Nox4 est une source de ROS constitutive et ubiquitaire intervenant dans la signalisation intracellulaire. Une dérégulation de son activité a été associée à l'athérosclérose, la fibrose pulmonaire, le diabète et nous suspectons son rôle dans l'arthrose. L'arthrose est la résultante de phénomènes mécaniques et biologiques conduisant à la dégradation du cartilage et de l'os sous-chondral. Le chondrocyte, synthétisant et libérant des métalloprotéases matricielles (MMP), principales effectrices de la protéolyse matricielle, en est l'acteur principal. Dans la lignée de chondrocytes C-20/A4, l'IL-1β induit la synthèse de la collagénase MMP-1 de manière dépendante de l'activité de Nox4.Ces données suggèrent que Nox4 pourrait jouer un rôle dans la physiopathologie de l'arthrose. De manière à éclaircir le rôle de Nox4 dans le chondrocyte mais également pour proposer des pistes permettant de moduler cette activité, ce projet à été découpé en trois parties étroitement liées.1- Une meilleure connaissance de la topologie de Nox4 permettrait de mieux comprendre son fonctionnement pour mieux appréhender le développement d'inhibiteurs de son activité. L'étude de la topologie membranaire de Nox4 a été abordée en préparant des protéines de fusion avec l'ubiquitine marquée à la GFP. Cette méthode (ToDUFA) a permis pour la première fois de proposer expérimentalement une topologie de Nox4 avec 6 passages transmembranaires. 2- L'indentification de nouveaux partenaires modulateurs de l'activité de Nox4 pourrait être une première étape vers le traitement de l'arthrose. L'hème oxygénase (HO-1) est l'enzyme limitante dans le catabolisme de l'hème, molécule indispensable à l'activité catalytique des Nox. Les résultats montrent que HO-1 est capable de réprimer l'activité de Nox4 et suggèrent un mécanisme dépendant de la libération de monoxyde de carbone (CO) produit au cours de l'activité de HO-1. Ces résultats soulèvent également le rôle de l'hème dans le processus de maturation du complexe Nox4/p22phox. 3- Le rôle de Nox4 dans la physiopathologie de l'arthrose doit être validé sur des cultures primaires. Les résultats montrent que Nox4 est la seule Nox exprimée dans les chondrocytes primaires humains. Nox4, stabilisée par une augmentation protéique de p22phox après stimulation des chondrocytes par IL-1β, conduirait à la synthèse des MMP-1, MMP-13 et de l'ADAMTS4. Ces travaux montrent enfin que l'activité de Nox4 est impliquée dans le rétrocontrôle positif conduisant à la néosynthèse de l'IL-1β et à la persistance du catabolisme.En conclusion, les résultats suggèrent un rôle significatif de Nox4/p22phox dans la dégénérescence cartilagineuse. Nous décrivons un nouveau mécanisme de régulation de l'activité de Nox4 par HO-1 dans la lignée C-20/A4 et dans les chondrocytes primaires humains, préfigurant d'un rôle thérapeutique potentiel de HO-1. Enfin, le premier modèle topologique de Nox4 basé sur nos données expérimentales pourrait constituer une base pour le développement d'inhibiteurs ou de peptides compétiteurs. / Nox4 is a ubiquitous and constitutive source of ROS involved in intracellular signaling. However, a dysregulation of its activity has been shown to be involved in atherosclerosis, pulmonary fibrosis, diabetes, and we suspect its role in osteoarthritis (OA). OA is the consequence of mechanical and biological processes leading to the breakdown of cartilage and subchondral bone. Chondrocytes by synthesizing and releasing matrix metalloproteinases (MMP) mediates proteolysis of the extracellular matrix and is therefore the main actor of OA. In the C-20/A4 chondrocytes cell line, IL-1β leads to the synthesis of the MMP-1 collagenase in a Nox4 dependent manner suggesting that Nox4 might be a good therapeutic candidate for osteoarthristis treatment.In order to shed light on the role of Nox4 in the chondrocyte and to propose new strategies to modulate its activity, 3 mains objectives have been developed in this work.1 - A better understanding of the topology of Nox4 could allow a better comprehension of its function and the development of inhibitors: Membrane topology of Nox4 was assessed by preparing fusion proteins with ubiquitin fused with GFP's tag. This method (ToDUFA) allowed us for the first time to determine experimentally a topology organization for Nox4 with 6 transmembrane domains.2 - The identification of novel partners of modulation of Nox4 activity might be a first step toward the treatment of osteoarthritis: Heme oxygenase (HO-1) is the rate limiting enzyme in heme catabolism, an essential molecule for the catalytic activity of Nox. Our results showed that HO-1 was able to inhibit Nox4 activity and suggest a mechanism involving the release of carbon monoxide (CO) that was produced during the activity of HO-1. These findings also highlight the role of heme in the maturation process of Nox4/p22phox hetero-complex.3 - The role of Nox4 in the pathophysiology of osteoarthritis must be validated in primary cultures: Our results showed that Nox4 is the sole Nox isoform expressed in human primary chondrocytes. Nox4 activity, stabilized by the induced expression of p22phox in the IL-1β-stimulated chondrocytes, might mediate the synthesis of MMP- 1, MMP-13 and ADAMTS4. Finally, our data demonstrated that the activity of Nox4 is involved in the positive feedback leading to the neo-synthesis of IL-1β, mechanism that sustains the catabolism.In conclusion, our data suggest a significant role of Nox4/p22phox in cartilage degeneration. We describe a new mechanism by which HO-1 regulates the activity of Nox4 in C-20/A4 cell line and in primary human chondrocytes, predicting a potential therapeutic effect of HO-1. Finally, the first topological model of Nox4 based on our experimental data might provide a basis for the development of inhibitors or competitor peptides.

