Orientador: Ana Silvia Alves Meira Tavares Moura / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da adição de óleo de linhaça (OL) ou farelo de linhaça (FL) na dieta de ovelhas da raça Bergamácia em lactação, sobre o teor de aminas biogênicas e polifenóis no leite. Foram utilizadas 70 ovelhas distribuídas aleatoriamente entre os tratamentos. As dietas experimentais foram: Controle (CT) – concentrado sem adição de suplementação lipídica; Óleo de linhaça (OL) – concentrado com adição de 3% de OL (%MS); e Farelo de linhaça (FL) – concentrado com adição de 15% de FL (%MS). Durante todo o período experimental, os animais foram mantidos confinados em baias coletivas e recebiam dieta composta por 60% de silagem de milho e 40% de concentrado referente a cada tratamento. As ovelhas foram ordenhadas uma vez ao dia, no período da manhã, e tiveram suas produções controladas diariamente. As amostras de leite para a avaliação das aminas biogênicas foram colhidas a cada 14 dias a partir do primeiro dia de ordenha e as amostras de leite para análise dos polifenóis foram colhidas a cada 14 dias a partir do quinto dia pós-parto. O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado e os dados avaliados por análise de variância (P< 0,05). Não foi encontrada a presença de cadaverina no leite e a serotonina foi a amina predominante no leite de ovelhas em todos os tratamentos. O tratamento controle apresentou maiores teores de espermina (0,300 mg/100g) entretanto, o tratamento com óleo de linhaça apresentou menores teores de ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim in this study was to determine the effects of feeding diets with linseed oil (OL) or flaxseed meal (FM) of Bergamasca ewes on to the content of biogenic amines and phenols in milk.Seventy ewes were distributed in three groups: Control (CT) - no lipids; Linseed (L) – with addition of 3% of OL (DM basis); and Flaxseed meal (F) – with addition of 15% of FM (DM basis). Throughout the experiment, the ewes remained confined in collective pens and were fed a diet containing 60% corn silage and 40% concentrate according to each treatment. They were mechanically milked once a day and had their productions controlled. The milk samples for biogenic amines analysis were collected every 14 days from the first milking day and the milk samples for phenols analysis were collected every 14 days from the 5th day postpartum until de end of the lactation. The experiment was conducted in a random customized design and the data evaluated by analysis of variance (P< 0,05). Cadaverine was not found and the serotonine was the predominant amine in the milk from ewes in all treatments. The control treatment showed high contents of espermine (0,300 mg/100g), however the OL had lower contents of histamine (0,0049 mg/100g). The espermidine was the biogenic amine more correlated with greater numbers of amines. There was no difference between treatments for polyphenols contents in milk, however the treatment with oil it was more efficient. / Doutor

Orientador: Marcia Ortiz Mayo Marques / Coorientador: Giuseppina Pace Pereira Lima / Banca: Marco Antonio Tecchio / Banca: Igor Otavio Minatel / Banca: Leandro Wang Hantao / Banca: Ricardo Alfredo Kluge / Resumo: O consumo de sucos de uva e vinhos tintos apresenta inúmeros benefícios para a saúde humana. Tem efeito comprovado contra doenças crônicas não transmissíveis, pois atuam como antioxidantes. O perfil fitoquímico determina a qualidade dessas bebidas; os compostos fenólicos fornecem principalmente a atividade funcional e pigmentação, as substâncias voláteis fornecem o aroma característico e as aminas biogênicas dependendo do tipo e o teor atuam como benéficas ou alergênicas para o ser humano. Atualmente o consumo dessas bebidas no Brasil apresenta um crescimento significativo e dessa forma, é de suma importância a viabilização de soluções tecnológicas para potencializar a cadeia produtiva da vitivinicultura brasileira. A introdução de novas cultivares com condições apropriadas para elaboração de sucos e vinhos de alta qualidade, alta pigmentação, alta produção e adequada adaptação aos diferentes climas brasileiros, por meio do melhoramento genético é fundamental para satisfazer os consumidores cada vez mais exigentes de produtos de qualidade. Neste estudo foram avaliados os constituintes bioativos (polifenóis e poliaminas), composição