Abstract The opioid receptors (δ, κ and μ) are family A G protein-coupled receptors (GPCRs) that have an important role in the regulation of pain. Like all GPCRs they have a common structure that consists of seven transmembrane domains with an extracellular amino (N)-terminus and an intracellular carboxyl-terminus. The human δ opioid receptor (h(δOR) has two polymorphic variants. A single-nucleotide polymorphism causes replacement of Phe with Cys at the amino acid position 27 in the receptor N-terminus. The allelic frequency of hδORCys27, the less common variant, is about 10% in Caucasians. In this study, the two hδOR variants were expressed in heterologous expression systems and their biosynthesis was characterized in detail using various cell biological and biochemical techniques. In particular, the role of receptor heteromerization and opioid receptor pharmacological chaperones in processing, maturation and trafficking of the variants was assessed. The hδOR variants showed significant differences in maturation and trafficking. The hδORCys27 had a significantly lower maturation efficiency compared with hδORPhe27. In addition, long-term receptor expression led to the accumulation of hδORCys27 in the endoplasmic reticulum (ER) and also impaired receptor targeting to ER-associated degradation. The hδOR variants also differed at the cell surface, as the hδORCys27 variant was internalized constitutively in a faster and more extensive manner than hδORPhe27. However, the variants had similar pharmacological properties and activated G proteins in an identical manner. This study also showed that hδORCys27 acted in a dominant negative manner and redirected some hδORPhe27 precursors to degradation. This resulted in impaired plasma membrane expression of hδORPhe27 in co-transfected cells. The hδOR variants were found to form heteromers early in the secretory pathway, which is the most likely reason for the dominant negative behavior of hδORCys27 on hδORPhe27. The mechanism of action of opioid receptor pharmacological chaperones, membrane-permeable opioid ligands, was investigated in detail using hδORCys27 and its mutant form hδORCys27-(Asp95Ala) as models. Opioid antagonists were found to be able to bind to and stabilize receptor precursors in the ER and enhance their dissociation from the ER molecular chaperone calnexin. This led to an increase in the number of receptors at the plasma membrane. In addition, hδORPhe27, like hδORCys27, was responsive to antagonist treatment whether the variants were expressed together or individually. / Tiivistelmä Opioidireseptorit kuuluvat G-proteiinikytkentäisiin reseptoreihin, ja niillä on tärkeä rooli kipuaistimuksen säätelyssä. Ne ovat solukalvoproteiineja, joiden aminohappoketju läpäisee kalvon seitsemän kertaa. Reseptorien aminoterminaalipää sijaitsee solun ulkopuolella ja karboksiterminaalipää solun sisällä. Ihmisen δ-opioidireseptori esiintyy kahtena polymorfisena muotona, Phe27:nä ja Cys27:nä, joissa aminohappo 27 on joko fenyylialaniini (Phe) tai kysteiini (Cys). Cys27 on harvinaisempi muoto, ja sen yleisyys on noin 10 % eurooppalaista alkuperää olevalla väestöllä. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia δ-opioidireseptorin varianttimuotojen biosynteesiä reseptoriproteiinia tuottavissa heterologisissa solumalleissa (HEK293- ja SH-SY5Y-solut) solubiologisilla ja biokemiallisilla menetelmillä.. Väitöskirja osoittaa, että δ-opioidireseptorin varianttimuotojen välillä on eroa prosessoinnissa. Cys27-varianttia kuljetetaan endoplasmakalvostosta solun pinnalle vähemmän kuin Phe27-varianttia, ja pitkäaikainen reseptorituotanto johtaa vastasyntetisoituneiden reseptorien kerääntymiseen solun sisälle. Samalla reseptorien ohjaus proteasomihajotukseen heikkenee. Soluissa, jotka tuottavat molempia varianttimuotoja samanaikaisesti, Cys27-variantin havaittiin ohjaavan myös Phe27-varianttia proteasomihajotukseen vähentäen sen kuljetusta solun pinnalle. Tämä Cys27-variantin dominanttinegatiivinen ominaisuus johtuu todennäköisesti siitä, että variantit muodostavat dimeerisen rakenteen endoplasmakalvostossa. Havaittiin myös, että Cys27-varianttireseptorit ohjataan solun pinnalta lysosomihajotukseen tehokkaammin kuin vastaavat Phe27-varianttimuodot. Prosessointieroista huolimatta variantit eivät poikkea toisistaan farmakologisilta ominaisuuksiltaan, ja ne aktivoivat G proteiineja samalla tavalla. Väitöskirjassa tutkittiin myös farmakologisten kaperonien toimintamekanismeja käyttämällä mallina δ-opioidireseptorin Cys27-varianttia ja sen pistemutaatiota (Asp95Ala). Farmakologisten kaperonien eli reseptorispesifisten ligandien todettiin sitoutuvan reseptoreihin endoplasmakalvostossa ja stabiloivan niiden rakennetta, mikä vähentää reseptorin ja proteiinien laadunvalvontaan osallistuvan kaperonin, kalneksiinin, välistä vuorovaikutusta. Tämä johtaa reseptorien määrän kasvuun solun pinnalla.