Ce travail montre qu’une protéine non encore décrite dans les phagocytes, la PAT1 « Protein interacting with APP Tail 1 », interagit avec la partie cytosolique de la p22phox (composant du cytochrome b558 membranaire de la NADPH oxydase). Nous avons utilisé différentes approches pour montrer cette interaction : le système double hybride, la technique de GST-pull down, la microscopie confocale et la technique de co-immunoprécipitation. De plus, nous avons montré que la PAT1a recombinante augmente l’activité de la NADPH oxydase, in vitro dans un système acellulaire reconstitué, et dans les cellules intactes (monocytes et cellules COS-phox). Cette nouvelle interaction régule donc l’activation de la NADPH oxydase et la production des FRO. Par ailleurs, la liaison de PAT1 aux microtubules pourrait favoriser l’assemblage du complexe NADPH oxydase pendant son activation. Ceci pourrait conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques qui préviennent la survenue des lésions tissulaires dans les maladies inflammatoires. / Reactive oxygen species (ROS) production by the phagocyte NADPH oxidase plays a crucial role in host defenses. NADPH oxidase is composed of the membrane flavocytochrome b558 components (p22phox and gp91phox/NOX2), and cytosolic components (p40phox, p47phox, p67phox and a small GTPase Rac1 or Rac2). In this work we identified PAT1 by double hybrid system as a potential partner of p22phox. The interaction between p22phox and PAT1a was further confirmed by in vitro GST pull-down assay, confocal microscopy and co-immunoprecipitation. Addition of recombinant PAT1a to the cell free-system enhanced NADPH oxidase activation and it’s over-expression in human monocytes and in COSphox cells increased ROS production in resting and fMLP-stimulated cells.These data clearly identify PAT1 as a novel regulator of NADPH oxidase activation in phagocytes.Inhibition of p22phox/PAT1 interaction could be used as new approach to limit ROS production by phagocytes at inflammatory sites.

Reactive oxygen species (ROS) have a role in cardiovascular health and disease. This study was undertaken to determine if ROS formation is influenced by either common genetic variations in p22phox, a subunit of the ROS generating enzyme NOX1, or by natural plant compounds with cardiovascular benefits. Hydrogen peroxide production was measured using Amplex Red, and superoxide generation was measured using NBT and MCLA. Each of seven p22phox variants supported ROS generation by NOX1. No differences were found in the rate of ROS production; however, unequal transfer of the p22phox gene may be a confounding factor. A variation in the 3’UTR of the p22phox gene led to lower p22phox protein levels, whereas none of the other variations affected mRNA or protein expression. The natural compound resveratrol acts as an antioxidant towards hydrogen peroxide, but not superoxide. Resveratrol does not inhibit NOX1 activity.

Ce travail montre qu'une protéine non encore décrite dans les phagocytes, la PAT1 " Protein interacting with APP Tail 1 ", interagit avec la partie cytosolique de la p22phox (composant du cytochrome b558 membranaire de la NADPH oxydase). Nous avons utilisé différentes approches pour montrer cette interaction : le système double hybride, la technique de GST-pull down, la microscopie confocale et la technique de co-immunoprécipitation. De plus, nous avons montré que la PAT1a recombinante augmente l'activité de la NADPH oxydase, in vitro dans un système acellulaire reconstitué, et dans les cellules intactes (monocytes et cellules COS-phox). Cette nouvelle interaction régule donc l'activation de la NADPH oxydase et la production des FRO. Par ailleurs, la liaison de PAT1 aux microtubules pourrait favoriser l'assemblage du complexe NADPH oxydase pendant son activation. Ceci pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques qui préviennent la survenue des lésions tissulaires dans les maladies inflammatoires.