de aromas e a capacidade antioxidante de vinhos tintos e sucos elaborados a partir de cultivares de uvas híbridas (BRS Rúbea, BRS Cora, BRS Carmen, BRS Violeta, BRS Magna, BRS CC30, Seleção 13 e Seleção 34) e duas uvas hibridas cultivadas no Brasil (Bordô e Isabel). Além disso, foi realizada avaliação da concentração dos compostos fenólicos, aminas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The consumption of grape juices and red wines presents many benefits for human health. It has a confirmed effect against non-transmissible chronic diseases, because they act as antioxidants. The phytochemical profile determines the quality of these beverages; the phenolic compounds provide mainly the functional activity and the pigmentation, the volatile substances provide the characteristic aroma and the biogenic amines, depending on the type and content, can be beneficial or harmful for the human being. Nowadays, the consumption of these beverages in Brazil presents a significant growth and, thus, it is of great importance the facilitation of technological solutions to enhance the productivity chain of the Brazilian viniculture. The introduction of new cultivars with appropriate conditions for elaborating juices and wines of high quality, high pigmentation, high production and adequate adaptation to the different Brazilian climates, with the use of genetic improvement, is fundamental to satisfaction the customers more and more demanding of quality products. In this study, we evaluated the bioactive constituents (polyphenols and polyamines), composition of aromas and antioxidant capacity of red wines and juices elaborated from hybrid grapes (BRS Rúbea, BRS Cora, BRS Carmen, BRS Violeta, BRS Magna, BRS CC30, Seleção 13 and Seleção 34) and two hybrid grapes cultivated in Brazil (Bordô and Isabel). In addition, we performed the evaluation of the phenolic compounds concentration, bioactive amines and isotopic analysis (to detect adulteration) in commercial juices and wines to evaluate the quality in function of these parameters. In hybrid grapes beverage samples, the concentrations found for the phenolic compounds profile, as well as for the total phenols and total anthocyanins, were notably higher in wines than in juices, which probably explains the higher antioxidant capacity of wines... / Doutor

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:23:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carmignotto_GabrielaPannunzio_M.pdf: 6143089 bytes, checksum: aa61b4762764a38220fc51226e410a80 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os fragmentos Fab de imunoglobulina G são utilizados principalmente em testes diagnósticos e terapias. Por apresentarem tamanho reduzido, os fragmentos Fab possuem maior facilidade de penetração em tecidos e maior velocidade de circulação no plasma quando comparados à IgG intacta. A purificação dos fragmentos Fab é realizada geralmente por cromatografia de afinidade utilizando os ligantes bioespecíficos proteína A, proteína G e proteína L. Entretanto, esses ligantes apresentam algumas desvantagens, entre elas seu elevado custo e a necessidade de eluição em condições drásticas. Como alternativa, muitos estudos têm sido realizados empregando ligantes pseudobioespecíficos e de interação mista visando o desenvolvimento de novas estratégias que proporcionem a purificação dos fragmentos Fab. Neste contexto, este trabalho tem por objetivo avaliar a seletividade das poliaminas ?-aminohexil e poli(etilenoimina) imobilizadas em gel de agarose na separação de fragmentos Fab humano a partir de uma solução de IgG humana clivada enzimaticamente, empregando diferentes sistemas tamponantes. A recuperação seletiva dos fragmentos Fab foi avaliada por eletroforese SDS-PAGE, Western blot e imunodifusão radial. Os resultados indicaram que nas cromatografias realizadas em gel ?-aminohexil-agarose em Tris-HCl a pH 8,0, os fragmentos Fab foram recuperados nas frações não retidas, com valores calculados de pureza de 97% e recuperação de 100%. Nas cromatografias realizadas em gel PEI-agarose empregando o tampão Tris-HCl nos valores de pH de 7,5 e 8,0, a pureza obtida foi de 96% e a recuperação foi de 94% e 93%, respectivamente. As curvas de ruptura para os adsorventes foram determinadas e os resultados obtidos indicaram melhor recuperação do fragmento Fab com alta pureza no flowthrough para o ligante ?