Abstract The delta opioid receptor (δOR) is a member of the G protein-coupled receptor family. This transmembrane receptor has an important role in the regulation of pain. The OPRD1 gene that encodes the human δOR (hδOR) contains at least 11 single-nucleotide polymorphisms (SNPs). The only nonsynonymous SNP resides in the amino-terminal (N-terminal) domain of the receptor and it replaces Phe at position 27 with Cys, thus introducing an unpaired Cys residue on the extracellular surface of the receptor. The Cys27 variant has been shown to have an allelic frequency of about 10% in Caucasian populations. The polymorphic site is flanked by two putative N-glycosylation sites at Asn18 and Asn33. In this study, the folding, maturation and trafficking of hδOR was assessed using the hδORPhe27 and hδORCys27 variants and the N-glycosylation deficient forms of the latter as models in a heterologous expression system. The effects of N-glycosylation and the unpaired Cys-residue were studied with various biochemical, pharmacological and cell biological methods. In addition, protein-protein interactions of the intracellular hδOR precursors were assessed. The hδORCys27 and hδORPhe27 variants differed significantly in their subcellular localization and maturation efficiency. The newly synthesized hδORCys27 was found to accumulate in the endoplasmic reticulum (ER) prior to its ER-associated degradation in proteasomes. Although a slow maturation rate was characteristic for both variants, only the hδORCys27 had poor maturation efficiency. The cell surface expression of hδORCys27 was further decreased because the constitutive internalization of this receptor was enhanced compared to hδORPhe27. N-linked glycosylation was not required for hδOR function or ligand binding, but was important for the expression of the correctly folded receptor species at the cell surface. The mutant non-N-glycosylated receptor was shown to traffic to the cell surface with enhanced kinetics, but some of the plasma membrane receptors were in a nonnative conformation. Also, the overall levels of the non-N-glycosylated hδORCys27 were decreased as the receptor was efficiently internalized for lysosomal degradation in a constitutive fashion. The hδORCys27 and hδORPhe27 precursors were found to interact with several ER localized proteins, such as calnexin (CNX), protein disulfide isomerase (PDI) and ERp72. The receptors also associated with the sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase 2b (SERCA2b), which was shown to occur during translocation of the receptor to the ER membrane or immediately thereafter. The interaction was not receptor N-glycan dependent and the normal functional activity of SERCA2b was