisme dépendant de la libération de monoxyde de carbone (CO) produit au cours de l'activité de HO-1. Ces résultats soulèvent également le rôle de l'hème dans le processus de maturation du complexe Nox4/p22phox. 3- Le rôle de Nox4 dans la physiopathologie de l'arthrose doit être validé sur des cultures primaires. Les résultats montrent que Nox4 est la seule Nox exprimée dans les chondrocytes primaires humains. Nox4, stabilisée par une augmentation protéique de p22phox après stimulation des chondrocytes par IL-1β, conduirait à la synthèse des MMP-1, MMP-13 et de l'ADAMTS4. Ces travaux montrent enfin que l'activité de Nox4 est impliquée dans le rétrocontrôle positif conduisant à la néosynthèse de l'IL-1β et à la persistance du catabolisme.En conclusion, les résultats suggèrent un rôle significatif de Nox4/p22phox dans la dégénérescence cartilagineuse. Nous décrivons un nouveau mécanisme de régulation de l'activité de Nox4 par HO-1 dans la lignée C-20/A4 et dans les chondrocytes primaires humains, préfigurant d'un rôle thérapeutique potentiel de HO-1. Enfin, le premier modèle topologique de Nox4 basé sur nos données expérimentales pourrait constituer une base pour le développement d'inhibiteurs ou de peptides compétiteurs. / Nox4 is a ubiquitous and constitutive source of ROS involved in intracellular signaling. However, a dysregulation of its activity has been shown to be involved in atherosclerosis, pulmonary fibrosis, diabetes, and we suspect its role in osteoarthritis (OA). OA is the consequence of mechanical and biological processes leading to the breakdown of cartilage and subchondral bone. Chondrocytes by synthesizing and releasing matrix metalloproteinases (MMP) mediates proteolysis of the extracellular matrix and is therefore the main actor of OA. In the C-20/A4 chondrocytes cell line, IL-1β leads to the synthesis of the MMP-1 collagenase in a Nox4 dependent manner suggesting that Nox4 might be a good therapeutic candidate for osteoarthristis treatment.In order to shed light on the role of Nox4 in the chondrocyte and to propose new strategies to modulate its activity, 3 mains objectives have been developed in this work.1 - A better understanding of the topology of Nox4 could allow a better comprehension of its function and the development of inhibitors: Membrane topology of Nox4 was assessed by preparing fusion proteins with ubiquitin fused with GFP's tag. This method (ToDUFA) allowed us for the first time to determine experimentally a topology organization for Nox4 with 6 transmembrane domains.2 - The identification of novel partners of modulation of Nox4 activity might be a first step toward the treatment of osteoarthritis: Heme oxygenase (HO-1) is the rate limiting enzyme in heme catabolism, an essential molecule for the catalytic activity of Nox. Our results showed that HO-1 was able to inhibit Nox4 activity and suggest a mechanism involving the release of carbon monoxide (CO) that was produced during the activity of HO-1. These findings also highlight the role of heme in the maturation process of Nox4/p22phox hetero-complex.3 - The role of Nox4 in the pathophysiology of osteoarthritis must be validated in primary cultures: Our results showed that Nox4 is the sole Nox isoform expressed in human primary chondrocytes. Nox4 activity, stabilized by the induced expression of p22phox in the IL-1β-stimulated chondrocytes, might mediate the synthesis of MMP- 1, MMP-13 and ADAMTS4. Finally, our data demonstrated that the activity of Nox4 is involved in the positive feedback leading to the neo-synthesis of IL-1β, mechanism that sustains the catabolism.In conclusion, our data suggest a significant role of Nox4/p22phox in cartilage degeneration. We describe a new mechanism by which HO-1 regulates the activity of Nox4 in C-20/A4 cell line and in primary human chondrocytes, predicting a potential therapeutic effect of HO-1. Finally, the first topological model of Nox4 based on our experimental data might provide a basis for the development of inhibitors or competitor peptides.

Cancer cells are believed to exist in a condition of metabolic oxidative stress compared to normal cells because of inherent mitochondrial dysfunction. Cancer cells up regulate antioxidant defense mechanisms to combat the toxic effect of reactive oxygen species (ROS). Many anticancer agents block ROS detoxification mechanisms and utilize oxidative stress to cause cytotoxicity to cancer cells. However, ROS also up-regulate many pro-survival signaling pathways that may mediate resistance to chemotherapy. I hypothesize that ROS induces both cytotoxicity and pro-survival mechanisms in cells treated with chemotherapeutic agents such as the EGFR inhibitor erlotinib. This thesis explores how oxidative stress may induce both pro-survival and pro-death mechanisms in HNSCC cells and how this can be exploited to increase the cytotoxicity of erlotinib. The combined use of buthionine-[S,R]-sulfoximine, an inhibitor of glutathione and auranofin, an inhibitor of thioredoxin metabolism enhanced human head and neck cancer cell killing by a mechanism involving oxidative stress both in vitro and in vivo and sensitized cells to erlotinib in vitro. However, in other studies erlotinib as a single agent induced oxidative stress and this was mediated by NADPH oxidase 4 (NOX4). NOX4 mediated oxidative stress activated a process called autophagy which protected cancer cells from cytotoxic effect of erlotinib and inhibition of autophagy sensitized cells to erlotinib in vitro. These studies show that oxidative stress may have a dual role in cancer chemotherapy. ROS generated from various drug treatments can cause oxidative damage of cells culminating in cell death. However, it may also activate autophagy protecting cells against the stress and leading to decreased efficacy of the treatment. Hence inhibiting autophagy and hydroperoxide metabolism can be effective treatment modalities to enhance the cytotoxicity of erlotinib and achieve maximum therapeutic efficacy.