-aminohexil (2,7 mg) quando comparado ao ligante PEI (0,8 mg). A isoterma de adsorção de fragmentos Fc para o adsorvente ?-aminohexil-agarose foi determinada e os parâmetros capacidade de adsorção de 44,32 mg.mL-1 de gel e constante de dissociação de 1,11.10-5 mol.L-1 foram obtidos por ajuste destes parâmetros segundo o modelo de Langmuir-Freundlich. O valor de n obtido foi igual a 1,68, indicando cooperatividade positiva na adsorção dos fragmentos Fc e IgG não clivada. Os resultados mostraram que as poliaminas ?-aminohexil e PEI apresentaram potencial como ligantes para a purificação de fragmentos Fab / Abstract: Fab fragments from immunoglobulin G are considered an important tool for the therapy and diagnose of diseases. Their reduced molecular size is an advantage over the intact IgG allowing faster tissue penetration and circulation in the plasm. Fab fragments are often purified by affinity chromatography using biospecifics ligands, such as protein A, protein G, and protein L. However, the use of those ligands is hindered by their high costs and elution in drastic conditions. Several studies have been performed for the development of new techniques to improve the chromatographic purification of Fab fragment, e.g., using pseudobiospecifics or mix-mode ligands. In this context, we have evaluated the efficiencies of polyamines ?-aminohexyl and poly(ethyleneimine) (PEI) ligands immobilized in agarose gel aiming the purification of human Fab fragments. Our chromatographic studies were conducted feeding cleaved human IgG solution into the aforementioned adsorbents using different adsorption buffers and conditions. The selectivity towards Fab fragments was evaluated using SDS-PAGE, Western blot, and radial immunodiffusion. The chromatography performed with ?-aminohexyl-agarose using Tris-HCl buffer pH 8.0 recovered 100% of the Fab fragments with 97% of purity. Studies done with adsorbent PEI-agarose using Tris-HCl pH 7.5 and 8.0 as adsorption buffers recovered 94% and 93% of Fab fragments, respectively, with 97% of purity. Breakthrough curves experiments showed that the ?-aminohexyl ligand was superior than PEI ligand in terms of recovering Fab fragment with high purity in flowthrough (2.7 mg against 0.8 mg, respectively). The adsorption isotherm of ?-aminohexil-agarose adsorbent was determined adjusted by the Langmuir-Freundlich model as well (Qm: 44.32 mg.mL-1 of gel; Kd: 1.11.10-5 mol.L-1). Additionally, Fc fragments and IgG binding showed positive cooperativity (n=1.68). All these results indicate that ?-aminohexyl and PEI polyamines are potential ligands for the purification of Fab fragments and can possibly improve the existing techniques employed for this purpose / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

Las poliaminas regulan procesos de crecimiento y diferenciación celular, y su desregulación está relacionada con diferentes patologías incluyendo el cáncer. Las antizimas (AZs) de ornitina descarboxilasa (ODC) inhiben tanto su biosíntesis, como su captación, regulando los niveles intracelulares de poliaminas. En esta tesis se ha caracterizado una nueva proteína inhibidora de antizimas (AZIN2) que posee alta homología con ODC y el inhibidor de antizimas previamente conocido (AZIN1). Esta nueva proteína está desprovista de actividad enzimática, pero es capaz de revertir la acción que las tres antizimas conocidas ejercen sobre la actividad ODC y la captación de poliaminas. A diferencia de sus proteínas homólogas, AZIN2 se localiza subcelularmente en el ERGIC, y se expresa específicamente en cerebro y testículo, pero de forma muy abundante en espermátidas y espermatozoides, al igual que AZ3, indicando que estas dos proteínas juegan un importante papel regulando los niveles de poliaminas durante la espermiogénesis. / Polyamines regulate cell growth and differentiation, and the alteration of their homeostasis is related to different diseases, including cancer. Ornithine decarboxylase (ODC) antizymes (AZs) regulate polyamine levels by inhibiting both their biosynthesis and the cellular uptake. In this work, a new ODC paralogue has been characterized as a novel antizyme inhibitor protein that has been named AZIN2. This protein lacks decarboxylating activity, but it is able to reverse the action of any of the three antizymes on ODC activity and polyamine uptake. Unlike its homologue proteins ODC and AZIN1, AZIN2 is located in the ERGIC, and it is specifically expressed in brain and testes. The abundant expression in spermatids and spermatozoa, concomitantly with AZ3, suggests that both proteins may play an important role in regulating polyamine levels during spermiogenesis

