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A L-Asparaginase (ASNase) é um importante agente quimioterapêutico utilizado para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (ALL) há mais de 40 anos. No entanto, devido à origem biológica da ASNase, enzima produzida por Escherichia coli, problemas como a imunogenicidade e baixa meia vida-plasmática devem ser considerados. Com o objetivo de minimizar essas desvantagens, várias ASNases homólogas bem como formulações de ASNase de E. coli foram investigadas. Nenhuma das formulações desenvolvidas, entretanto, foi capaz de resolver definitivamente esses problemas associados à sua origem. Nesse sentido, considerando os recentes avanços na ciência de polímeros com a possibilidade do obtenção de vesículas poliméricas usando copolímeros, este trabalho concentrou-se no desenvolvimento de polimerossomos de poli(etileno glicol)-b-poli(ε-caprolactona) (PEG-PCL) para encapsular a ASNase. Diversas condições experimentais foram investigadas e, ao final, os polimerossomos foram produzidos pela técnica de hidratação do filme polimérico utilizando a centrifugação como técnica de pós-filme para remoção de copolímero precipitado, produzindo assim vesículas polímericas de 120 a 200nm com PDI de aproximadamente 0,250. A eficiência de encapsulação da ASNase, utilizando as metodologias de centrifugação ou cromatografia de exclusão molecular, revelou taxas de encapsulação de 20-25% e 1 a 7%, repectivamente. Esses resultados apontam a importância de se determinar a eficiência de encapsulação por cromatografia de exclusão molecular ou método direto no caso de nanoestruturas auto-agregadas formadas por copolímeros, devido a valores superestimados com o emprego da centrifugação. Ainda que estudos complementares se façam necessários para liberação da enzima encapsulada ou penetração da L-asparagina nas vesículas, nossos resultados demonstram o potencial de polimerossomos para veiculação de ASNase, bem como de outras proteínas terapêuticas. / L-Asparaginase (ASNase) is an important chemotherapeutic agent used for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. However, due to the biological origin of ASNase (produced by Escherichia coli) some drawbacks such as immunogenicity and low plasma half life are present. In order to minimize the disadvantages, several ASNases proteoforms and formulations of E. coli ASNase were investigated. However, none of this formulations completely solved the main drawbacks of ASNase. In this sense, considering the recents advances in polymers science with the possibility to develop polymeric vesicles using copolymers, this work aimed at the development of poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) (PEG-PCL) vesicles to encapsulate ASNase. Different experimental conditions were investigated and, the final polymersomes formulation was prepared by film hydratation using centrifugation as a post-film technique to remove the bulky coplymer. Polymeric vesicles of 120 to 200nm with PDI of approximately, 0.250 were obtained. The encapsulation efficiency of ASNase was determined indirectly by centrifugation and directly by size exclusion chromatography, resulting in encapsulation rates of 20-25% and 1 to 7%, respectively. These results indicate the importance of determining the efficiency of encapsulation by size exclusion chromatography or direct method in the case of self-aggregated nanostructures formed by copolymers, due to values overestimated with the use of centrifugation. Our results point to the potential of polymersomes for ASNase delivery, as well as other therapeutic proteins. Nonetheless, complimentary studies are still necessary for ASNase release or L-asparagine penetration into the vesicles.

