La dent est un tissu vivant, confronté tout au long de la vie à de multiples agressions (caries, traumatismes...) qui peuvent entraîner la nécrose de la pulpe. La mise au point d’une «pulpe équivalente» pourrait constituer une approche thérapeutique innovante comme alternative aux traitements actuels d’endodontie. La pulpe des dents temporaires constitue un réservoir de cellules souches mésenchymateuses (SHED Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth) aux potentiels de prolifération et de différenciation élevés. L’objectif global de ce travail est de reconstituer un tissu pulpaire fonctionnel en développant une pulpe équivalente (cellules pulpaires mésenchymateuses ensemencées dans une matrice 3D de collagène) pour être greffée à l’intérieur de la chambre pulpaire préalablement évidée afin de conserver la vitalité de la dent. Les objectifs spécifiques ont été : In vitro : 1) d'étudier le potentiel angiogénique des SHED comparés à des fibroblastes dermiques en conditions normoxiques et hypoxiques, 2) de déterminer la durée de pré-conditionnement hypoxique optimale pour stimuler le potentiel angiogénique des SHED, 3) de sélectionner une potentielle cytokine activant la formation de capillaires, 4) d’analyser l’effet de l’hypoxie sur l’expression des marqueurs de surfaces des SHED, et 5) de vérifier que l’hypoxie n’altérait pas le potentiel de minéralisation de ces cellules. In vivo : 1) d’évaluer, dans un modèle pré-clinique d’implantation de pulpes équivalentes en site ectopique chez la souris, l’effet du pré-conditionnement hypoxique sur le potentiel angiogénique des SHED. Ces expériences ont d’abord été conduites avec des cellules pulpaires de souris puis confirmées avec des SHED implantées dans des souris immunodéficientes, et 2) de développer des techniques d’imagerie dynamique pour suivre la néoangiogenèse dans les pulpes équivalentes implantées. Enfin, dans un objectif de transfert vers la clinique dentaire humaine, nous avons étudié l’effet d’un nouveau biomatériau à base de calcium tricalcique sur la réparation tissulaire dans un modèle de blessure pulpaire chez le rat, en comparaison aux matériaux de référence. / The tooth is a living organ, faced throughout life to multiple attacks (caries, trauma ...) which can cause necrosis of the pulp. The development of a" pulp equivalent " could be an innovative therapeutic approach as an alternative to current endodontic treatments. The pulp of deciduous teeth is a reservoir of mesenchymal stem cells (Stem cells SHED from Human Exfoliated Deciduous teeth) with a high potential of proliferation and differentiation. The overall objective of this work was to reconstitute a functional pulp tissue by developing a pulp equivalent (pulp mesenchymal cells seeded in a 3D collagen matrix) to be grafted within the previously hollowed pulp chamber to maintain tooth vitality. The specific objectives were: In vitro: 1) to study the angiogenic potential of SHED compared with dermal fibroblasts in normoxic and hypoxic conditions. 2) to determine the optimal hypoxic preconditioning period to stimulate the angiogenic potential of SHED, 3) to identify a potential cytokine activating the capillary formation, 4) to analyze the effect of hypoxia on the expression of markers surfaces SHED, and 5) to check that hypoxia did not alter the mineralization potential of these cells. In vivo: 1) to evaluate, in a pre-clinical model of pulp equivalent implantation in ectopic site in mice, the effect of either hypoxic or FGF preconditioning on the angiogenic potential of SHED. These experiments were first conducted with mouse pulp cells and further confirmed with SHED implanted in immunodeficient mice, and 2) to develop dynamic imaging techniques to monitor neoangiogenesis within pulp equivalent. Finally, in an objective of transfer to the human dental clinic, we studied the effect of a new biomaterial based on tricalcium on tissue repair in a pulp injury model in rats, compared to gold standard materials.