As leishmanioses constituem um complexo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania. São transmitidas pela picada de fêmeas parasitadas do gênero Phlebotomus e/ou Lutzomyia. A leishmaniose é uma doença zoonótica que afeta mais de 12 milhões de pessoas no mundo, e constituem uma preocupação para a saúde pública. A arginase de Leishmania é a primeira enzima da via das poliaminas e constitui um importante alvo terapêutico devido ao seu papel ativo na sobrevivência do parasita no hospedeiro. Neste trabalho, 78 moléculas sintéticas e naturais de diferentes grupos químicos foram testadas com objetivo de determinar a sua capacidade de inibição da enzima arginase recombinante de Leishmania (L.) amazonensis (ARG-LA). Foram considerados inibidores da ARG-LA os compostos que apresentaram uma inibição &ge; 70% a 100 &micro;M. Os resultados revelaram 28,2 % de compostos com elevado potencial de inibição da ARG-LA, exibindo valores de IC50 na faixa micromolar. A cinética de inibição foi determinada pelo método de Dixon e Cornish-Bowden e revelou diferentes mecanismos de inibição enzimática. As moléculas sintéticas com potencial inibitório da ARG-LA correspondem aos ésteres e cinamidas biosintéticos, cinamidas derivados do ácido cafeico e pirazolopirimidinas. Além disso, foram testados 4 compostos naturais estruturalmente relacionados ao ácido caféico: piceatannol e 3 ácidos salvianólicos (A, B e D). Os resultados poderão servir de ponto de partida para o planejamento e síntese de novos fármacos para tratamento da leishmaniose, baseado na inibição da ARG-LA. / Leishmaniasis is a complex of diseases caused by Leishmania protozoa. They are transmitted by the bite of parasitized females of the Phlebotomus and/or Lutzomyia genus. Leishmaniasis is essentially a zoonotic disease, affecting more than 12 million people in the world and are a public health concern. Leishmania arginase is the first enzyme in the polyamine pathway and constitutes an important therapeutic target due to its active role in the parasite\'s survival in the host. In this work 78 compounds (synthetic and natural) of different chemical groups were tested to determine their ability to inhibit the recombinant Leishmania (L.) amazonensis arginase (LA-ARG). The IC50 and Ki were determined to the compounds that showed inhibition &ge; 70% at 100 &micro;M. The results indicated that 28.2% of the compounds have a high potential for LA-ARG inhibition, with IC50 values in the micromolar range and different enzymatic inhibition mechanisms. The main synthetic groups with the high inhibitory potential of the enzyme corresponding to the caffeic acid derivatives, pyrazolopyrimidines, and the natural compounds piceatannol and salvianolic acids. These results indicate a potential for the synthesis of new drugs for the treatment of leishmaniasis, based on parasite arginase inhibition.

A Proteína Transportadora de Poliaminas (PotD) é um antígeno importante para a virulência de Streptococcus pneumoniae in vivo, capaz de proteger camundongos imunizados contra infecção sistêmica, além de reduzir a colonização da nasofaringe dos animais. Porém, visando ampliar a cobertura vacinal, a combinação com outros antígenos da bactéria se faz necessária. Este trabalho teve como objetivo aprofundar o estudo sobre a resposta imune gerada contra a proteína PotD, sozinha ou em fusão com duas outras proteínas pneumocócicas: o derivado de Pneumolisina, PdT, e a proteína de superfície de pneumococo A (PspA). Para tanto, os genes potD, pdT e pspA foram clonados e expressos, sozinhos ou fusionados, gerando as proteínas híbridas rPotD-PdT e rPspA-PotD. As proteínas recombinantes e os híbridos foram utilizados na imunização subcutânea de camundongos BALB/c, gerando elevados níveis de anticorpos. O soro dos animais imunizados foi capaz de reconhecer e se ligar à superfície de diferentes isolados de pneumococos, e de ampliar a fagocitose da bactéria por células peritoneais murinas in vitro. Em todos os ensaios, os híbridos se mostraram mais eficazes do que as proteínas isoladas, induzindo anticorpos capazes de potencializar a