A L-Asparaginase (ASNase) é um importante agente quimioterapêutico utilizado para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (ALL) há mais de 40 anos. No entanto, devido à origem biológica da ASNase, enzima produzida por Escherichia coli, problemas como a imunogenicidade e baixa meia vida-plasmática devem ser considerados. Com o objetivo de minimizar essas desvantagens, várias ASNases homólogas bem como formulações de ASNase de E. coli foram investigadas. Nenhuma das formulações desenvolvidas, entretanto, foi capaz de resolver definitivamente esses problemas associados à sua origem. Nesse sentido, considerando os recentes avanços na ciência de polímeros com a possibilidade do obtenção de vesículas poliméricas usando copolímeros, este trabalho concentrou-se no desenvolvimento de polimerossomos de poli(etileno glicol)-b-poli(ε-caprolactona) (PEG-PCL) para encapsular a ASNase. Diversas condições experimentais foram investigadas e, ao final, os polimerossomos foram produzidos pela técnica de hidratação do filme polimérico utilizando a centrifugação como técnica de pós-filme para remoção de copolímero precipitado, produzindo assim vesículas polímericas de 120 a 200nm com PDI de aproximadamente 0,250. A eficiência de encapsulação da ASNase, utilizando as metodologias de centrifugação ou cromatografia de exclusão molecular, revelou taxas de encapsulação de 20-25% e 1 a 7%, repectivamente. Esses resultados apontam a importância de se determinar a eficiência de encapsulação por cromatografia de exclusão molecular ou método direto no caso de nanoestruturas auto-agregadas formadas por copolímeros, devido a valores superestimados com o emprego da centrifugação. Ainda que estudos complementares se façam necessários para liberação da enzima encapsulada ou penetração da L-asparagina nas vesículas, nossos resultados demonstram o potencial de polimerossomos para veiculação de ASNase, bem como de outras proteínas terapêuticas. / L-Asparaginase (ASNase) is an important chemotherapeutic agent used for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. However, due to the biological origin of ASNase (produced by Escherichia coli) some drawbacks such as immunogenicity and low plasma half life are present. In order to minimize the disadvantages, several ASNases proteoforms and formulations of E. coli ASNase were investigated. However, none of this formulations completely solved the main drawbacks of ASNase. In this sense, considering the recents advances in polymers science with the possibility to develop polymeric vesicles using copolymers, this work aimed at the development of poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) (PEG-PCL) vesicles to encapsulate ASNase. Different experimental conditions were investigated and, the final polymersomes formulation was prepared by film hydratation using centrifugation as a post-film technique to remove the bulky coplymer. Polymeric vesicles of 120 to 200nm with PDI of approximately, 0.250 were obtained. The encapsulation efficiency of ASNase was determined indirectly by centrifugation and directly by size exclusion chromatography, resulting in encapsulation rates of 20-25% and 1 to 7%, respectively. These results indicate the importance of determining the efficiency of encapsulation by size exclusion chromatography or direct method in the case of self-aggregated nanostructures formed by copolymers, due to values overestimated with the use of centrifugation. Our results point to the potential of polymersomes for ASNase delivery, as well as other therapeutic proteins. Nonetheless, complimentary studies are still necessary for ASNase release or L-asparagine penetration into the vesicles.

O muco protege o corpo humano de partículas externas, mas também representa uma barreira para a entrega de controlada de medicamentos através de nanocarregadores. Para ultrapassar a barreira do muco e impedir mucoadesão, nanopartículas sólidas são normalmente revestidas com polímeros inertes, tais como o polietileno glicol (PEG). No entanto, trata-se de um procedimento relativamente complexa. Nesta tese, estudamos métodos para fabricar nanocarreadores com uma excepcional combinação de propriedades, incluindo uma boa capacidade de mucopenetração e uma grande capacidade de carga. Ao contrário dos métodos convencionais de revestimento, usamos um copolímero dibloco, que consiste em dois blocos hidrofóbicos e hidrofílicos, que se auto-organiza em polimerosomos sob hidratação. Devido à inércia do bloco hidrofílico, estes polimerosomos devem ser, por natureza, muco penetradores. Além disso, sua estrutura oca fornece os polimersomos para serem carregados com carga hidrofílica, enquanto a carga hidrofóbica pode ser transportada através da membrana. Por conta da utilização de um polímero hidrolisável na presença de ácido, ácido poli láctico (PLA) como a espinha dorsal copolímero, demonstramos que estes polimerosomos podem liberar o conteúdo, após aplicação do estímulos externo relacionado ao pH. Os experimentos de rastreamento de partículas demonstraram que os polimersomos se difundem mais rápido do que as partículas não revestidas, em muco de intestino de porco, e testes de biodistribuição apresentaram resultados encorajadores para a entrega localizada de fármacos de maneira mais homogênea, melhorando a biodisponibilidade e efeitos terapeuticos. Mais estudos relacionados ao aumento da eficiência de encapsulação e testes de efetividade in vivo no tratamento de doenças devem ser promovidos. Acreditarmos que combinação das vantagens relacionadas à estrutura vesicular dos polimerossomas, estabilidade, e muco penetração possibilitam o desenvolvimento de uma nova plataforma para a entrega controlada de medicamentos na mucosa. / Mucus protects the human body by trapping foreign particulates but also poses a barrier