La dent est un tissu vivant, confronté tout au long de la vie à de multiples agressions (caries, traumatismes...) qui peuvent entraîner la nécrose de la pulpe. La mise au point d’une «pulpe équivalente» pourrait constituer une approche thérapeutique innovante comme alternative aux traitements actuels d’endodontie. La pulpe des dents temporaires constitue un réservoir de cellules souches mésenchymateuses (SHED Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth) aux potentiels de prolifération et de différenciation élevés. L’objectif global de ce travail est de reconstituer un tissu pulpaire fonctionnel en développant une pulpe équivalente (cellules pulpaires mésenchymateuses ensemencées dans une matrice 3D de collagène) pour être greffée à l’intérieur de la chambre pulpaire préalablement évidée afin de conserver la vitalité de la dent. Les objectifs spécifiques ont été : In vitro : 1) d'étudier le potentiel angiogénique des SHED comparés à des fibroblastes dermiques en conditions normoxiques et hypoxiques, 2) de déterminer la durée de pré-conditionnement hypoxique optimale pour stimuler le potentiel angiogénique des SHED, 3) de sélectionner une potentielle cytokine activant la formation de capillaires, 4) d’analyser l’effet de l’hypoxie sur l’expression des marqueurs de surfaces des SHED, et 5) de vérifier que l’hypoxie n’altérait pas le potentiel de minéralisation de ces cellules. In vivo : 1) d’évaluer, dans un modèle pré-clinique d’implantation de pulpes équivalentes en site ectopique chez la souris, l’effet du pré-conditionnement hypoxique sur le potentiel angiogénique des SHED. Ces expériences ont d’abord été conduites avec des cellules pulpaires de souris puis confirmées avec des SHED implantées dans des souris immunodéficientes, et 2) de développer des techniques d’imagerie dynamique pour suivre la néoangiogenèse dans les pulpes équivalentes implantées. Enfin, dans un objectif de transfert vers la clinique dentaire humaine, nous avons étudié l’effet d’un nouveau biomatériau à base de calcium tricalcique sur la réparation tissulaire dans un modèle de blessure pulpaire chez le rat, en comparaison aux matériaux de référence. / The tooth is a living organ, faced throughout life to multiple attacks (caries, trauma ...) which can cause necrosis of the pulp. The development of a" pulp equivalent " could be an innovative therapeutic approach as an alternative to current endodontic treatments. The pulp of deciduous teeth is a reservoir of mesenchymal stem cells (Stem cells SHED from Human Exfoliated Deciduous teeth) with a high potential of proliferation and differentiation. The overall objective of this work was to reconstitute a functional pulp tissue by developing a pulp equivalent (pulp mesenchymal cells seeded in a 3D collagen matrix) to be grafted within the previously hollowed pulp chamber to maintain tooth vitality. The specific objectives were: In vitro: 1) to study the angiogenic potential of SHED compared with dermal fibroblasts in normoxic and hypoxic conditions. 2) to determine the optimal hypoxic preconditioning period to stimulate the angiogenic potential of SHED, 3) to identify a potential cytokine activating the capillary formation, 4) to analyze the effect of hypoxia on the expression of markers surfaces SHED, and 5) to check that hypoxia did not alter the mineralization potential of these cells. In vivo: 1) to evaluate, in a pre-clinical model of pulp equivalent implantation in ectopic site in mice, the effect of either hypoxic or FGF preconditioning on the angiogenic potential of SHED. These experiments were first conducted with mouse pulp cells and further confirmed with SHED implanted in immunodeficient mice, and 2) to develop dynamic imaging techniques to monitor neoangiogenesis within pulp equivalent. Finally, in an objective of transfer to the human dental clinic, we studied the effect of a new biomaterial based on tricalcium on tissue repair in a pulp injury model in rats, compared to gold standard materials.

La dent est un tissu vivant, confronté tout au long de la vie à de multiples agressions (caries, traumatismes...) qui peuvent entraîner la nécrose de la pulpe. La mise au point d’une «pulpe équivalente» pourrait constituer une approche thérapeutique innovante comme alternative aux traitements actuels d’endodontie. La pulpe des dents temporaires constitue un réservoir de cellules souches mésenchymateuses (SHED Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth) aux potentiels de prolifération et de différenciation élevés. L’objectif global de ce travail est de reconstituer un tissu pulpaire fonctionnel en développant une pulpe équivalente (cellules pulpaires mésenchymateuses ensemencées dans une matrice 3D de collagène) pour être greffée à l’intérieur de la chambre pulpaire préalablement évidée afin de conserver la vitalité de la dent. Les objectifs spécifiques ont été : In vitro : 1) d'étudier le potentiel angiogénique des SHED comparés à des fibroblastes dermiques en conditions normoxiques et hypoxiques, 2) de déterminer la durée de pré-conditionnement hypoxique optimale pour stimuler le potentiel angiogénique des SHED, 3) de sélectionner une potentielle cytokine activant la formation de capillaires, 4) d’analyser l’effet de l’hypoxie sur l’expression des marqueurs de surfaces des SHED, et 5) de