shown to be required for proper cell surface expression of hδOR. / Tiivistelmä δ-opioidireseptori kuuluu G-proteiinikytkentäisiin reseptoreihin, ja sillä on tärkeä rooli kivun säätelyssä. Ihmisen δ-opioidireseptoria koodaavassa OPRD1 geenissä on havaittu ainakin 11 yhden nukleotidin polymorfiaa. Vain yksi tunnetuista polymorfioista aiheuttaa muutoksen proteiinin aminohapposekvenssiin. Se sijaitsee reseptorin aminoterminaalisessa osassa ja se muuttaa fenyylialaniinin (Phe) kohdassa 27 kysteiiniksi (Cys), joka on pariton. Cys27-variantin yleisyys eurooppalaisessa väestössä on noin 10 %. Polymorfisen kohdan molemmilla puolilla on N-glykosylaatiokohdat asparagiineissa Asn18 ja Asn33. Tämän työn tavoitteena oli tutkia δ-opioidireseptorin laskostumista, maturaatiota ja kuljetusta heterologisessa solumallissa käyttämällä Phe27- ja Cys27-variantteja sekä Cys27-variantin N-glykosyloimatonta mutanttia. Cys27-polymorfian ja N-glykosylaation vaikutuksia tutkittiin useilla biokemiallisilla, farmakologisilla sekä solubiologisilla menetelmillä. Lisäksi työssä tutkittiin solunsisäisen δ-opioidireseptorin esiasteen vuorovaikutusta muiden proteiinien kanssa. Phe27- ja Cys27-varianttien sijainti solun sisällä ja maturaatiotehokkuus eroavat toisistaan merkittävästi. Vastasyntetisoitu Cys27-variantti kerääntyy endoplasmakalvostoon, josta se ohjautuu proteasomihajoitukseen. Molemmat variantit kulkeutuvat solun pintaan hitaasti. Cys27-variantin prosessointi on huomattavasti tehottomampaa ja sen määrää solun pinnalla vähentää myös lisääntynyt ohjaaminen solunsisäiseen lysosomihajotukseen. N-glykosylaatiolla ei havaittu olevan vaikutusta reseptorin toimintaan tai ligandin sitomiseen, mutta sillä on tärkeä merkitys oikein laskostuneiden reseptorien kuljetukselle solun pinnalle, koska osa pintaan päässeistä N-glykosyloimattomista reseptoreista on muodossa, johon reseptorispesifinen ligandi ei sitoudu. Vaikka mutanttireseptori kulkeutuukin solun pintaan nopeammin, sen määrä solun pinnalla on alhaisempi, koska mutanttireseptori ohjataan huomattavan nopeasti solun pinnalta lysosomihajotukseen. Phe27- ja Cys27-varianttien havaittiin olevan myös vuorovaikutuksessa eräiden endosomaalisen kalvoston proteiinien kanssa, kuten kalneksiinin, proteiinidisulfidi-isomeraasin ja ERp72-proteiinin. Kumpikin reseptori havaittiin yhteisessä rakenteessa sarko(endo)plasmakalvoston kalsium-ATPaasi 2b -pumpun (SERCA2b) kanssa N-glykosylaatiosta riippumattomalla tavalla. Nämä proteiiniryhmät muodostuvat, kun reseptori liitetään synteesin aikana endoplasmakalvostoon tai heti sen jälkeen. Vuorovaikutus toiminnallisen SERCA2b:n kanssa havaittiin tärkeäksi toimintakykyisen δ-opioidireseptorin esiintymiselle solun pinnassa.

