Diversos estudos indicam que touros europeus (Bos taurus) apresentam uma maior susceptibilidade ao estresse térmico com um consequentemente aumento do estresse oxidativo. Este, por sua vez, leva a uma diminuição na qualidade espermática. O espermatozoide possui, fisiologicamente, uma grande quantidade de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) em sua membrana. As ligações duplas entre carbonos desses PUFAs confere a membrana plasmática uma maior fluidez, necessária aos processos fisiológicos do espermatozoide como motilidade e fertilização. No entanto essas ligações são mais facilmente oxidadas e, portanto, mais susceptíveis a peroxidação lipídica. Sendo assim, a suplementação com PUFAs promoveria uma melhoria na qualidade espermática, porém, tornaria o espermatozoide ainda mais susceptível à peroxidação lipídica. A vitamina E é um antioxidante chave na prevenção do estresse oxidativo através da interceptação do radical hidroxila, protegendo os PUFAs da membrana espermática contra a peroxidação lipídica. Portanto, uma alternativa para melhorar a qualidade espermática de touros europeus submetidos ao estresse térmico, seria a suplementação com PUFAs associada a um tratamento com vitamina E para prevenir um possível efeito deletério oxidativo desses ácidos graxos. Estudos sugerem uma importante relação entre os testes convencionais de avaliação de sêmen e fertilidade. No entanto, a limitação destes testes também tem sido reconhecida, principalmente em casos de infertilidade idiopática. Estudos demonstram que os testes funcionais de avaliação do sêmen, podem ser uma alternativa importante para a avaliação da capacidade fecundante de uma determinada amostra seminal. A interação entre espermatozóide e zona pelúcida ocorre através da ligação de receptores acrossomais às proteínas ZP3 e ZP2 do oócito. A membrana perivitelínica de ovos de galinha possui uma homologia com essas proteínas, permitindo sua ligação com espermatozóides de diversas espécies. Sendo assim, o teste de ligação espermática a essa membrana parece ser bastante eficiente para avaliar a capacidade fecundante do sêmen. No presente estudo, 16 touros Bos taurus foram submetidos à insulação testicular durante 4 dias e submetidos a um arranjo fatorial 2x2, sendo os fatores: dieta rica em PUFAs (Megalac®, 4 Kg ao dia) e tratamento com Vitamina E (Monovin E®, 3000 UI a cada 13 dias) durante 60 dias. As amostras seminais criopreservadas/descongeladas foram submetidas à avaliação da análise computadorizada da motilidade (CASA; Hamilton Thorne, Ivos 12.3, USA), integridade de membrana (Eosina Nigrosina), integridade acrossomal (Fast Green Rosa Bengala), atividade mitocondrial (33 diaminobenzidina), susceptibilidade ao estresse oxidativo (Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS), integridade de DNA (SCSA) e o teste de ligação de espermatozóides à membrana vitelínica de ovos de galinha, que foi previamente padronizado. O tratamento com vitamina E apresentou efeitos benéficos para algumas características espermáticas, sendo o contrário observado pelo tratamento com PUFAS, quando ambos foram analisados isoladamente. No entanto, a associação entre estes tratamentos não foi eficiente para melhorar a qualidade espermática assim como a capacidade fecundante avaliada através do teste de ligação espermática em membrana perivitelínica de ovos de galinha. / Several studies suggest a high susceptibility of European bulls (Bos taurus) to the heat stress, which will lead to an increase on oxidative stress and consequent impairment on sperm viability. Sperm membranes are rich in poly-unsaturated fatty acids (PUFAs). The carbon-carbon double bounds (insaturations) that characterize these PUFAs confer the necessary fluidity to the sperm membrane, essential to motility and fecundation capacity. However, these insaturations are more unstable and, therefore, more susceptible to the lipid peroxidation (i.e., attack of reactive oxygen species to the lipids). Hence, PUFA supplementation would improve certain sperm characteristics but increase the already high susceptibility to the oxidative