La NADPH oxydase, Nox4, appartient à la famille des Nox qui génèrent les espèces radicalaires de l'oxygène, ROS, en transférant un électron à l'oxygène moléculaire. Malgré sa large distribution dans les tissus, Nox4 est encore mal comprise. Contrairement aux autres Nox, Nox4 est unique par son activité constitutive et sa capacité à former H2O2. Les ROS sont des espèces bactéricides dans les phagocytes et des outils de signalisation dans les cellules non phagocytaires en étant associés à de nombreuses pathologies inflammatoires et du vieillissement. Une étude de la structure en lien avec la fonction de Nox4 permettra de mettre l'accent sur un mécanisme de fonctionnement et sur de nouvelles cibles thérapeutiques. 5 nouveaux anticorps monoclonaux ont été générés contre une construction recombinante tronquée (AA: 206-578) de Nox4. La spécificité de 3 anticorps monoclonaux (8E9, 5F9, 6B11) a été confirmée par western blot dans les cellules HEK293 transfectées et le cortex de rein humain. L'anticorps 8E9 est le seul à permettre un marquage des cellules TRex-Nox4 sans perméabilisation par FACS. L'immunofluorescence confocale a montré que Nox4 est localisée dans la zone périnucléaire et le réticulum endoplasmique. La microscopie TIRF a confirmé sa présence dans la membrane plasmique. Un phénomène intéressant est que 5F9 ne détecte pas Nox4 à la membrane plasmique. L'épitope de 8E9 reconnaît une région sur la dernière boucle E extracellulaire de Nox4 (222H-E241), tandis que les anticorps monoclonaux, 6B11 et 5F9 marquent respectivement les régions 6B11 (389S-P416) et 5F9 (392D-F398). Par ailleurs, seuls 5F9 et 6B11 inhibent l'activité de Nox4, ce qui suggère que les deux régions marquées par ces ACm sont impliquées dans le transfert d'électrons. Une étude ciblée sur la boucle E de Nox4 a permis de montrer que le changement de 2 cystéines modifie la nature des ROS générés par Nox4 avec la production de O2- au lieu de H2O2. O2- est mis en évidence par la formation de peroxynitrite en présence de NO. Par ailleurs l'ACm 8E9 diminue la production de H2O2 dans les cellules COS7 qui expriment Nox4 à la membrane plasmique alors que celle de O2- est augmentée. Des constructions recombinantes de Nox4 (native ou tronquée) ont été générées par induction bactérienne, E.Coli, et par un système de transcription/traduction (RTS). Les protéines correspondantes, solubles, ont été produites à grande échelle et l'activité diaphorase mesurée; cette activité est constitutive. L'étude de la topologie membranaire de Nox4 et p22phox a été abordée en préparant des protéines de fusion avec l'ubiquitine marquée à la GFP. Cette méthode, TDUFA, particulièrement originale, devrait permettre d'appréhender la topologie de l'hétérodimère Nox4/p22phox, actif. / NADPH oxidase, Nox4, belongs to the Nox family which could generate reactive oxygen species by transferring an electron to molecular oxygen. Despite its wide distribution in tissues, Nox4 is still poorly understood. Unlike the other Noxes, Nox4 shows some unique characters: the constitutive activity, H2O2 formation. Nox4 involved ROS has been proposed to be implicated in several pathologies. Thus, to study the structure/function and the regulation of the activity of Nox4 will provide new ideas and new drug targets for the effective prevention and treatment of clinical diseases related with ROS. To know more about Nox4, in this study, 5 novel monoclonal antibodies were raised against a truncated recombinant protein (AA: 206-578) of Nox4. The specificity of 3 mAbs (8E9, 5F9, 6B11) was confirmed by western blot analysis in HEK293 transfected cells and human kidney cortex. In FACS studies, only mAb 8E9 could react with intact tet-induced T-RExTM Nox4 cells. Immunofluorescence confocal microscopy showed that Nox4 localized not only in the perinuclear and endoplasmic reticulum regions but also at the plasma membrane of the cells which was further confirmed by TIRF-microscopy. An interesting phenomena is that mAb 5F9 failed to detect Nox4 at the plasma membrane. Epitope determination showed that mAb 8E9 recognizes a region on the last extracellular loop of Nox4 (222H-E241), while mAb 6B11 (389S-P416) and 5F9 (392D-F398) are directed to its cytosolic tail. Cell-free oxidase assays showed a moderate but significant inhibition of constitutive Nox4 activity by mAb 5F9 and 6B11. To study the protein region which is responsible for the unique ability of Nox4 of releasing H2O2 rather than O2-, chimeric proteins and mutants were used. E-loop of Nox4 is 28 amino acid longer than that of Nox1 or Nox2. Deletion of E-loop amino acids only present in Nox4 or change of the two cysteines in the E-loop switch Nox4 from H2O2 to O2- generation. In the presence of a NO donor, the O2--producing Nox4 mutants, but not widetype Nox4, generated peroxynitrite, excluding artifacts of the detection systems as the apparent origin of O2-. A second approach was used to confirm the responsibility of E-loop for the H2O2 formation. In Cos7 cells, which exhibit some plasma membrane expression of Nox4, addition of the mAb 8E9 decreased H2O2 production but increased O2- formation. Unlike Nox1 or Nox2, the E-loop of Nox4 contains a highly conserved histidine H222. Mutation of H222 also switched Nox4 from H2O2 to O2- formation. The structure of the E-loop might hinder O2- egress and/or provide a source for protons to accelerate dismutation to form H2O2. Two bacterial protein expression approaches (in vitro RTS and bacterial induction) were used to produce Nox4 cytosolic tail for characterizing the electronic transfer property of Nox4. The presence of rare codons (1363AGA AGA CUA1371) and high level of hydrophobicity affects the production of soluble and active recombinant Nox4Aqc and Nox4Bqc. After optimization of the conditions, soluble and active recombinant proteins were obtained by RTS or by bacteria induction. The soluble proteins were produced in large scale, purified onto affinity chromatography and were tested for the diaphorase activity (INT and cytochrome c). Results showed that electronic acceptor cytochrome c gives a higher rate than INT. Nox4Aqc produced a lower specific activity by a cell-based system compared to the protein synthesized in cell-free technology. This activity is not stimulated by the addition of cytosolic factors. A new method, topological determination by ubiquitin fusion assay (TDUFA), was used to investigate the topology of Nox4 and p22phox. ubGFP fusion proteins are used as tools to obtain details of membrane protein topology. This method was first validated by using two membrane proteins with known topology and then should get more topology information of Nox4 and p22phox further.