for drug delivery by slowing down the mobility of drug carriers. To design mucus penetrating carriers, solid particles are typically coated with inert polymers such as polyethylene glycol (PEG) to prevent mucoadhesion. However, the solid structure of these particles limits their loading capabilities and the process to coat them requires a complex synthesis. In this thesis we studied methods to fabricate nanocarriers with an exceptional combination of properties including a good mucus-penetration capability and loading capacity of hydrophilic and hydrophobic cargos. Unlike conventional coating methods, we use a diblock copolymer, consisting of both hydrophobic and hydrophilic blocks, which self-assembles into polymersomes under hydration. Because of the inertness of the hydrophilic block, these polymersomes should be mucus-penetrating by nature. Moreover, their hollow structure provides the polymersomes to be loaded with hydrophilic cargo, whereas hydrophobic cargo can be carried through the membrane. Importantly, by using a hydrolysable acid-catalyzed polymer (poly lactic acid, PLA) as the copolymer backbone, we demonstrate that these polymersomes can release contents upon application of external pH stimuli. Particle Tracking experiments demonstrated that polymersomes diffuse faster than uncoated particles in porcine intestine mucus, and biodistribution tests displayed encouraging results towards more homogeneous local drug-delivery, helping bioavailability as well as therapeutic efects. More studies related to the increase of encapsulation efficiency, and in vivo disease treatment tests should be promoted. Although we believe that combining the advantages of polymersome carrier, and tunning the membrane composition, this mucus-penetrating carrier we propose may provide as a new platform for mucosal drug delivery.

O muco protege o corpo humano de partículas externas, mas também representa uma barreira para a entrega de controlada de medicamentos através de nanocarregadores. Para ultrapassar a barreira do muco e impedir mucoadesão, nanopartículas sólidas são normalmente revestidas com polímeros inertes, tais como o polietileno glicol (PEG). No entanto, trata-se de um procedimento relativamente complexa. Nesta tese, estudamos métodos para fabricar nanocarreadores com uma excepcional combinação de propriedades, incluindo uma boa capacidade de mucopenetração e uma grande capacidade de carga. Ao contrário dos métodos convencionais de revestimento, usamos um copolímero dibloco, que consiste em dois blocos hidrofóbicos e hidrofílicos, que se auto-organiza em polimerosomos sob hidratação. Devido à inércia do bloco hidrofílico, estes polimerosomos devem ser, por natureza, muco penetradores. Além disso, sua estrutura oca fornece os polimersomos para serem carregados com carga hidrofílica, enquanto a carga hidrofóbica pode ser transportada através da membrana. Por conta da utilização de um polímero hidrolisável na presença de ácido, ácido poli láctico (PLA) como a espinha dorsal copolímero, demonstramos que estes polimerosomos podem liberar o conteúdo, após aplicação do estímulos externo relacionado ao pH. Os experimentos de rastreamento de partículas demonstraram que os polimersomos se difundem mais rápido do que as partículas não revestidas, em muco de intestino de porco, e testes de biodistribuição apresentaram resultados encorajadores para a entrega localizada de fármacos de maneira mais homogênea, melhorando a biodisponibilidade e efeitos terapeuticos. Mais estudos relacionados ao aumento da eficiência de encapsulação e testes de efetividade in vivo no tratamento de doenças devem ser promovidos. Acreditarmos que combinação das vantagens relacionadas à estrutura vesicular dos polimerossomas, estabilidade, e muco penetração possibilitam o desenvolvimento de uma nova plataforma para a entrega controlada de medicamentos na mucosa. / Mucus protects the human body by trapping foreign particulates but also poses a barrier for drug delivery by slowing down the mobility of drug carriers. To design mucus penetrating carriers, solid particles are typically coated with inert polymers such as polyethylene glycol (PEG) to prevent mucoadhesion. However, the solid structure of these particles limits their loading capabilities and the process to coat them requires a complex synthesis. In this thesis we studied methods to fabricate nanocarriers with an exceptional combination of properties including a good mucus-penetration capability and loading capacity of hydrophilic and hydrophobic cargos. Unlike conventional coating methods, we use a diblock copolymer, consisting of both hydrophobic and hydrophilic blocks, which self-assembles into polymersomes under hydration. Because of the inertness of the hydrophilic block, these polymersomes should be mucus-penetrating by nature. Moreover, their hollow structure provides the polymersomes to be loaded with hydrophilic cargo, whereas hydrophobic cargo can be carried through the membrane. Importantly, by using a hydrolysable acid-catalyzed polymer (poly lactic acid, PLA) as the copolymer backbone, we demonstrate that these polymersomes can release contents upon application of external pH stimuli. Particle Tracking experiments demonstrated that polymersomes diffuse faster than uncoated particles in porcine intestine mucus, and biodistribution tests displayed encouraging results towards more homogeneous local drug-delivery, helping bioavailability as well as therapeutic efects. More studies related to the increase of encapsulation efficiency, and in vivo disease treatment tests should be promoted. Although we believe that combining the advantages of polymersome carrier, and tunning the membrane composition, this mucus-penetrating carrier we propose may provide as a new platform for mucosal drug delivery.