stress. Vitamin E is a key antioxidante on oxidative stress prevention by intercepting hydroxyl radical and protecting sperm membrane PUFAS against lipid peroxidation. Therefore, an alternative to improve sperm quality in heat stressed european bulls would be a PUFA supplementation associated to a Vitamin E therapy in order to avoid a possible deleterious oxidative effects of these fatty acids. Estudies suggest an important relationship between conventional tests for sperm evaluation and fertility. However, limitations have been also verified, especially in cases of idiopathic infertility. Thus, tests to evaluate sperm functionality may be an interesting alternative to assess fecundation capacity of semen samples. The binding of sperm to the zona pellucida occurs initially by the interaction between acrosomal receptors and oocyte proteins ZP3 and ZP2. The perivitelline membrane of chicken eggs present homologies to zona pellucida proteins, which allows sperm from several species to bind to this membrane. Thus, the sperm binding test to the perivitelline membrane may be an efficient method to asses the fecundation capacity in semen of bulls. In the present study, 16 Bos taurus bulls were submitted to testicular insulation for 4 day. Animals were then submitted to a 2x2 factorial design, with the factor represented by a PUFA oral supplementation (Megalac®, 4 Kg for day) and the treatment with Vitamin E (Monovin E®, 3000 UI, each 13 days) for 60 days. Samples were cryopreserved/thawed and analyzed for motility variables by the computer assisted sperm analysis (CASA; Hamilton Thorne, Ivos 12.3, USA), membrane integrity (Eosin / Nigrosin), acrosome integrity (Fast Green / Bengal Rose), mitochondrial activity (33 diaminobenzidine), susceptibility to the oxidative stress (tiobarbituric acid reactive substances - TBARS), DNA integrity (SCSA) and the sperm binding test to the chicken egg perivitelline membrane, which was previously validated. Results demonstrated a beneficial effect of Vitamin E on some sperm characteristics, with the inverse effect observed for PUFA when both treatments were considered individually. However, the association between both treatments were not efficient to improve sperm quality as well as the fecundation capacity as evaluated by the sperm binding test to the chicken perivitelline membrane.

[ES] Los ácidos grasos de cadena muy larga (VLC-FA; >C24), aunque presentes en pequeñas cantidades, juegan un importante papel para el correcto desarrollo y funcionalidad de los tejidos neurales en vertebrados, especialmente durante su desarrollo temprano. Sin embargo, a pesar de su aparente importancia, los estudios sobre estos compuestos en peces son escasos. La biosíntesis de los VLC-FA se lleva a cabo mediante las denominadas proteínas de elongación de los ácidos grasos de cadena muy larga 4 (Elovl4) y, en consecuencia, la dotación y la función de estas enzimas determinan la capacidad endógena que una determinada especie tiene para satisfacer las demandas fisiológicas de VLC-FA, especialmente durante su desarrollo temprano. Además, esta producción endógena de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga (VLC-PUFA) es dependiente de los sustratos. Así, para su biosíntesis se requiere de ácidos grasos más cortos, es decir ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA; C20-24) que actúen como precursores, los cuales son incorporados principalmente a través de la dieta. Teniendo esto en mente, el presente trabajo de investigación tuvo como objetivos caracterizar los genes elovl4 en dorada (Sparus aurata) y en lenguado senegalés (Solea senegalensis), determinar la función de sus correspondientes proteínas codificadas, así como analizar el patrón de expresión tisular de elovl4. Además, se ha investigado la regulación nutricional de los genes implicados en la biosíntesis de VLC-PUFA (elovl4a, elovl4b) y LC-PUFA (fads2, elovl5) durante las primeras etapas del ciclo de vida de ambas especies (larvas y poslarvas), mediante el uso de dietas adaptadas a cada etapa del desarrollo. Los resultados confirmaron que ambas especies de