fagocitose dos pneumococos. A resposta imune celular foi caracterizada pela produção de INF-&#947;, IL-2 e IL-17 pelos esplenócitos, e um aumento na produção de NO pelos fagócitos peritoneais dos animais imunizados. Apesar dos resultados promissores in vitro, a proteína rPotD-PdT não foi capaz de induzir proteção em nenhum dos modelos avaliados; em contraste, a fusão rPspAPotD foi capaz de proteger os camundongos contra sepse por dois isolados virulentos de pneumococo, além de reduzir a colonização na nasofaringe. Por fim, demonstramos que a adição das poliaminas transportadas por PotD, espermidina e putrescina, à cultura de pneumococos interfere na formação de biofilme in vitro. Cnsiderando o importante papel da formação de biofilmes na colonização, este resultado sugere um possível mecanismo de ação da PotD durante a colonização por pneumococo. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem que a utilização de uma formulação híbrida, rPspA-PotD, compreende uma estratégia vacinal promissora, capaz de proteger contra colonização e sepse pneumocócica, pela produção de anticorpos opsonizantes e ativação de citocinas protetoras, como IL-17. / Polyamine Transporter D (PotD) is an important antigen for Streptococcus pneumoniae virulence in vivo, protecting immunized mice against systemic infection and reducing the bacterial load in the nasopharynx of immunized animals. However, in order to extend vaccine coverage, the combination of PotD with other antigens of the bacterium is required. The present study aimed at expanding the investigation of the immune response generated against PotD alone or fused with two other pneumococcal proteins: the Pneumolysin derivative, PdT and Pneumococcal Surface Protein A (PspA). Therefore, the potD, pdt and pspA genes were cloned and expressed, either alone or in fusion, generating the hybrid proteins rPotD-PdT and rPspA-PotD. The recombinant proteins and hybrids were used for subcutaneous immunization of BALB/c mice, generating high levels of antibodies. Sera from immunized animals were able to recognize and bind onto the surface of different pneumococcal strains, and to enhance phagocytosis of the bacterium in vitro. In all tests, the hybrids were more effective than the isolated proteins. The cellular immune response was characterized by the production of INF-&#947;, IL-2 and IL-17 by splenocytes and increased production of NO by peritoneal cells of the immunized animals. Despite promising results in vitro, rPotD-PdT protein was not able to induce protection in any of the tested challenge models. In contrast, rPspA-PotD fusion was able to protect mice against sepsis with two virulent isolates of pneumococcus and led to reduction in bacterial loads in the nasopharynx of challenged animals. Finally, we demonstrate that the addition of exogenous polyamines, spermidine, and putrescine, in the pneumococcal culture interfered with biofilm formation in vitro. Considering the important role of biofilm formation for successful colonization, this result suggests a possible mechanism of action of PotD during colonization by pneumococcus. Taken together, the results suggest that the use of the hybrid rPspA-PotD comprises a promising vaccine strategy, able to protect against colonization and pneumococcal sepsis, through the production of opsonizing antibodies and activation of protective cytokines, such as IL-17.

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A família Amaryllidaceae é reconhecida como fonte de compostos bioativos, sendo o isolamento e elucidação estrutural de seus alcaloides, aliado às avaliações farmacológicas, um tema importante. Estudos mostram que o mecanismo de ação da citotoxicidade desses alcaloides é seletivo e depende da linhagem celular. Trichomonas vaginalis é um protozoário parasita que causa a tricomonose, a doença sexualmente transmissível de origem não viral mais comum no mundo. Além de ser considerado um importante organismo patogênico, suas características bioquímicas peculiares, como a ausência de mitocôndrias, torna o tricomonas um adequado modelo para estudos de vias metabólicas de morte celular. A atividade anti-T. vaginalis dos alcaloides de Amaryllidaceae licorina e candimina, assim como o potencial citotóxico de diaminas sintéticas, foram investigados. Estudos de semi-síntese com a licorina também foram desenvolvidos. Nossos resultados mostraram que