The cell cycle is an orchestrated mechanism ensuring cell division and differentiation to form multicellular organisms as well as to promote tissue homeostasis and regeneration. To secure correct cell division end ensure genome integrity for the next cell generation, the cell cycle must be strictly controlled. As part of this control cells have to adequately respond to the intra- and extracellular environment. Among the key molecules mediating the exchange of information from the surrounding environment are reactive oxygen species (ROS). ROS are small oxygen species, which control cellular signaling pathways through reductive-oxidative (redox) reactions with cellular proteins. For instance, mitogen signaling is sustained through ROS production by the NADPH oxidases in order to pass the information to proliferate or not to proliferate onto downstream cascades. Furthermore, cellular processes enabling proliferation and thus cell cycle progression require a level of high energy. Here, the cell cycle machinery meets mitochondria. Mitochondrial metabolism is the basis of aerobic respiration, the mechanism which supplies cells with energy and metabolites important for protein and DNA synthesis. By-products of mitochondrial metabolism as a result of incomplete reduction of oxygen are ROS molecules. Whether produced as metabolic by-product by mitochondria or as a growth factor stimulant by NADPH oxidases, many studies have demonstrated the broad influence of ROS on signaling pathways. When looking at ROS in context of cell division, ROS levels have been proposed to oscillate as cells progress through individual cell cycle phases. Perturbations of the cellular redox environment affect cell cycle progression and depending on the perturbation, may promote proliferation, cell cycle arrest or cell death. Thus, the interplay between redox mechanism and the cell cycle appears to be key to cell cycle decision making. Although the mechanisms of how ROS regulate proliferation-related proteins such as growth factor receptors or protein tyrosine phosphatases are known, the mechanisms of how ROS influence the cell cycle core machinery remain to be fully uncovered. To investigate the interplay between redox signaling and the cell cycle, I took advantage of approaches that allowed me to visualize and study changes in both systems at the same time. I visualized ROS dynamics in physiological and unperturbed conditions in non-transformed cells using redox specific dyes and indeed, observed that the levels of ROS oscillate during the cell cycle. ROS changes are characterized by basal levels in G1 phase and increased levels in S and G2 phases. My data provide evidence that ROS oscillations mainly originate from ROS produced by mitochondria. To investigate cause-consequence relations between ROS and the cell cycle I interfered with the cellular redox environment and studied the effect on cell cycle progression. Firstly, I discovered that the protein levels of NADPH oxidase 4 (NOX4), the enzyme producing ROS in response to mitogens, decrease shortly before cells enter S phase. Because NOX4 is constitutively active and its regulation is not known, this observation suggests that there is a mechanism of cell cycle-dependent NOX4 regulation that is important for entry into S phase. Secondly, I showed that reduction of ROS production by decreasing metabolites important for their production slowed proliferation due to prolonged S phase. This allowed me to establish that the main S phase regulator Cdk2 is a redox regulated cell cycle protein. Precisely, full phosphorylation of threonine 160 (T160) in the activatory segment of Cdk2, which is required for full Cdk2 activity was promoted by ROS derived from mitochondria. Furthermore, using a chemo-selective probe for cysteine oxidation I showed that Cdk2 is directly oxidized by ROS. Mutating the only surface exposed cysteine of Cdk2, C177, resulted in a change of Cdk2 binding to KAP, the phosphatase responsible for removing T160 phosphorylation. I found that only in reductive conditions KAP bound to Cdk2 resulting in Cdk2 dephosphorylation and thus reduced activity. In contrast oxidative conditions abolished the interaction between KAP and Cdk2. Thus, I propose a model of redox-dependent regulation of Cdk2 whereby the increase of mitochondrial ROS during S phase negatively regulates the Cdk2-KAP interaction to enable full activation of Cdk2 necessary for cells to rapidly progress through S phase. Altogether, in my thesis I investigated the link between mitochondrial ROS production and the cell cycle machinery and identified a mechanism of how increased levels of ROS drive the cell cycle. Furthermore, I outlined a potential cell cycle-dependent regulation of the NOX4 protein, which might provide a step towards understanding of its regulation. Thus, my thesis provides new views on the interplay between the redox system and the cell cycle machinery.:1. Introduction 1.1 Reactive oxygen species (ROS) 1.1.1 ROS and signal transduction 1.1.2 Antioxidant systems 1.1.3. Redox homeostasis, oxidative and reductive stress 1.2 ROS producing mechanisms 1.2.1 Mitochondria 1.2.2 NADPH oxidases 1.3 The cell cycle 1.4. ROS and the cell cycle 1.5 Aims of the