Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su tesis en el Portal de Tesis Electrónicas / El concepto actual en la formación de la caries dental, es que coexisten una serie de factores biológicos individuales de orden microbiológicos, salivales, genéticos, ecológicos, entre otros factores de riesgo indirectos como comportamientos, educación, conocimientos, estrato sociocultural (Fejerskov O y cols., 2008). Los componentes de la saliva previenen la desmineralización del esmalte, tienen un papel importante en la remineralización y son esenciales en el balance ácido-base de la placa bacteriana. Además, las macromoléculas salivales están comprometidas con las funciones de formación de la película adquirida (Núñez D y cols., 2010). Una gran variedad de proteínas salivales presentan propiedades antimicrobianas o participan en la aglutinación microbiana. Además, sobre la superficie del diente, algunas proteínas salivales actúan como receptores para la adherencia bacteriana, permitiendo la colonización selectiva del diente por bacterias comensales o patógenas, regulando así la composición de los microorganismos que forman parte de la placa dental (Van Nieuw Amerongen A y cols., 2004). Por estas razones, una serie de estudios pretenden relacionar la composición proteica salival con la presencia de caries dental. Dentro de esta composición proteica se han estudiado las proteínas ricas en prolina. En este estudio se analizó la saliva total de niños preescolares con y sin caries, mediante la técnica de análisis electroforético unidimensional, en busca de proteínas ricas en prolina que se tiñen metacromáticamente y su relación con el índice ceod. Con respecto a lo anterior, se encontraron 4 bandas de proteínas que se tiñeron metacromáticamente cuyos tamaños moleculares fueron de 22, 25, 32 y 70 kDa. La saliva total analizada presentó igual frecuencia de proteínas ricas en prolina (PRP) en los voluntarios con caries y sin caries. Sólo hubo diferencia significativa en la frecuencia de la banda de 70 kDa que se presentó mayoritariamente en el grupo con índice ceod ≤2. La mayor frecuencia de la banda de 70 kDa en niños con índice ceod ≤2 podría sugerir una función protectora de ésta proteína.