a licorina e candimina induzem importantes alterações na ultraestrutura dos parasitos e nenhum marcador morfológico clássico de apoptose, como corpos apoptóticos, foi observado. Além disso, nem a fragmentação do DNA genômico nem a exposição de resíduos de fosfatidilserina foram detectadas. Por outro lado, ambos os alcaloides atrasaram o ciclo celular do parasito e inibiram a atividade das enzimas NTPDase e ecto-5`- nucleotidase, importantes na manutenção da relação parasito/hospedeiro. O alcaloide pró-apoptótico licorina e a candimina induziram morte celular no parasito amitocondriado T. vaginalis por um mecanismo de ação que não cumpre as características morfológicas de apoptose. Entretanto, similaridades com a morte celular denominada paraptose foram observadas: intensa vacuolização citoplasmática periférica aliada à integridade nuclear. Considerando que a citotoxicidade dos alcaloides pode ser considerada moderada (250 μM), derivados de poliaminas foram escolhidos para desenvolver estudos de semi-síntese com a licorina e aperfeiçoar a atividade do alcalóide. Poliaminas são moléculas catiônicas de estruturas simples, essenciais para a diferenciação celular e regulação do ciclo celular. Neste trabalho demonstrou-se a síntese e avaliação da atividade anti-T. vaginalis de uma série de derivados de diaminas, dos quais N-hexadecil-1,4-butanodiamina apresentou CIM igual a 2,5 μg/ml, duas vezes mais ativo em comparação ao metronidazol, utilizado como composto de referência. A hibridização molecular da licorina com as diaminas foi prejudicada pela instabilidade da licorina mesilada, intermediário chave para prosseguir a rota sintética. No entanto, seis derivados inéditos da licorina, todos ésteres, aromáticos ou alifáticos, foram sintetizados. / Amaryllidaceae family has proven to be plentiful sources for therapeutic agents. Hence, the isolation, biology and chemistry of the Amaryllidaceae alkaloids make an important subject. Investigations on cytotoxic mechanisms of these alkaloids indicate a promising selective cell-type-dependent cytotoxicity. Trichomonas vaginalis is a parasite that causes trichomonosis, the number one non-viral sexually-transmitted disease in the world. However, whilst T. vaginalis is a prime pathogenic target, its lack of mitochondria makes it a suitable biochemical model to study cell death-related mechanisms. Anti-T. vaginalis activity of lycorine and candimine alkaloids were investigated, as well as the cytotoxic potential of diamine analogs. Finally, studies on lycorine semi-synthesis were developed. Our results showed that, after lycorine and candimine treatment, no hallmark suggestive of apoptosis were observed, such as apoptotic bodies, but instead several important ultrastructural alterations, assessed by electronic microscopy. Additionally, DNA fragmentation and membrane phosphatidylserine exposure were not detected. Analysis showed that lycorine and candimine arrested T. vaginalis cell cycle and inhibited the NTPDase and ecto-5`- nucleotidase activities, important enzymes on parasite/host relationship. The proapoptotic alkaloid, lycorine, and the lactone alkaloid, candimine, caused cell death in the amitochondriate T. vaginalis by a mechanism of action that fails to completely fulfill the criteria for apoptosis. However, some similarities were observed to paraptotic cell death, like intense cytoplasmic periferic vacuolization and nuclear integrity. Since the cytotoxic potential of the alkaloids was moderated (250 μM), the polyamines analogs were chosen to investigate the anti-T. vaginalis activity and to develop semi-synthesis studies with lycorine in order to improve the alkaloid cytotoxicity. Polyamines are simple structured aliphatic amines essential for cell proliferation and differentiation and it has been shown that interfering with their function or biosynthesis the cellular growth can be blocked. Our results showed the synthesis of a series of diamine derivatives, and N-hexadecil-1,4-butanediamine was found to be the most active compound in vitro against T. vaginalis with MIC of 2.5 μg/mL, twice more active in comparison to the reference drug metronidazole. The molecular hybridization of lycorine with diamines was impaired by the unsuccessful synthesis of the lycorine mesilate, a key intermediary on the synthetic route. However, six new lycorine ester derivatives were synthesized.