thesis 2. Results 2.1 CellRox, a ROS sensitive dye, reveals redox changes during the cell cycle progression 2.2 Investigating the role of NADPH oxidases in cell cycle progression 2.2.1 General NOX inhibition causes defect in proliferation and suggests G1 phase delay 2.2.2 NOX4 and NOX1 specific inhibition causes a G1 delay or arrest 2.2.3 Specific down-regulation of NOX4 might have a negative impact on cell proliferation 2.2.4 NOX4 over-expression affects proliferation 2.2.5 NOX4 expression drops at G1 and S phase transition 2.3 Cell cycle dependent ROS oscillations correlate with mitochondria ROS production 2.4 Interference with mtROS decreases proliferation on the level of S phase 2.4.1 MitoTempo negatively affects proliferation and decreases population of EdU positive cells 2.4.2 Genetic interfering with mtROS production results in affected Cdk2 activation 2.5 Redox dependent Cdk2 activation via KAP binding 2.5.1 BTD labeling reveals Cdk2 as a direct target for oxidation 2.5.2 Preventing Cdk2 oxidation of cysteine 177 results in a drop of T160 phosphorylation 2.5.3 KAP binds to Cdk2 in a redox dependent manner 3. Discussion 3.1 ROS levels oscillate during the cell cycle in physiological cell culture conditions 3.2 Expression levels of NOX4 might determine the entry into S phase 3.3 Mitochondria are the main source of redox oscillations during the cell cycle 3.4 mtROS production contributes to Cdk2 activation and thus drives S phase progression 3.5 KAP phosphatase contributes to redox dependent regulation of Cdk2 3.6. Model of interconnection between the cellular redox environment and cell cycle regulation 4. Materials and methods 4.1 Cell culture 4.1.1 Cell lines 4.1.2 Cell treatments 4.1.3 Plasmids and cell line generation 4.1.4 RNA interference (RNAi) 4.1.5 EdU incorporation assay 4.2 Quantitative PCR (qPCR) 4.3 Protein studies 4.3.1 Cdk2-KAP/CAK interaction 4.3.2 Cdk2 sulfenylation by BTD labeling 4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses 4.4.1 Total lysate preparation 4.4.2 SDS-PAGE 4.4.3 Western blotting 4.5 Flow cytometry analysis (FACS) 4.6 Hypoxia experiments 4.7 Microscopy 4.8 Automated image and data analysis 4.9 Statistical methods 5. Contributions 6. Bibliography 7. Acknowledgements 8. Appendix / Der Zellzyklus ist ein komplexer Mechanismus, der Zellteilung und Differenzierung in mehrzelligen Organismen, sowie die Homöostase und die Regeneration von Geweben gewährleistet. Um eine korrekte Zellteilung zu ermöglichen und die Integrität des Genoms für die nächste Zellgeneration sicherzustellen, muss der Zellzyklus streng kontrolliert werden. Im Rahmen dieser Kontrolle müssen die Zellen angemessen auf die intra- und extrazellulären Umgebungen reagieren. Zu den Schlüsselmolekülen, die den Austausch von Informationen aus der Umgebung vermitteln, gehören reaktive Sauerstoffspezies (ROS). ROS enthalten Sauerstoff und kontrollieren durch reduktiv-oxidative (Redox-) Reaktionen mit zellulären Proteinen viele verschiedene zelluläre Signalwege. So wird beispielsweise die Proliferation aufgrund von Wachstumssignalen durch die Produktion von ROS durch NADPH-Oxidasen ermöglicht, da sie die Information, ob eine Zellteilung stattfinden soll oder nicht, an nachgeschaltete Kaskaden weiterleiten. Darüber hinaus benötigen zelluläre Prozesse, die den Fortgang des Zellzyklus ermöglichen, ein hohes Energieniveau. Hier trifft die Zellzyklusmaschinerie auf die Mitochondrien. Der mitochondriale Stoffwechsel ist die Grundlage der aeroben Atmung, des Mechanismus, der die Zellen mit Energie und Metaboliten versorgt, die für die Protein- und DNA-Synthese notwendig sind. Als Nebenprodukte des mitochondrialen Stoffwechsels entstehen dabei häufig ROS, die aus der unvollständigen Reduktion von Sauerstoff resultieren. Unabhängig davon, ob sie als Nebenprodukte des Stoffwechsels in den Mitochondrien oder als wachstumsfördernde Substanzen in den NADPH-Oxidasen entstehen, viele Studien haben den weitreichenden Einfluss von ROS auf zahlreiche Signalwege gezeigt. Betrachtet man ROS im Zusammenhang mit der Zellteilung, so wird angenommen, dass die ROS-Konzentration mit dem Durchlaufen der einzelnen Zellzyklusphasen schwankt. Störungen der zellulären Redoxumgebung wirken sich auf den Verlauf des Zellzyklus aus und können je nach Störung Proliferation, Stillstand des Zellzykluses oder Zelltod fördern. Das Zusammenspiel zwischen Redox-Mechanismen und dem Zellzyklus scheint also der Schlüssel zur Entscheidungsfindung im Zellzyklus zu sein. Obwohl die Mechanismen, mit denen ROS essentielle Proteine wie Wachstumsrezeptoren oder Protein-Tyrosin-Phosphatasen regulieren, bekannt sind, sind die Mechanismen, mit denen ROS die Kernmaschinerie des Zellzyklus beeinflussen, noch nicht vollständig aufgeklärt. In der hier vorliegenden Arbeit nutzte ich daher Ansätze, die es mir ermöglichten, Veränderungen im Zellzklus, als auch Veränderungen in Redox-Signalen und deren Zusammenspiel gleichzeitig zu untersuchen. Ich habe die Dynamik reaktiver Sauerstoffspezies unter physiologischen und ungestörten Bedingungen in nichttransformierten Zellen mit redox-spezifischen Farbstoffen visualisiert und beobachtet, dass die ROS-Konzentrationen während des Zellzyklus oszillieren. Die Veränderungen