Abstract Cellular energy is produced by the mitochondria via oxidative phosphorylation. In addition to nuclear DNA; the mitochondrion contains circular mitochondrial DNA (mtDNA) molecules. MtDNA is maternally inherited and encodes 37 genes that are crucial for the energy production of the cell. Mutations in the mtDNA cause mitochondrial diseases that manifest as maternally inherited energy metabolism disorders. Common symptoms include diabetes mellitus, myopathy, sensorineural hearing impairment, eye and vision problems, epilepsy and brain manifestations (encephalopathy). Mitochondrial mutations are often heteroplasmic; cells and tissues contain a mix of healthy and mutated mtDNA. The percentage of mutated mtDNA contributes to the severity of symptoms. Mitochondrial DNA also contains numerous polymorphisms; some of which have been reported to be non-neutral, thus contributing to the occurrence of common diseases. Whole mtDNA sequences were obtained from patients with diabetes mellitus (64), epilepsy (79) and unknown mitochondrial disease (66) using conformation-sensitive gel electrophoresis and direct sequencing. Whole mtDNA sequences of a Finnish family with ataxia were also obtained. Restriction fragment length analysis and cloning were used for heteroplasmy quantification. Whole mitochondrial genomes were organized into phylogenetic trees. All nonsynonymous mutations were analyzed with pathogenicity predicting algorithms (SNAP, PolyPhen-2, PMut, SIFT Blink). Non-neutral risk mutations were identified in diabetes mellitus and epilepsy patients. These patients had maternal relatives with diabetes, epilepsy and/or sensorineural hearing impairment. M. 3010A>G and m.16189T>C were found in increased frequency in diabetics and the haplogroup U5b variant m.15218A>G was detected more often among patients with epilepsy. These mutations were predicted to be deleterious in effect. Mitochondrial haplogroup V was found in increased frequency in matrilineal diabetes mellitus patients. We identified an m.8993T>C mutation in a Finnish family with ataxia. This mutation caused an adult-onset ataxic phenotype; previous studies have reported only juvenile onset phenotypes. Novel and rare mtDNA mutations were discovered in patients with an unspecified mitochondrial disease phenotype; these included an insertion m.7585insT and a novel MTTT mutation m. 15933G>A. This thesis emphasizes the importance of full mtDNA sequencing in patients with a suspected mitochondrial disease; novel mutations remain undetected if only the most common mutations are screened. In addition, the increasing importance of non-neutral mtDNA risk variants is supported by the findings of this thesis. In the future, individualized genetics and information on personal risk alleles will become even more important for maintaining health on a personal level. / Tiivistelmä Mitokondriot ovat energiaa tuottavia soluelimiä. Mitokondrioissa on oma rengasmainen mitokondriaalinen DNA (mtDNA), joka esiintyy solussa useana kopiona. MtDNA periytyy vain äidin kautta, joten kaikille lapsille periytyy sama mitokondriaalinen DNA. MtDNA koodaa 37:ää geeniä, jotka ovat tärkeitä solun energiantuotannolle. Geenimuutos mtDNA:ssa voi aiheuttaa äidiltä periytyvän mitokondriotaudin. Mitokondriotaudit ovat energia-aineenvaihdunnan sairauksia, joissa tavallisia oireita ovat diabetes mellitus, lihasoireet (esimerkiksi lihasten ennenaikainen väsymys, myopatia), sydänlihasoireet, maksaoireet, silmä- ja näköoireet, aistimistyyppinen kuulovika sekä aivo-oireet, kuten epilepsia. Oireet vaihtelevat huomattavasti, ja sama mutaatio voi aiheuttaa hyvin erilaisia taudinkuvia. Vakavimmillaan mitokondriotauti voi johtaa kuolemaan jo varhaislapsuudessa. Mutaation prosenttiosuus eli heteroplasmia-aste on usein oireiden vakavuutta määrittelevä tekijä. Mitokondriaalinen DNA muuntuu nopeasti evoluution aikana, joten siinä esiintyy paljon normaalia vaihtelua (polymorfioita). Osa näistä polymorfioista on kuitenkin todettu