Die Übertragung der amphiphilen Grundbausteine der Liposome in die Welt der Polymere führte zu Blockcopolymeren, welche sogenannte Polymersome bilden können. Die synthetische Herkunft der Polymere ermöglicht es, eine Vielzahl von verschiedenen chemischen Funktionalitäten einzubringen. Anwendungen von Polymersomen werden vor allem als Wirkstoffträgersystem oder im Bereich der synthetischen Biologie als Nanoreaktoren oder künstliche Zellorganellen ausgemacht. In vielen Fällen wird dabei eine Schaltbarkeit oder Responsivität der Vesikel gegenüber äußerer Stimuli benötigt. Als nächste Stufe der Komplexizität können die responsiven, »smarten« Polymersome innerhalb ihrer Membran quervernetzt werden, wodurch es möglich wird, den Durchmesser und die Membranpermeabilität der Vesikel reversibel hin- und herzuschalten. Diese Arbeit baut dabei auf pH-responsiven Polymersomen auf, welche durch photochemische Reaktionen vernetzt werden. Dabei soll zunächst der Frage nachgegangen werden, an welchem pH Wert genau der Übergang von kollabierten zu gequollenen Vesikeln erfolgt und wie sich dieser »kritischer pH« (pH*) verändern und einstellen lässt. Neben der Herstellung von maßgeschneiderten Polymersomen ist aber auch die detaillierte Charakterisierung ihrer Membraneigenschaften unabdingbar, wofür die Titration mit Fluoreszenz-Sonden eingesetzt wurde. Darüber hinaus wurden Enzyme in die Vesikel eingekapselt wobei die neuartige Methode der post-Verkapselung untersucht wurde.

Die Übertragung der amphiphilen Grundbausteine der Liposome in die Welt der Polymere führte zu Blockcopolymeren, welche sogenannte Polymersome bilden können. Die synthetische Herkunft der Polymere ermöglicht es, eine Vielzahl von verschiedenen chemischen Funktionalitäten einzubringen. Anwendungen von Polymersomen werden vor allem als Wirkstoffträgersystem oder im Bereich der synthetischen Biologie als Nanoreaktoren oder künstliche Zellorganellen ausgemacht. In vielen Fällen wird dabei eine Schaltbarkeit oder Responsivität der Vesikel gegenüber äußerer Stimuli benötigt. Als nächste Stufe der Komplexizität können die responsiven, »smarten« Polymersome innerhalb ihrer Membran quervernetzt werden, wodurch es möglich wird, den Durchmesser und die Membranpermeabilität der Vesikel reversibel hin- und herzuschalten. Diese Arbeit baut dabei auf pH-responsiven Polymersomen auf, welche durch photochemische Reaktionen vernetzt werden. Dabei soll zunächst der Frage nachgegangen werden, an welchem pH Wert genau der Übergang von kollabierten zu gequollenen Vesikeln erfolgt und wie sich dieser »kritischer pH« (pH*) verändern und einstellen lässt. Neben der Herstellung von maßgeschneiderten Polymersomen ist aber auch die detaillierte Charakterisierung ihrer Membraneigenschaften unabdingbar, wofür die Titration mit Fluoreszenz-Sonden eingesetzt wurde. Darüber hinaus wurden Enzyme in die Vesikel eingekapselt wobei die neuartige Methode der post-Verkapselung untersucht wurde.