der ROSKonzentrationen sind durch einen Grundwert in der G1-Phase und erhöhte Werte in der Sund G2-Phase gekennzeichnet. Meine Daten belegen, dass ROS-Oszillationen hauptsächlich von ROS herrühren, die von den Mitochondrien produziert werden. Um die Ursache-Folge-Beziehungen zwischen ROS und dem Zellzyklus zu untersuchen, habe ich in die zelluläre Redox-Balance eingegriffen und die Auswirkungen auf den Verlauf des Zellzyklus untersucht. Zunächst entdeckte ich, dass die Proteinkonzentration der NADPHOxidase 4 (NOX4), des Enzyms, das ROS als Reaktion auf Wachstumsfaktoren produziert, kurz vor dem Eintritt der Zellen in die S-Phase abnimmt. Da NOX4 konstitutiv aktiv ist und seine Regulierung nicht bekannt ist, deutet diese Beobachtung darauf hin, dass es einen zellzyklusabhängigen Mechanismus der NOX4-Regulierung gibt, der für den Eintritt in die S-Phase wichtig ist. Zweitens konnte ich zeigen, dass die Verringerung von Metaboliten zu einer Verringerung der ROS-Produktion führt, welches die Proliferation aufgrund einer verlängerten S-Phase verlangsamt. Dadurch konnte ich feststellen, dass Cdk2, der wichtigste S-Phasen-Regulator, ein redoxreguliertes Zellzyklusprotein ist. Genauer gesagt wurde die vollständige Phosphorylierung von Cdk2 am Threonin 160 (T160), welche für die volle Cdk2-Aktivität erforderlich ist, durch ROS aus Mitochondrien gefördert. Außerdem konnte ich mit einer chemo-selektiven Probe für Cysteinoxidation zeigen, dass Cdk2 direkt durch ROS oxidiert wird. Die Mutation des einzigen exponierten Cysteins von Cdk2, C177, führte zu einer Veränderung der Bindung von Cdk2 an KAP, die Phosphatase, die für die Aufhebung der T160-Phosphorylierung verantwortlich ist. Ich fand heraus, dass KAP nur unter reduktiven Bedingungen an Cdk2 bindet, was zu einer Dephosphorylierung von Cdk2 und damit zu einer verringerten Aktivität führt. Unter oxidativen Bedingungen hingegen wurde die Interaktion zwischen KAP und Cdk2 aufgehoben. Daher schlage ich ein Modell der redoxabhängigen Regulierung von Cdk2 vor, bei dem der Anstieg der mitochondrialen ROS während der S-Phase die Interaktion zwischen Cdk2 und KAP negativ reguliert, um eine vollständige Aktivierung von Cdk2 und damit eine erfolgreiche S-Phase zu ermöglichen. Insgesamt habe ich in meiner Dissertation die Verbindung zwischen mitochondrialer ROS-Produktion und der Zellzyklusmaschinerie untersucht und einen Mechanismus identifiziert, wie erhöhte ROS-Konzentrationen den Zellzyklus antreiben. Darüber hinaus habe ich die zellzyklusabhängige Regulierung des NOX4-Proteins aufgezeigt, was neue Einblicke zum Verständnis der Zellzykluskontrolle durch ROS gewährt. Somit bietet meine Arbeit neue, interessante Erkenntnisse für das Zusammenspiel zwischen dem Redoxsystem und der Zellzyklusmaschinerie.:1. Introduction 1.1 Reactive oxygen species (ROS) 1.1.1 ROS and signal transduction 1.1.2 Antioxidant systems 1.1.3. Redox homeostasis, oxidative and reductive stress 1.2 ROS producing mechanisms 1.2.1 Mitochondria 1.2.2 NADPH oxidases 1.3 The cell cycle 1.4. ROS and the cell cycle 1.5 Aims of the thesis 2. Results 2.1 CellRox, a ROS sensitive dye, reveals redox changes during the cell cycle progression 2.2 Investigating the role of NADPH oxidases in cell cycle progression 2.2.1 General NOX inhibition causes defect in proliferation and suggests G1 phase delay 2.2.2 NOX4 and NOX1 specific inhibition causes a G1 delay or arrest 2.2.3 Specific down-regulation of NOX4 might have a negative impact on cell proliferation 2.2.4 NOX4 over-expression affects proliferation 2.2.5 NOX4 expression drops at G1 and S phase transition 2.3 Cell cycle dependent ROS oscillations correlate with mitochondria ROS production 2.4 Interference with mtROS decreases proliferation on the level of S phase 2.4.1 MitoTempo negatively affects proliferation and decreases population of EdU positive cells 2.4.2 Genetic interfering with mtROS production results in affected Cdk2 activation 2.5 Redox dependent Cdk2 activation via KAP binding 2.5.1 BTD labeling reveals Cdk2 as a direct target for oxidation 2.5.2 Preventing Cdk2 oxidation of cysteine 177 results in a drop of T160 phosphorylation 2.5.3 KAP binds to Cdk2 in a redox dependent manner 3. Discussion 3.1 ROS levels oscillate during the cell cycle in physiological cell culture conditions 3.2 Expression levels of NOX4 might determine the entry into S phase 3.3 Mitochondria are the main source of redox oscillations during the cell cycle 3.4 mtROS production contributes to Cdk2 activation and thus drives S phase progression 3.5 KAP phosphatase contributes to redox dependent regulation of Cdk2 3.6. Model of interconnection between the cellular redox environment and cell cycle regulation 4. Materials and methods 4.1 Cell culture 4.1.1 Cell lines 4.1.2 Cell treatments 4.1.3 Plasmids and cell line generation 4.1.4 RNA interference (RNAi) 4.1.5 EdU incorporation assay 4.2 Quantitative PCR (qPCR) 4.3 Protein studies 4.3.1 Cdk2-KAP/CAK interaction 4.3.2 Cdk2 sulfenylation by BTD labeling 4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses 4.4.1 Total lysate preparation 4.4.2 SDS-PAGE 4.4.3 Western blotting 4.5 Flow cytometry analysis (FACS) 4.6 Hypoxia experiments 4.7 Microscopy 4.8 Automated image and data analysis 4.9 Statistical methods 5. Contributions 6. Bibliography 7. Acknowledgements 8. Appendix