A família Amaryllidaceae é reconhecida como fonte de compostos bioativos, sendo o isolamento e elucidação estrutural de seus alcaloides, aliado às avaliações farmacológicas, um tema importante. Estudos mostram que o mecanismo de ação da citotoxicidade desses alcaloides é seletivo e depende da linhagem celular. Trichomonas vaginalis é um protozoário parasita que causa a tricomonose, a doença sexualmente transmissível de origem não viral mais comum no mundo. Além de ser considerado um importante organismo patogênico, suas características bioquímicas peculiares, como a ausência de mitocôndrias, torna o tricomonas um adequado modelo para estudos de vias metabólicas de morte celular. A atividade anti-T. vaginalis dos alcaloides de Amaryllidaceae licorina e candimina, assim como o potencial citotóxico de diaminas sintéticas, foram investigados. Estudos de semi-síntese com a licorina também foram desenvolvidos. Nossos resultados mostraram que a licorina e candimina induzem importantes alterações na ultraestrutura dos parasitos e nenhum marcador morfológico clássico de apoptose, como corpos apoptóticos, foi observado. Além disso, nem a fragmentação do DNA genômico nem a exposição de resíduos de fosfatidilserina foram detectadas. Por outro lado, ambos os alcaloides atrasaram o ciclo celular do parasito e inibiram a atividade das enzimas NTPDase e ecto-5`- nucleotidase, importantes na manutenção da relação parasito/hospedeiro. O alcaloide pró-apoptótico licorina e a candimina induziram morte celular no parasito amitocondriado T. vaginalis por um mecanismo de ação que não cumpre as características morfológicas de apoptose. Entretanto, similaridades com a morte celular denominada paraptose foram observadas: intensa vacuolização citoplasmática periférica aliada à integridade nuclear. Considerando que a citotoxicidade dos alcaloides pode ser considerada moderada (250 μM), derivados de poliaminas foram escolhidos para desenvolver estudos de semi-síntese com a licorina e aperfeiçoar a atividade do alcalóide. Poliaminas são moléculas catiônicas de estruturas simples, essenciais para a diferenciação celular e regulação do ciclo celular. Neste trabalho demonstrou-se a síntese e avaliação da atividade anti-T. vaginalis de uma série de derivados de diaminas, dos quais N-hexadecil-1,4-butanodiamina apresentou CIM igual a 2,5 μg/ml, duas vezes mais ativo em comparação ao metronidazol, utilizado como composto de referência. A hibridização molecular da licorina com as diaminas foi prejudicada pela instabilidade da licorina mesilada, intermediário chave para prosseguir a rota sintética. No entanto, seis derivados inéditos da licorina, todos ésteres, aromáticos ou alifáticos, foram sintetizados. / Amaryllidaceae family has proven to be plentiful sources for therapeutic agents. Hence, the isolation, biology and chemistry of the Amaryllidaceae alkaloids make an important subject. Investigations on cytotoxic mechanisms of these alkaloids indicate a promising selective cell-type-dependent cytotoxicity. Trichomonas vaginalis is a parasite that causes trichomonosis, the number one non-viral sexually-transmitted disease in the world. However, whilst T. vaginalis is a prime pathogenic target, its lack of mitochondria makes it a suitable biochemical model to study cell death-related mechanisms. Anti-T. vaginalis activity of lycorine and candimine alkaloids were investigated, as well as the cytotoxic potential of diamine analogs. Finally, studies on lycorine semi-synthesis were developed. Our results showed that, after lycorine and candimine treatment, no hallmark suggestive of apoptosis were observed, such as apoptotic bodies, but instead several important ultrastructural alterations, assessed by electronic microscopy. Additionally, DNA fragmentation and membrane phosphatidylserine exposure were not detected. Analysis showed that lycorine and candimine arrested T. vaginalis cell cycle and inhibited the NTPDase and ecto-5`- nucleotidase activities, important enzymes on parasite/host relationship. The proapoptotic alkaloid, lycorine, and the lactone alkaloid, candimine, caused cell death in the amitochondriate T. vaginalis by a mechanism of action that fails to completely fulfill the criteria for apoptosis. However, some similarities were observed to paraptotic cell death, like intense cytoplasmic periferic vacuolization and nuclear integrity. Since the cytotoxic potential of the alkaloids was moderated (250 μM), the polyamines analogs were chosen to investigate the anti-T. vaginalis activity and to develop semi-synthesis studies with lycorine in order to improve the alkaloid cytotoxicity. Polyamines are simple structured aliphatic amines essential for cell proliferation and differentiation and it has been shown that interfering with their function or biosynthesis the cellular growth can be blocked. Our results showed the synthesis of a series of diamine derivatives, and N-hexadecil-1,4-butanediamine was found to be the most active compound in vitro against T. vaginalis with MIC of 2.5 μg/mL, twice more active in comparison to the reference drug metronidazole. The molecular hybridization of lycorine with diamines was impaired by the unsuccessful synthesis of the lycorine mesilate, a key intermediary on the synthetic route. However, six new lycorine ester derivatives were synthesized.