peces poseen dos genes elovl4 distintos, denominados elovl4a y elovl4b según su homología con sus ortólogos de pez cebra. Asimismo, los ensayos funcionales de sus correspondientes proteínas, llevados a cabo en levaduras, indicaron que tanto Elovl4a como Elovl4b tienen la capacidad de elongar los ácidos grasos precursores (C20-24) hasta VLC-FA en ambas especies. Sin embargo, Elovl4b mostró mayor actividad que Elovl4a para elongar todos los ácidos grasos poliinsaturados a productos de cadena más larga, especialmente de la serie n-3. Además, los resultados de expresión génica indicaron que, aunque fueron detectados transcritos de elovl4 en la mayoría de los tejidos analizados, ambos genes elovl4 se expresaron más intensamente en los tejidos neurales de ambas especies, como el cerebro y los ojos, que mostraron los niveles de expresión más altos de elovl4a y elovl4b, respectivamente. Además, los resultados procedentes de los ensayos de regulación nutricional indicaron que los genes fads2, elovl5, elovl4a y elovl4b pueden ser regulados a través del contenido en LC-PUFA presente en la dieta. Es importante destacar que elovl4a y elovl4b fueron regulados de manera distinta según las hipotéticas necesidades de VLC-PUFA asociadas, de manera específica, con cada etapa del desarrollo temprano y dependiendo de disponibilidad dietaria de LC-PUFA. Estos hallazgos pueden contribuir a alcanzar una mejor comprensión de la vía biosintética de los VLC-FA en los teleósteos marinos, resaltando así el papel crucial que los productos de Elovl4 desempeñan para el correcto desarrollo y mantenimiento de las funciones neurofisiológicas durante las primeras etapas del desarrollo de los peces. Asimismo, estos resultados pueden ayudar a esclarecer el mecanismo molecular que controla la biosíntesis de VLC-PUFA, así como a establecer sus requerimientos específicos a lo largo del desarrollo de los teleosteos marinos en función de la especie. De esta manera, se abre la posibilidad de incorporar con éxito fuentes lipídicas alternativas a través de una programación nutricional temprana que estimule la biosíntesis de los VLC-PUFA durante las primeras etapas de alimentación exógena. / [CA] Els àcids grassos de cadena molt llarga (VLC-FA; >C24), encara que presents en petites quantitats, juguen un important paper per al correcte desenvolupament i funcionalitat dels teixits neurals en vertebrats, especialment durant el seu desenvolupament inicial. No obstant, malgrat la seua aparent importància, els estudis sobre aquests compostos en peixos son escassos. La biosíntesi dels VLC-FA es porta a terme mitjançant les denominades proteïnes d'elongació dels àcids grassos de cadena molt llarga 4 (Elovl4) i, en conseqüència, la dotació i la funció d'aquests enzims determinen la capacitat endògena que una determinada espècie té per a satisfer les demandes fisiològiques de VLC-FA, especialment durant el seu desenvolupament inicial. A més, aquesta producció endògena dels àcids grassos poliinsaturats de cadena molt llarga (VLC-PUFA) és depenent dels substrats. Així, per a la seua biosíntesi es requereix d'àcids grassos més curts, és a dir àcids grassos poliinsaturats de cadena llarga (LC-PUFA; C20-24) que actuen com a precursors, els quals són incorporats principalment a través de la dieta. Tenint això en compte, el present treball de recerca va tindre com a objectius caracteritzar els gens elovl4 en orada (Sparus aurata) i llenguado (Solea senegalensis), determinar la funció de les seues corresponents proteïnes codificades, així com analitzar el patró d'expressió tissular de elovl4. A més, es va investigar la regulació nutricional dels gens implicats en la biosíntesi de VLC-PUFA (elovl4a, elovl4b) i LC-PUFA (fads2, elovl5), durant les primeres etapes del cicle de vida d'ambdues espècies (larves i poslarves), mitjançant l'ús de dietes adaptades a cada etapa del desenvolupament. Els resultats van confirmar que totes dues espècies de peixos posseeixen dos gens elovl4 diferents, denominats elovl4a i elovl4b segons la seua homologia amb els seus ortòlegs en peix zebra. Així mateix, els assajos funcionals