Rôle de la NADPH oxydase NOX4 dans la régulation de l'expression du symporteur sodium/iode (NIS) dans le cas du cancer papillaire de la thyroïde (PTC). L’activation autocrine de la voie TGF-β induite par BRAFV600E régule négativement l’expression du symporteur sodium/iode (NIS) via une production de ROS dépendante de la NOX4 dans le cancer papillaire de la thyroïde. Résumé : Le cancer papillaire de la thyroïde (PTC) est la pathologie thyroïdienne la plus répandue. Les mutations ponctuelles de BRAF sont retrouvées dans 40 à 60 % des cas de PTC. La transversion BRAFT1799A est la mutation de BRAF la plus fréquente. Les tumeurs porteuses de la mutation BRAFV600E sont souvent associées avec une diminution significative de l’expression du transporteur sodium/iode (NIS). Les résultats cliniques sur les patients atteints d’un cancer de la thyroïde porteur de la mutation BRAFV600E ont montré que l’inhibition de la voie MAPK ne permet pas de rétablir de manière assez importante l’expression du NIS induite par BRAFV600E. L’expression de BRAFV600E induit la sécrétion de TGF-β fonctionnel, qui inhibe l’expression des protéines thyroïdiennes impliquées dans le métabolisme de l’iode, et particulièrement le NIS. La NOX4 est surexprimée dans un nombre croissant de tumeurs, et particulièrement dans les cas de PTC. Dans le cas du cancer du sein, les mécanismes critiques pour le développement du cancer impliquent la régulation par le TGF-β de la NOX4 au niveau transcriptionnel via le facteur de transcription Smad3. Ces données nous mènent à considérer la NOX4 comme un candidat sérieux pour le rôle de système générateur de ROS contrôlé par la boucle autocrine TGF-β induite par BRAFV600E. Dans cette étude, nous avons tout d’abord observé une corrélation entre la présence de l’oncogène BRAFV600E, la surexpression de la NOX4 et l’inhibition de l’expression du NIS dans les cancers papillaires de la thyroïde. Puis, en utilisant la lignée BCPAP comme modèle in vitro de PTC, nous avons démontré BRAFV600E contrôle l’expression de la NOX4 et de la p22phox par l’intermédiaire de la signalisation TGF-β/Smads. La boucle TGF-β induite par BRAFV600E induit l’expression de la NOX4 et de la p22phox au niveau transcriptionnel via phosphorylated SMAD3. L’expression constitutive de la NOX4 et de la p22phox, qui forment ensemble un complexe NADPH oxydase fonctionnel, contribue au stress oxydatif observé dans les cellules BCPAP. Le traitement des cellules BCPAP par des scavengers de ROS comme le N-acetyl cysteine (NAC) et le Tiron permettent d’augmenter l’expression du NIS au niveau transcriptionnel et de rétablir l’expression d’une protéine fonctionnelle permettant la captation d’iode, ce qui indique que les ROS sont impliqués dans l’inhibition de l’expression du NIS. L’inhibition spécifique de la NOX4 par siRNA permet de réinduire l’expression de l’ARN messager et de la protéine NIS. Ces résultats montrent pour la première fois que les ROS produits par la NOX4 jouent un rôle critique dans l’inhibition de l’expression du NIS induite par BRAFV600E via la signalisation TGF-β/SMAD3. / BRAFV600E induced-TGF-β secretion down-regulates sodium iodide symporter (NIS) expression via NOX4-dependent ROS generation in papillary thyroid carcinoma. Abstract : Papillary thyroid cancer (PTC) is the most common thyroid pathology and BRAF point mutations account for 40-60% of tumors. BRAFT1799A is the most frequent BRAF mutation and BRAFV600E positive tumors are often associated with a significant loss of sodium/iodide symporter (NIS) expression. Clinical results on patients harboring thyroid cancer with BRAF mutation have recently shown that MAPK pathway inhibition does not fully reverts the BRAF-induced NIS repression. BRAFV600E expression induces secretion of functional TGF-β which is a repressor of thyroid specific genes such as NIS. Importantly, NOX4 has been shown to be prominently expressed in an increasing number of tumors, in particular in PTCs. In breast cancer cells, a critical mechanism for cancer development involves the transcriptional regulation of NOX4 by TGF-β. This result prompted us to test NOX4 as a ROS-producing candidate induced by BRAF-induced TGF-β. In this report, we first show in PTCs a correlation between BRAFV600E status, NOX4 overexpression, and low NIS expression level. Then, using BCPAP cells as an in vitro PTC model, we demonstrate that BRAFV600E controls NOX4 and p22phox expression via TGF-β signalling. The TGF-β autocrine loop activated by BRAFV600E induces NOX4 and p22phox expression at the transcriptional level via phosphorylated SMAD3. Both constitutively expressed proteins form a functional NADPH oxidase which produces high intracellular ROS levels. ROS scavengers increase the NIS expression at both mRNA and protein levels, and rescue a functional NIS, indicating that ROS are involved in the repression of NIS. Knocking down NOX4 with specific siRNAs reinduces NIS expression at both mRNA and protein levels. Altogether, these results show for the first time that NOX4-dependent ROS generation has a critical role in BRAF-induced NIS repression via the TGF-β/SMAD3 oncogenic signalling.

