Pregnenolona (PREG) e 17-alfa-hidroxipregnenolona (17OHPREG) são dois esteroides produzidos pela glândula adrenal e precursores de vários hormônios esteroidais. A dosagem desses compostos tem aplicações clínicas, como o diagnóstico de doenças relacionadas aos corticoesteroides e mineralocorticóides e especialmente na avaliação da atividade da enzima 3-β-hidroxidesidrogenase que é decisiva no diagnóstico de um dos tipos de hiperplasia da glândula adrenal que causa defeitos severos na síntese de esteroides. Métodos cromatográficos associados à espectrometria de massas superaram a especificidade reduzida dos imunoensaios e tem sido crescentemente utilizados na quantificação de esteroides. Os últimos anos tem sido marcados pela hegemonia da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) em grande parte devido à velocidade e possibilidade da análise direta de vários analitos. Porém, no caso específico dos esteroides de tipo 3-hidroxi-5-eno, que apresentam baixa afinidade protônica e, portanto, baixa eficiência de ionização, são necessárias muitas etapas para a conversão em derivados mais detectáveis. Embora desfavorecida em relação ao LC-MS/MS nos últimos anos, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) apresenta várias características favoráveis para a análise de esteroides como a eficiência cromatográfica ainda insuperável. Adicionalmente, a incorporação da espectrometria de massas em tandem ao CG (CG-MS/MS) torna a técnica tão seletiva quanto LC-MS/MS. No presente trabalho, foi desenvolvido um novo método que permite a extração e derivatização simultâneas da PREG e 17OHPREG de amostras de soro tornando o método de preparo da amostra tão simples quanto os descritos para LC-MS/MS. O método de detecção desenvolvido baseado em ionização química no modo negativo obteve a sensibilidade necessária para o diagnóstico da deficiência da enzima 3-beta-hidroxidesidrogenase utilizando apenas 250 &#181:L de amostra. / Pregnenolone (PREG) and 17α-hydroxypregnenolone (17OHPREG) are two steroid precursors produced by the adrenal gland. The quantification of these compounds is essential for the evaluation of 3-β-hidroxidesidrogenase enzyme activity, which promotes the conversion of PREG in 17OHPREG. The 3-&#946:-hidroxidesidrogenase deficiency is a rare but severe type of adrenal hyperplasia that causes serious defects in steroid synthesis. Chromatographic methods coupled to mass spectrometry overcame immunoassays limitations such as reduced specificity, and have been widely used for steroids quantification. Recent years have been marked by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) hegemony due to the speed and possibility to analyze directly several analytes. However, in the case of type 3-hydroxy-5-ene steroids, which have low affinity for protons and, therefore, low ionization efficiency, many steps are required for conversion to detectable products. Notwithstanding, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) has some favorable features for steroid analysis such as unbeatable chromatographic efficiency. In addition, the incorporation of tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) makes it as selective as LC-MS/MS. In this study, a new method for simultaneous extraction and derivatization of PREG and 17OHPREG from serum was developed. This procedure makes sample preparation for GC-MS/MS as simples as those described for LC-MS/MS. The detection method based on negative mode chemical ionization achieved the sensitivity required for the diagnosis of 3-β-hidroxidesidrogenase defficiency using only 250 µL of sample.

Les neurostéroïdes sont des composés endogènes qui peuvent moduler la transmission synaptique et avoir un effet neuroprotecteur dans les maladies neurodégénératives. Les systèmes régulant leur biosynthèse ne sont pas connus mais la première étape de celle-ci peut être régulée par la protéine TSPO. Cette protéine mitochondriale facilite le transport du cholestérol vers l’intérieur de la mitochondrie pour y être métabolisé en prégnénolone. Ce stéroïde est le précurseur principal de la biosynthèse des neurostéroïdes et l’utilisation in vitro de ligands du TSPO permet d’augmenter sa sécrétion. Dans ce travail de thèse, nous avons ainsi cherché à développer de nouvelles familles de ligands solubles du TSPO augmentant la sécrétion de prégnénolone. Le développement de ces nouvelles familles a nécessité la réalisation d’une méthodologie de synthèse faisant intervenir une réaction de cyclisation pallado-catalysée de type Buchwald-Hartwig. Une étude de solubilité des composés synthétisés a été effectuée expérimentalement, leur activité a été évaluée par des méthodes fonctionnelles et leur effet neuroprotecteur a été testé sur un modèle cellulaire de la maladie d’Alzheimer. / Neurosteroids are endogenous compounds which can alter the synaptic transmission and enhance neuroprotection in neurodegenerative diseases. The systems that regulates their biosynthesis are not described but its first step ca be regulated by the TSPO. This mitochondrial protein facilitates the transport of cholesterol to the mitochondrial matrix to be metabolized in pregnenolone. This steroid is the precursor of neurosteroid biosynthesis and in vitro use of TSPO ligands induces its secretion. For this project, we looked forward to develop new families of soluble TSPO ligands that can increase pregnenolone production. The access to 3-amino-3,4-dihydroquinolin-2-ones required the establishment of a synthesis methodology of a palladium-catalyzed cyclization following Buchwald-Hartwig amination. A solubility study of synthesized compound was performed, their activity was established based on functional assays and their neuroprotective effect was evaluated on a cellular model of Alzheimer disease.