de les corresponents proteïnes, duts a terme en llevats, van indicar que tant Elovl4a com Elovl4b tenen la capacitat d'elongar els àcids grassos precursors (C20-24) fins a VLC-FA en totes dues espècies. No obstant això, Elovl4b va mostrar major activitat que Elovl4a per a elongar tots els àcids grassos poliinsaturats (substrats) fins a productes de cadena més llarga, especialment de la sèrie n-3. A més, els resultats d'expressió gènica van indicar que, encara que van ser detectats trànscrits de elovl4 en la majoria dels teixits analitzats, tots dos gens elovl4 es van expressar més en teixits neurals de totes dues espècies, com el cervell i els ulls, que van mostrar els nivells d'expressió més alts d'elovl4a i elovl4b, respectivament. A més, els resultats procedents dels assajos de regulació nutricional van indicar que els gens fads2, elovl5, elovl4a i elovl4b poden ser regulats a través del contingut en LC-PUFA present en la dieta. És important destacar que elovl4a i elovl4b van ser regulats de manera diferent segons les hipotètiques necessitats de VLC-PUFA associades, de manera específica, amb cada etapa del desenvolupament inicial i depenent de la disponibilitat dietaria de LC-PUFA. Aquestes troballes poden contribuir a tenir una millor comprensió de la via biosintètica dels VLC-FA en els teleostis marins, ressaltant així el paper crucial que els productes d'Elovl4 exerceixen en el correcte desenvolupament i manteniment de les funcions neurofisiològiques durant les primeres etapes del desenvolupament dels peixos. De la mateixa forma, aquests resultats poden ajudar a esclarir el mecanisme molecular que controla la síntesi endògena de VLC-PUFA, així com a establir els requisits específics de cada espècie al llarg del desenvolupament dels teleostis marins. D'aquesta manera, s'obri la possibilitat d'incorporar amb èxit fonts lipídiques alternatives a través d'una programació nutricional inicial que estimuli la biosíntesi de VLC-PUFA durant les primeres etapes d'alimentació exògena. / [EN] Very long-chain fatty acids (VLC-FA; >C24), although present in small amounts, play important roles for the correct development and functionality of neural tissues, especially during early development of vertebrates. However, despite their putative importance, their study in fish is scarce. Biosynthesis of VLC-FA is carried out by the so-called elongation of very long-chain fatty acid 4 (Elovl4) proteins and, consequently, the complement and function of these enzymes determine the endogenous capacity that a given species has for satisfying the physiological demands for VLC-FA, especially during its early development. Moreover, this endogenous production of very long-chain polyunsaturated fatty acid (VLC-PUFA) is substrate-dependent. Therefore, shorter fatty acid precursors, i.e. long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA; C20-24), are required. These nutrients are mostly incorporated by the diet and their bioavailability can influence the capacity of Elovl4 for satisfying the physiological VLC-PUFA demands in marine fish. Thus, nutritional regulation of elovl4, as well as other elongase and desaturase genes involved in LC-PUFA biosynthesis (elovl5, fads2) has been proposed as a strategy to enhance endogenous production of LC-PUFA and VLC-PUFA in fish farming. The present thesis aimed to characterize elovl4 genes from the marine teleosts Sparus aurata and Solea senegalensis, to determine the function of the corresponding encoded proteins, and to analyze the tissue expression pattern of these genes. Moreover, we investigated the nutritional regulation of genes involved in the biosynthesis of the VLC-PUFA (elovl4a, elovl4b) and the LC-PUFA (fads2, elovl5) in early life-cycle stages (larvae and post-larvae) of both fish species fed diets adapted to each development stage. Live preys were supplied to larvae (early and late larvae) and microdiets for post-larvae, with a variable content in VLC-PUFA precursors, i.e. LC-PUFA. The results confirmed that both fish species possess two distinct elovl4 genes termed as elovl4a and elovl4b based on their homology