Une des propriétés majeures de la thyroïde est de capter l’iode de la circulation sanguine grâce à la présence d’un transporteur d’iodure (NIS pour Natrium Iodide Symporter). Cette capacité d’accumulation d’iode par les thyrocytes joue un rôle clé dans la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi dans le diagnostic et le traitement des cancers de la thyroïde. Cependant, en raison d’une diminution ou de l’absence de l’expression du NIS dans certaines tumeurs et métastases, des patients deviennent réfractaires à la radiothérapie métabolique et présentent une radiorésistance, causant ainsi un problème de santé publique.L’oncogène BRAFV600E, un puissant activateur de La voie MAP kinase, est détecté dans 40 - 60% des cancers thyroïdiens de type papillaires (CPT) qui représentent 80% de la totalité des cancers thyroïdiens. La mutation BRAFV600E est associée aux tumeurs thyroïdiennes les plus agressives. Cependant l’inhibition pharmacologique de la voie MAP kinase induite constitutivement par l’oncogène BRAFV600E ne permet pas, à elle seule, de rétablir l’expression du NIS chez des patients atteints d’un cancer de la thyroïde muté BRAFV600E. Ceci suggère que d’autres mécanismes compensatoires peuvent contribuer à la radiorésistance. Une étude récente menée sur un modèle murin a montré que la régulation négative du NIS par l’oncogène BRAFV600E est médiée par la voie du TGF beta. Une autre a montré que l’expression du NIS serait dépendante de l’état redox de la cellule, suggérant un rôle des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Dans les cellules les ROS peuvent être produites par les NADPH oxydases (NOX/DUOX). La thyroïde en exprime trois : DUOX2 nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi que DUOX1 et NOX4 dont le rôle physiologique reste inconnu. NOX4, surexprimé dans les CPTs, a été montré être un nouvel effecteur clé de la voie du TGF beta dans d’autres cancers.Dans mon projet de thèse, je me suis intéressée à l’étude du rôle de NOX4 dans la régulation négative du NIS dans les CPT mutés BRAFV600E. L’étude du mécanisme, réalisée à partir de deux lignées humaines issues de cancers papillaires mutés pour BRAF (BCPAP et 8505C), a permis d’établir que l’oncogène BRAFV600E contrôle l’expression de NOX4 au niveau transcriptionnel via la voie TGF-beta/Smad3. Ces résultats ont été validés sur une lignée de rat exprimant de manière conditionnelle BRAFV600E ainsi que sur des thyrocytes humains en culture primaire. De manière importante, l’utilisation d’antioxydants tels que le N-acetyl cystéine (NAC) ou l’inhibition spécifique de l’expression de NOX4 par ARN interférence permet de réinduire l’expression du NIS. Ces résultats qui montrent que les ROS produites par NOX4 inhibent l’expression du transporteur de l’iode (NIS) établissent un lien entre l’oncogène BRAFV600E et NOX4. Une analyse comparative de l'expression de NOX4 effectuée à partir de 500 cancers papillaires de la thyroïdes mutés ou non pour BRAF (données TCGA) confirme que NOX4 est significativement augmenté dans les cancers porteurs de la mutation BRAF et que ceci est corrélé à une diminution de l’ARNm du NIS. Par ailleurs, le niveau de NOX4 est inversement corrélé au score de différenciation thyroïdien, suggérant que NOX4 pourrait être impliqué dans le processus de dédifférenciation. Cette étude ouvre une nouvelle opportunité pour l’optimisation de l’utilisation de la radiothérapie métabolique dans le traitement des cancers thyroïdiens réfractaires à l’iode I131 et présente NOX4 comme une cible thérapeutique potentielle. / One of the major properties of the thyroid is iodine uptake from the bloodstream through an iodide transporter (NIS for Natrium Iodide Symporter). This capacity plays a key role in the thyroid hormones synthesis, but also in both diagnosis and treatment of thyroid cancer. However, due to a decrease or absence of the NIS expression in some tumors and metastases, patients become refractory to the metabolic radiotherapy and present a radioresistance, which cause a public health problem.The BRAFV600E oncogene, a potent activator of the MAP kinase pathway, is detected in 40-60% of papillary thyroid cancer (PTC), which represent 80% of total thyroid cancers. The BRAFV600E mutation is associated with the more aggressive thyroid tumors. However, the pharmacological inhibition of the MAP kinase pathway, constitutively induced by the BRAFV600E oncogene, is not able to restore alone the expression of NIS in patients with BRAFV600E mutated thyroid cancer. This suggests that other compensatory mechanisms may contribute to the radioresistance. A recent study in a mouse model demonstrated that downregulation of NIS by BRAFV600E oncogene is mediated through the TGF beta activation. An other showed that the expression of NIS is dependent on the redox status of the cell, suggesting a role for the reactive oxygen species (ROS). In cells, ROS can be produced by the NADPH oxidases (NOX/DUOX). The Thyroid gland expresses three of them: DUOX2, which is necessary for the thyroid hormones synthesis, but also DUOX1 and NOX4 whose the physiological role remains unknown. NOX4, which is overexpressed in the PTCs, has been shown to be a new key effector of the TGF beta pathway.In my thesis project, I was interested in studying the role of NOX4 in the negative regulation of NIS in BRAFV600E mutated CPT. The study of the mechanism, made from two human cell lines derived from BRAF-mutated papillary thyroid cancers (BCPAP and 8505C), has revealed that the oncogene BRAFV600E controls the expression of NOX4 at the transcriptional level via the TGF-beta/Smad3 pathway. These results were validated on both a rat thyroid cell line conditionnaly expressing BRAFV600E and on human thyrocytes in primary culture. Importantly, the use of antioxidants such as N-acetyl cysteine (NAC) or specific inhibition of NOX4 expression by RNA interference allow reinduction of NIS expression. These results, which show that ROS produced by NOX4 inhibit the expression of iodine transporter (NIS), establish a link between the oncogene BRAFV600E and NOX4. A comparative analysis of the NOX4 expression, made from 500 papillary thyroid cancers mutated or not for BRAF (TCGA data), confirms that NOX4 is significantly increased in BRAF-mutated cancers and that this is correlated with a decrease of NIS mRNA. Furthermore, the level of NOX4 is inversely related to thyroid differentiation score, suggesting that NOX4 might be involved in the dedifferentiation process. This study opens a new opportunity for optimizing the use of metabolic radiotherapy in the treatment of thyroid cancers refractory to radioiodine I131and makes NOX4 as a potential therapeutic target.