lievästi haitallisiksi, ja ne lisäävät riskiä sairastua kansanterveydellisesti yleisiin sairauksiin, kuten diabetekseen. Kartoitimme koko mitokondriogenomin muutokset eri potilasryhmiltä, joihin kuului diabetesta, epilepsiaa ja ataksiaa sairastavia potilaita. Lisäksi tutkittiin potilaita, joilla epäiltiin mitokondriotautia. Keskeiset käytetyt menetelmät olivat DNA:n rakenteellisia muutoksia havaitseva geelielektroforeesi ja sekvensointi. Määritimme heteroplasmian käyttäen restriktioentsyymianalyysia sekä kloonausta bakteerisoluihin. Järjestimme potilaiden mtDNA-sekvenssit fylogeneettisiksi puiksi ja kaikki proteiinin koodausta muuttavat geenimuutokset analysoimme haitallisuutta ennustavilla tietokoneohjelmilla (SNAP, PolyPhen-2, PMut, SIFT BLink). Diabetesta sairastavilla potilailla, joilla myös äidinpuoleisessa suvussa esiintyy diabetesta, havaitsimme useammin m.3010A>G- ja m.16189T>C-geenimuutoksia kuin väestöllä keskimäärin. Tutkimustulos tukee aikaisemmin julkaistuja tutkimustuloksia m.16189T>C-geenimuutoksen haitallisuudesta. Epilepsiapotilailta löytyi m.15218A>G-geenimuutos kahdessa U5a1-haploryhmän alatyypissä. Patogeenisyysanalyysien mukaan nämä geenimuutokset olivat haitallisia. Mitokondriaalinen haploryhmä V havaittiin useammin diabetesta sairastavilla kuin terveillä henkilöillä. Tutkimukseen valittiin potilaita, joiden äidinpuoleisilla lähisukulaisilla esiintyi yhtä tai useampaa seuraavista: diabetes, epilepsia tai aistimistyyppinen kuulovika. Väitöstutkimuksessa todetaan lisäksi, että m.8993T>C-mutaatio aiheuttaa aikuisiällä alkavaa ataksia-oireistoa. Kyseinen mutaatio on aiemmin yhdistetty vain lapsuusiän taudinkuviin. Kuvasimme uuden insertiomutaation (m.7585insT) kardiomyopatiasuvussa sekä uuden MTTT-geenin mutaation (m.15933G>A) tuntematonta mitokondriotautia sairastavalla potilaalla. Väitöskirjatutkimuksen tulokset osoittavat, että on tärkeää tutkia koko mitokondriogenomi, kun kyseessä on tuntemattomaksi jäänyt mitokondriaalinen taudinkuva. Uudet, tautia aiheuttavat, mtDNA:n geenimuutokset voivat jäädä tunnistamatta, jos tutkitaan ainoastaan raportoidut, tunnetut, mutaatiot. Lisäksi voi todeta, että mitokondriogenomissa esiintyy lievästi haitallisia geenimuutoksia tai niiden yhdistelmiä, jotka saattavat lisätä riskiä sairastua kansanterveydellisesti merkittäviin sairauksiin, kuten diabetekseen.

Abstract The β1-adrenergic receptor (β1AR) belongs to the large family of G protein-coupled receptors. It is activated by epinephrine and norepinephrine and thus has a central role in mediating the effects of the sympathetic nervous system. β1AR is the predominant adrenergic receptor in the heart, where it mediates positive inotropy and chronotropy. Thus, it is the most important target receptor for β-adrenergic antagonists, which are widely used in the treatment of cardiovascular diseases. Furthermore, β1AR is also expressed in the brain, where it has a crucial role in regulating memory formation and synaptic plasticity. Human β1AR (hβ1AR) has two polymorphisms, one at each terminus. The carboxyl-terminal (C-terminal) Arg389Gly8.56 polymorphism has previously been shown to have functional significance. Despite the clinical importance of hβ1AR, its biosynthetic profile and post-translational processing have not been well characterized to date. The aims of the present study were to shed light on these events, focusing on the limited proteolysis of hβ1AR and the impact of β-adrenergic ligands on receptor processing. In addition, the C-terminal polymorphism and its associations with certain parameters were investigated in a population consisting of survivors of acute myocardial infarction (AMI). By using a heterologous expression system, hβ1AR biosynthesis was revealed to be efficient and rapid. The N-terminus of the mature receptor was modified with O-glycans and one N-glycan, but despite these modifications it was subject to cleavage at the cell surface that resulted in two C-terminal fragments. The cleavage was