to the zebrafish orthologs. Functional assays of the corresponding proteins in yeast denoted that Elovl4a and Elovl4b from both species have the capability to elongate C20-24 fatty acid precursors to VLC-FA products. However, Elovl4b appeared to have a higher activity than Elovl4a elongating all the polyunsaturated fatty acid substrates assayed to longer chain polyunsaturated products, especially those of the n-3 series. Moreover, gene expression results indicated that, although elovl4 transcripts were detected in most of the tissues analyzed, elovl4 genes were more strongly expressed in the neural tissues of both species, such as brain and eyes, which showed the highest expression levels of elovl4a and elovl4b, respectively. Furthermore, the results from nutritional regulation assays denoted that fads2, elovl5, elovl4a and elovl4b genes could be regulated by the dietary LC-PUFA content. It is important to highlight that elovl4a and elovl4b genes were differently regulated according to the species-specific VLC-PUFA putative needs, associated with each early life-stage and the LC-PUFA dietary availability. Importantly, these findings can contribute to a better understanding of the VLC-FA biosynthetic pathway in marine teleosts, highlighting the crucial role that the Elovl4 products carry out for the correct development and maintenance of neurophysiological functions during early stages of the fish development. Therefore, these results can help to elucidate the molecular mechanism controlling the VLC-PUFA biosynthesis and their species-specific requirements along the marine fish development, opening the possibility to incorporate successfully alternative lipid sources, through an early nutritional programming that stimulates the VLC-PUFA biosynthesis during the first exogenous feeding stages. / Para desarrollarel trabajo de investigación descrito en esta memoria, Miguel Torres Rodríguez recibió una beca predoctoral de la Excma. Diputación de Castellón. / Torres Rodríguez, M. (2021). Estudio de los patrones de expresión de genes implicados en la síntesis de ácidos grasos de cadena muy larga durante el desarrollo de la dorada y el lenguado, y su regulación nutricional [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166619 / TESIS

Introdução - Os hábitos alimentares e os nutrientes da via metabólica do folato e homocisteína possuem grande importância na manutenção da saúde. Objetivo - Investigar a relação entre padrões alimentares (PAs) e os nutrientes envolvidos nessa via metabólica, com medidas antropométricas do recém-nascido, duração da infecção por HPV em homens e concentrações de homocisteína (Hcy) em adultos. Métodos - Foram utilizados dados dos estudos de coorte ProcriAr (Influência dos fatores nutricionais e poluentes atmosféricos urbanos na saúde pulmonar de crianças: um estudo de coorte com gestantes da zona oeste do município de São Paulo, n=299); e HIM (História natural da infecção por HPV em homens, n=1.194); e do estudo transversal ISA-Capital 2008 (Inquérito de saúde do estado de São Paulo, n=281). Os padrões alimentares foram derivados por análise fatorial por componentes principais nos estudos ProcriAr e ISA-Capital 2008 e utilizando reduced rank regression (RRR) no estudo HIM. Modelos multivariados de regressão de Poisson e lineares foram utilizados nos estudos ProcriAr e HIM para identificar a relação entre PAs e medidas antropométricas do recém-nascido e duração da infecção por HPV em homens, respectivamente. Utilizando modelo de equação estrutural, investigou-se a relação entre PAs, concentrações bioquímicas de folato, vitamina B12 e ácido docosahexaenoico (DHA) e concentrações de homocisteína em adultos do estudo ISA-Capital, considerando polimorfismo da enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR 677C>T). Os três estudos utilizaram questionário de frequência alimentar para avaliação do consumo alimentar. Resultados - No estudo ProcriAr, a maior adesão materna ao PA \"Snacks, sanduíches, doces e refrigerantes\", rico em energia, gordura, e folato sintético, esteve diretamente associada a ter um filho pequeno