La NADPH oxydase, Nox4, appartient à la famille des Nox qui génèrent les espèces radicalaires de l'oxygène, ROS, en transférant un électron à l'oxygène moléculaire. Malgré sa large distribution dans les tissus, Nox4 est encore mal comprise. Contrairement aux autres Nox, Nox4 est unique par son activité constitutive et sa capacité à former H2O2. Les ROS sont des espèces bactéricides dans les phagocytes et des outils de signalisation dans les cellules non phagocytaires en étant associés à de nombreuses pathologies inflammatoires et du vieillissement. Une étude de la structure en lien avec la fonction de Nox4 permettra de mettre l'accent sur un mécanisme de fonctionnement et sur de nouvelles cibles thérapeutiques. 5 nouveaux anticorps monoclonaux ont été générés contre une construction recombinante tronquée (AA: 206-578) de Nox4. La spécificité de 3 anticorps monoclonaux (8E9, 5F9, 6B11) a été confirmée par western blot dans les cellules HEK293 transfectées et le cortex de rein humain. L'anticorps 8E9 est le seul à permettre un marquage des cellules TRex-Nox4 sans perméabilisation par FACS. L'immunofluorescence confocale a montré que Nox4 est localisée dans la zone périnucléaire et le réticulum endoplasmique. La microscopie TIRF a confirmé sa présence dans la membrane plasmique. Un phénomène intéressant est que 5F9 ne détecte pas Nox4 à la membrane plasmique. L'épitope de 8E9 reconnaît une région sur la dernière boucle E extracellulaire de Nox4 (222H-E241), tandis que les anticorps monoclonaux, 6B11 et 5F9 marquent respectivement les régions 6B11 (389S-P416) et 5F9 (392D-F398). Par ailleurs, seuls 5F9 et 6B11 inhibent l'activité de Nox4, ce qui suggère que les deux régions marquées par ces ACm sont impliquées dans le transfert d'électrons. Une étude ciblée sur la boucle E de Nox4 a permis de montrer que le changement de 2 cystéines modifie la nature des ROS générés par Nox4 avec la production de O2- au lieu de H2O2. O2- est mis en évidence par la formation de peroxynitrite en présence de NO. Par ailleurs l'ACm 8E9 diminue la production de H2O2 dans les cellules COS7 qui expriment Nox4 à la membrane plasmique alors que celle de O2- est augmentée. Des constructions recombinantes de Nox4 (native ou tronquée) ont été générées par induction bactérienne, E.Coli, et par un système de transcription/traduction (RTS). Les protéines correspondantes, solubles, ont été produites à grande échelle et l'activité diaphorase mesurée; cette activité est constitutive. L'étude de la topologie membranaire de Nox4 et p22phox a été abordée en préparant des protéines de fusion avec l'ubiquitine marquée à la GFP. Cette méthode, TDUFA, particulièrement originale, devrait permettre d'appréhender la topologie de l'hétérodimère Nox4/p22phox, actif.

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Local production of reactive oxygen species (ROS) and changes in the redox environment influence the metabolism and function of β cells of the Langerhans islets (LO). Changing the ratio between NAD(P)H / NAD(P)+ redox partners significantly affects sensitive proteins and ROS production. ROS are able to reversibly modify some amino acid residues (eg Cys, Met) of antioxidant enzymes and their interaction partners. Such a signaling cascade allows the transmission of a signal over longer distances and can also interfere with the influence of gene expression. The unique enzyme NADPH oxidase 4 (NOX4) is present on membranes within β cells and constitutively produces H2O2 depending on the presence of NAD(P)H. After glucose stimulation, both NAD(P)H and Nox4 mRNA levels increase. As previously observed in our laboratory, C57BL/6J mice with a specific Nox4 deletion in β cells have a disrupted biphasic insulin release and exhibit insulin resistance in fat and muscle tissue. We found that the absence of NOX4 in C57BL/6J mice affects LO architecture. Wildtype (WT) mice on a normal, predominantly carbohydrate diet (ND) have the majority of small LO with an area of up to 5 000 μm2 (measured on histological sections). High-fat diet (HFD) feeding of WT for 8 weeks leads to the development of diabetic phenotype and...