vérifier que l’hypoxie n’altérait pas le potentiel de minéralisation de ces cellules. In vivo : 1) d’évaluer, dans un modèle pré-clinique d’implantation de pulpes équivalentes en site ectopique chez la souris, l’effet du pré-conditionnement hypoxique sur le potentiel angiogénique des SHED. Ces expériences ont d’abord été conduites avec des cellules pulpaires de souris puis confirmées avec des SHED implantées dans des souris immunodéficientes, et 2) de développer des techniques d’imagerie dynamique pour suivre la néoangiogenèse dans les pulpes équivalentes implantées. Enfin, dans un objectif de transfert vers la clinique dentaire humaine, nous avons étudié l’effet d’un nouveau biomatériau à base de calcium tricalcique sur la réparation tissulaire dans un modèle de blessure pulpaire chez le rat, en comparaison aux matériaux de référence. / The tooth is a living organ, faced throughout life to multiple attacks (caries, trauma ...) which can cause necrosis of the pulp. The development of a" pulp equivalent " could be an innovative therapeutic approach as an alternative to current endodontic treatments. The pulp of deciduous teeth is a reservoir of mesenchymal stem cells (Stem cells SHED from Human Exfoliated Deciduous teeth) with a high potential of proliferation and differentiation. The overall objective of this work was to reconstitute a functional pulp tissue by developing a pulp equivalent (pulp mesenchymal cells seeded in a 3D collagen matrix) to be grafted within the previously hollowed pulp chamber to maintain tooth vitality. The specific objectives were: In vitro: 1) to study the angiogenic potential of SHED compared with dermal fibroblasts in normoxic and hypoxic conditions. 2) to determine the optimal hypoxic preconditioning period to stimulate the angiogenic potential of SHED, 3) to identify a potential cytokine activating the capillary formation, 4) to analyze the effect of hypoxia on the expression of markers surfaces SHED, and 5) to check that hypoxia did not alter the mineralization potential of these cells. In vivo: 1) to evaluate, in a pre-clinical model of pulp equivalent implantation in ectopic site in mice, the effect of either hypoxic or FGF preconditioning on the angiogenic potential of SHED. These experiments were first conducted with mouse pulp cells and further confirmed with SHED implanted in immunodeficient mice, and 2) to develop dynamic imaging techniques to monitor neoangiogenesis within pulp equivalent. Finally, in an objective of transfer to the human dental clinic, we studied the effect of a new biomaterial based on tricalcium on tissue repair in a pulp injury model in rats, compared to gold standard materials.

A successful immune response depends on prompt and sufficient recruitment of leukocytes from the circulation to infected or injured sites. Mobilization of leukocytes to hypoxic tissues is vital for angiogenesis, i.e. the formation of new blood vessels from preexisting vasculature, and thus crucial for tissue growth and regeneration. Deviations from normal leukocyte recruitment drive a variety of pathologies, including chronic inflammation, autoimmune diseases and cancer, for which therapeutic options are limited or unspecific. Understanding the mechanisms by which the body controls leukocyte recruitment is therefore critical for the development of novel therapeutic strategies. The present investigations focused on delineating the mechanisms behind leukocyte mobilization from the bloodstream to afflicted sites, by means of in vivo imaging techniques and in vitro assays. We demonstrate that, in response to inflammation, increased vascular permeability enhances transendothelial transport of tissue-released chemokines. Within the vasculature, chemokines form a chemotactic gradient sequestered on heparan sulfate, which directs crawling neutrophils and expedites their extravasation to the inflamed tissue. Consequently, gradient formation grants efficient bacterial clearance. Citrullination of chemokines by leukocyte-derived PAD enzymes in the inflamed tissue prevents chemokine transport into blood vessels, which dampens further neutrophil recruitment and thereby controls the amplitude of the inflammatory response. Moreover, the mechanisms of neutrophil recruitment in response to proangiogenic factors released during hypoxia are revealed to differ from those observed during classical inflammation. Particularly, VLA-4 integrin and VEGFR1 expressed on a defined subset of neutrophils, along with endothelial VEGFR2, are required for efficient neutrophil recruitment to hypoxia. Rather than stimulus-induced phenotypic changes on neutrophils, specific neutrophil subtypes with innate proinflammatory or proangiogenic functions (respectively, CD49d-VEGFR1lowCXCR4low and CD49d+VEGFR1highCXCR4high) coexist in the circulation of humans and mice. In summary, this dissertation provides relevant information on specific steps of neutrophil recruitment to inflamed or hypoxic tissues, which may represent future means to down-regulate aberrant immune responses during chronic inflammation and autoimmune diseases; to increase angiogenesis during ischemia; or to limit pathological angiogenesis, a characteristic of tumor growth and of several chronic inflammatory disorders.

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