ao nascer (peso e/ou comprimento ao nascer, ajustado pela idade gestacional, abaixo do percentil 10 - INTERGOWTH-21st) (RR: 2,01; IC 95%: 1.13-3.57). No estudo HIM, homens com maior adesão ao \"PA3\" tiveram, em média, um aumento de 1,15 (IC95% 0,09-2,21) à 1,18 (IC95% 0,11-2,24) meses na duração da infecção por HPV. O \"PA3\" esteve positivamente correlacionado com vitamina B6 (r = 0,59), vitamina B12 (0,27) e DFE (0,07) e negativamente correlacionado com DHA (-0,37). No estudo ISA-Capital o PA \"Prudente\" esteve inversamente associado à concentração de Hcy (β = -0,12). O DHA esteve diretamente associado ao PA \"Prudente\"; composto por verduras e legumes, peixe, frutas, frango, suco natural e batata/mandioca/polenta (cozida ou assada). Conclusões - Os PAs estão associados às medidas antropométricas do recém-nascido, à duração da infecção por HPV em homens e às concentrações de homocisteína em adultos. Estes resultados reforçam a importância de estudos sobre alimentação e nutrição que considerem não somente nutrientes, mas principalmente o consumo de alimentos e suas combinações, servindo como base para a elaboração de estratégias e políticas públicas de promoção à saúde. / Introduction - The dietary habits and nutrients involved in one-carbon metabolism are of great importance in health. Objective - To investigate the relationship between dietary patterns (DP) and the nutrients involved in this metabolism, with newborn\'s anthropometric measurements, duration of HPV infection in men, and homocysteine (Hcy) levels in adults. Methods - Data from the cohort studies ProcriAr (Influence of nutritional factors and urban air pollutants on the pulmonary health of children: a cohort study with pregnant women from the western region of the city of São Paulo, n=299); and HIM (Natural history of HPV infection in men, n=1,194); and the cross-sectional study ISA-Capital 2008 (São Paulo State Health Survey, n=281) were used. The DP were estimated using factor analysis with principal component\'s estimation in ProcriAr and ISA-Capital 2008 studies and using reduced rank regression (RRR) in HIM study. Multivariate Poisson and linear regression models were used in the ProcriAr and HIM studies to identify the relationship between DP and newborn\'s anthropometric measurements and duration of HPV infection in men, respectively. Using a structural equation model, the relationship between DP, biochemical levels of folate, vitamin B12 and docosahexaenoic acid (DHA) and homocysteine levels was investigated in adults from the ISA-Capital 2008 study, considering the polymorphism of the enzyme methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR 677C>T). The three studies used a food frequency questionnaire to evaluate dietary intake. Results - In the ProcriAr study, the higher maternal adherence to the \"Snacks, sandwiches, sweets and soft drinks\" DP, which is a DP rich in energy, fat, and synthetic folate, was directly associated with having a child small at birth (weight and/or birth length by gestational age and sex below the 10th percentile - INTERGOWTH-21st) (RR: 2.01, 95% CI: 1.13-3.57). In the HIM study, men with higher adherence to \"DP3\" had, on average, an increase from 1.15 (95% CI 0.09-2.21) to 1.18 (95% CI 0.11-2.24) months in the duration of HPV infection. \"DP3\" was positively correlated with vitamin B6 (r = 0.59), vitamin B12 (0.27) and DFE (0.07) and negatively correlated with DHA (-0.37). In the ISA-Capital study, the \"Prudent\" DP was inversely associated with Hcy levels (β = -0.12). DHA was directly associated with \"Prudent\" DP; composed of vegetables, fish, fruits, chicken, natural juice and potato/cassava/polenta (cooked or roasted). Conclusions - Dietary patterns are associated with newborn\'s anthropometric measurements, duration of HPV infection in men, and Hcy levels in adults. These results reinforce the importance of studies on food and nutrition that consider not only nutrients, but mainly the consumption of foods and their combinations, serving as a basis for the elaboration of public health promotion strategies and policies.