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1243805 bytes, checksum: 3c8248afdd915bfc2ff4163ea2ee6cdc (MD5) Previous issue date: 2006-02-21 / Universidade Federal de Minas Gerais / The present study was conducted to evaluate possible interactions between ethylene and polyamines levels upon in vitro morphogenesis of two passion fruit species (Passiflora cincinnata Masters and P. edulis Sims f. flavicarpa Degener, population FB-100). Hypocotyl-derived segments (average 10 mm length) were cultivated in MS-based medium, with B5 vitamin complex, 30 g.L-1 sucrose, 100 mg.L-1 myo-inositol, 10% (v/v) coconut water, 0,5 mg.L-1 6-benzyladenine (BA) ), and solidified with 2.5 g L-1 Phytagel®. Ethylene and polyamines were assayed at different times in culture (3, 6, 9, 12, and 30 d). Aiming to characterize the shoot-buds differentiation histological analyses were performed with previous fixation of the samples in FAA 50%. The effects of ethylene inhibitor, promoter and scavenger (aminoethoxyvinilglycine AVG, silver tiosulfate STS, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid ACC, and mercury perchlorate- MP, respectively), polyamines (spermine, spermidine and putrescine) and its inhibitor (methylglyoxal-bis-guanylhydrazone - MGBG) were also analysed. A delayed organogenic response occurred in explants of P. edulis f. flavicarpa as compared to P. cincinnata, though coincident with a delayed detection of ethylene and polyamine in cultures of the former. Similar morphogenic responses were observed in explants cultured onto AVG- or MPsupplemented medium, whereas ACC-treated cultures impaired organogenic responses. Polyamine-supplemented cultures displayed morphogenic responses similar to those from control treatment. However, MGBG similarly to ACC lessened the morphogenic responses. Interestingly, explants at redifferentiation stages displayed high expansion and elongation rates, linked to elevated ethylene and polyamine, suggesting that competition between their biosynthetic pathways is highly regulated and plastic, and that these interactions may play a key role in differentiation process. / O presente trabalho teve por objetivo investigar as possíveis interrelações entre etileno e poliaminas sobre a capacidade morfogênica de explantes de hipocótilo de duas espécies de maracujazeiro (Passiflora cincinnata Masters e Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener população FB-100). Explantes de hipocótilo retirados de plântulas germinadas in vitro foram cultivados em meio contendo sais MS, complexo vitamínico B5, 30 g.L-1 de sacarose, 100 mg.L-1 de inositol, 10% (v/v) de água de coco, 0,5 mg.L-1 6-benzilaminopurina (BAP) e solidificado com 2,5 g.L-1 de Phytagel. Os níveis de etileno e poliaminas foram mensurados ao longo do período de indução da organogênese. Concomitantemente, foi realizada a histologia com a fixação do material vegetal em F.A.A. 50% e acompanhamento da ontogênese das gemas adventícias, de forma a se caracterizar os diferentes eventos envolvidos na rediferenciação celular e a regulação dos níveis de poliaminas e etileno. Também foram realizados tratamentos com inibidores (aminoetoxivinilglicina AVG, tiossulfato de prata - STS), seqüestrador (perclorato de mercúrio PM) e promotor da produção de etileno (ácido 1-carboxílico 1-aminociclopropano - ACC), além da adição de poliaminas (putrescina, espermidina e espermina) e de seu inibidor (metilglioxal-bis-guanil hidrazona MGBG) ao meio de cultivo. Foi observado atraso nas respostas morfogênicas em P. edulis f. flavicarpa em comparação com P. cincinnata, sendo coincidente com o atraso observado nas concentrações de poliaminas e etileno mensurados naquela espécie. As respostas morfogênicas dos explantes foram semelhantes nos tratamentos com inibidores e seqüestrador, sendo observado comprometimento da organogênese apenas no meio de cultivo com adição isolada de ACC. Nos tratamentos com poliaminas não foi observada diferença em relação ao tratamento controle. Todavia, o tratamento com MGBG apresentou respostas semelhantes àquele com ACC levando à redução da resposta morfogênica. Observou-se que culturas em estádios de rediferenciação, caracterizadas por apresentarem altas taxas de expansão e alongamento, apresentaram níveis elevados de etileno associados a altos níveis de poliaminas, sugerindo que a competição entre as duas rotas biossintéticas é altamente regulada e plástica, e que a interação seria a peça chave para a definição da diferenciação.