mediated by a metalloproteinase, and importantly, it also occurred in vivo. Moreover, receptor activation enhanced the cleavage, which suggests that it represents a novel regulatory mechanism of hβ1AR. Interestingly, those ligands that enhanced the cleavage stabilized intracellular hβ1AR precursors, possibly via a pharmacological chaperone activity. Thus, the present study demonstrates that β-adrenergic ligands can have different regulatory effects on distinct hβ1AR forms. Among the AMI survivors, the Arg3898.56 homozygotes had significantly increased left ventricular mass indexes, when compared to the Gly3898.56 carriers, which suggests an association between Arg3898.56 and left ventricular hypertrophy (LVH). When euglycemic and diabetic patients were analyzed separately, the association existed among the euglycemic patients but was not present in diabetic patients. Diabetes is one of several risk factors that have previously been shown to influence the progression of LVH. Here, diabetes was shown to have a stronger effect on the development of LVH, when compared with the Arg3898.56 variant of hβ1AR. / Tiivistelmä β1-adrenerginen reseptori (β1AR) kuuluu laajaan G-proteiineihin kytkettyjen reseptorien perheeseen. β1AR on tärkeässä asemassa sympaattisen hermoston toiminnassa. Sydämessä β1AR on vallitseva adrenerginen reseptori, ja sydänlihaksen supistusvireys sekä -taajuus voimistuvat β1AR:n aktivaation kautta. Siten se edustaa sydän- ja verisuonisairauksissa käytettävien β-salpaajien tärkeintä kohdereseptoria. β1AR:n luontaisia agonisteja ovat lisämunuaisytimestä ja hermopäätteistä vapautuvat adrenaliini ja noradrenaliini. Sydänlihaksen lisäksi β1AR:a ilmennetään myös aivoissa, jossa reseptorilla on keskeinen asema muistin ja synaptisen muovautuvuuden kannalta. Ihmisen β1AR (hβ1AR) sisältää kaksi polymorfismia, joista toinen (Arg389Gly8.56) sijaitsee reseptorin karboksyyli- (C-) terminaalissa solulimassa. Tällä polymorfismilla on havaittu olevan toiminnallista merkitystä. Vaikka hβ1AR:n kliininen merkitys on huomattava, sen biosynteesistä ja translaationjälkeisestä muokkauksesta ei ole tähän mennessä ollut juurikaan tutkimustietoa. Tämän väitöskirjatyön tavoite oli kuvata näitä tapahtumia ja erityisesti keskittyä hβ1AR:n solunulkoisen amino- (N-) terminaalin rajoitettuun proteolyysiin. Lisäksi haluttiin tutkia, onko β-adrenergisillä ligandeilla vaikutusta reseptorin prosessointiin. Tutkimuksen kliinisessä osiossa kartoitettiin C-terminaalisen polymorfian yhteyttä valikoituihin muuttujiin aineistossa, joka koostui akuutin sydäninfarktin (AMI) sairastaneista potilaista. hβ1AR:n biosynteesin havaittiin olevan tehokas ja nopea heterologisessa systeemissä. Kypsän reseptorin N-terminaalissa havaittiin useita O-kytkennäisiä ja yksi N-kytkennäinen glykaani. Glykosyloinnista huolimatta N-terminaali pilkkoutui solun pinnalla, mikä tuotti kaksi solukalvolla sijaitsevaa, C-terminaalista reseptoripalasta. Pilkkoutumista, joka havaittiin myös in vivo, katalysoi metalloproteinaasi. Reseptorin aktivaatio kiihdytti pilkkoutumista, joka siten todennäköisesti edustaa uudenlaista hβ1AR:n säätelymekanismia. Ligandit, jotka kiihdyttivät pilkkoutumista, toisaalta stabiloivat solunsisäisiä hβ1AR:n epäkypsiä muotoja toimien luultavasti ns. farmakologisina kaperoneina. Näin ollen väitöskirjatyö osoittaa, että β-adrenergisillä ligandeilla voi olla erilaisia säätelyvaikutuksia eri hβ1AR-muotoihin. Kliinisessä tutkimuksessa Arg3898.56-homotsygooteilla potilailla havaittiin merkittävästi suurentunut vasemman kammion massaindeksi Gly3898.56-kantajiin verrattuina, mikä puoltaa Arg3898.56-polymorfismin ja vasemman kammion hypertrofian (LVH) välistä yhteyttä. Kun euglykeemisiä potilaita ja diabeetikkoja tutkittiin erikseen, yhteys ilmeni vain euglykeemisessä ryhmässä. Diabetes on riskitekijä, joka vaikuttaa LVH:n kehittymiseen. Tässä tutkimuksessa diabeteksellä havaittiin olevan voimakkaampi vaikutus LVH:n kehittymiseen Arg3898.56 -polymorfismiin verrattuna.