Os estresses abióticos, tais como seca, alta salinidade e temperaturas extremas são as causas primárias de quebras de safra na agricultura mundial, reduzindo a produção das principais culturas em mais de 50%. Dentre os estresses citados, a seca é um dos principais responsáveis pelas perdas na produção, mesmo que as plantas, ao longo da evolução, já tenham desenvolvido complexas vias metabólicas de resistência à falta de água. As funções classicamente conhecidas da parede celular são: estruturação da planta, determinação do tamanho e do formato das células vegetais e atuação como barreira mecânica à invasão de patógenos. Além disso, vários genes que codificam proteínas da parede celular têm sua regulação alterada mediante alta salinidade, seca e baixas temperaturas, indicando sua participação na resposta ao estresse hídrico. As Proteínas Híbridas Ricas em Prolina (HyPRPs) são glicoproteínas de parede celular com função pouco conhecida. O gene SbPRP (Glyma14g14220), membro da família HyPRP de soja, teve sua expressão aumentada perante a seca, ao estresse salino, a hormônios vegetais, ao ácido salicílico e a infecções virais em um trabalho onde foi utilizada a técnica de Northern blot. Com o objetivo de entender a atuação da proteína SbPRP na aclimatação da soja para tolerância à seca, a região codificadora do gene SbPRP foi isolada por PCR a partir do DNA total de Glycine max (cultivar IAS5), utilizando-se iniciadores específicos. Através do sistema Gateway-Invitrogen de clonagem por recombinação foram obtidas construções para superexpressão e silenciamento de SbPRP. Conjuntos embriogênicos somáticos das cultivares IAS5 e Vencedora foram submetidos ao protocolo de transformação, que combina bombardeamento com o sistema Agrobacterium e ao protocolo de biolística. Atualmente, embriões histodiferenciados encontram-se na fase de regeneração, já tendo sido obtidas cinco plântulas trifolioladas relativas à construção de superexpressão. Com o sequenciamento do genoma da soja foi possível a identificação de 35 genes HyPRP. Através de análises filogenéticas, envolvendo os 35 membros HyPRP de soja, o gene SbPRP (Glyma14g14220) ficou agrupado no mesmo clado composto por outros três genes HyPRP (Glyma04g06970, Glyma06g07070 e Glyma17g32100). Na tentativa de aumentar o conhecimento do papel biológico das HyPRPs em soja, foram delineados experimentos para verificação da resposta dos quatro genes do clado monofilético (Glyma04g06970, Glyma06g07070, Glyma17g32100 e Glyma14g14220). Transcritos do gene Glyma06g07070 não puderam ser detectados, sendo excluídos das análises. Foi possível avaliar os transcritos de três destes genes por PCR em Tempo Real, a partir de RNA de plantas de soja submetidas a tratamentos de alta salinidade, ácido abscísico (ABA), ácido salicílico e infecção por Phakopsora pachirizi (fungo causador da ferrugem asiática). Foram constatados aumentos significativos na expressão dos genes em diversos tempos após a inoculação de urediniósporos de P. pachirizi, em resposta a tratamento com ABA e em resposta ao ácido salicílico. O tratamento com sal reprimiu a expressão dos genes Glyma14g14220 e Glyma17g32100. Os resultados obtidos reforçam a possibilidade das HyPRPs estarem envolvidas em resposta a estresses bióticos e abióticos. / Abiotic stresses like drought, high salinity and high temperatures are the main causes of yield losses in agriculture, causing production decreases of more than 50% in the major crops around the world. Among the cited stresses, drought figures as one of the most important agents causing production decrease, even though plants have developed complex metabolic pathways to tolerate water deficit along evolution. The traditional cell wall functions known are: plant structure, cell format and size determination, and a role as mechanical barrier against pathogen attacks. Besides that, many genes encoding cell wall proteins have their regulation modified by high salinity, drought and low temperatures, which indicates a participation in response to water stress. The Hybrid Proline Rich Proteins (HyPRPs) are cell wall glycoproteins with poorly known function. The gene SbPRP (Glyma14g14220), a HyPRP soybean member, has its expression increased under drought conditions, high salinity, treatment with hormones, salicylic acid and viral infections. Aiming to understand the role of the SpPRP protein in the soybean drought tolerance acclimatation, the SbPRP gene coding sequence was isolated by PCR cloning using specific primers and Glycine max (cultivar IAS5) genomic DNA as template. Constructions were obtained through the Gateway system for SbPRP super expression and silencing. Somatic embryogenic (IAS5 and Vencedora soybean cultivars) sets were submitted to the combined Agrobacterium/bombardment or biolistic protocols. Histo-differentiated embryos are presently in the regeneration phase, and five tree-leaf-seedlings containing the super expression construction were already obtained. After the soybean genome sequencing, it was possible to identify 35 HyPRP genes. Based on phylogenetic analysis, the SbPRP gene has grouped in the same clade formed by three other HyPRP genes (Glyma04g06970, Glyma06g07070 and Glyma17g32100). Trying to increase the knowledge about a possible biological role of the soybean HyPRPs, experiments were delineated to check the response of the four monophyletic clade forming genes (Glyma04g06970, Glyma17g32100 and Glyma14g14220). Transcripts of three genes were detected and analyzed with Real Time PCR experiments after high salinity, ABA, and salicylic acid treatments, and Phakopsora pachirizi infection (Asian rust agent). Transcripts of the gene Glyma06g07070 were not detected in any experiment. An increase in the genes’ expression was observed after different treatment times after the P. pachirizi urediniospores inoculation, and in response to ABA and salicylic acid treatments. Salt treatment repressed the expression of Glyma14g14220 and Glyma17g32100. The results reinforce the possibility of HyPRP involvement in biotic and abiotic responses.

La producción mundial de jugos cítricos concentrados se estima en 2,6 millones de toneladas. El jugo de naranja representa el 88% del total. El mercado es liderizado por Brasil con el 50% del volumen elaborado, seguido por EEUU con el 40%. En Bolivia el mercado de frutas se encuentra en continuo crecimiento, tanto para importación como para consumo interno. Actualmente se comercializan bebidas a base de jugo de frutas tanto de importación como de fabricación nacional, las mismas que son sometidas a control por los Organismos Oficiales (Ministerio de Salud y Deportes, y el Servicio Nacional de Sanidad Agropecuaria e Inocuidad Alimentaria - SENASAG) bajo la Normativa Nacional e Internacional reconocida como es la Norma Boliviana y el Codex Alimentarius, al igual que todos los productos alimenticios para garantizar su calidad e inocuidad. El análisis laboratorial se basa principalmente en las determinaciones de parámetros fisicoquímicos que necesitan ser complementados con otros métodos analíticos (como: la Cuantificación de Prolina por Espectrofotometría, Indice de Formol y Cuantificación de Pectinas) propuestos en éste trabajo, capaces de determinar la genuinidad de jugos de naranja presentes en el comercio de la ciudad de La Paz, y así colaborar con los Organismos de Control para cumplir a cabalidad con la responsabilidad de garantizar que los productos consumidos por nuestra población cumplen con lo declarado.

Prolina (Pro) é metabolizada por suas próprias enzimas especializadas com seus próprios mecanismos de regulação e localizações teciduais e subcelulares. Foram descritos erros inatos no metabolismo da Pro em seres humanos. A Hiperprolinemia tipo II é uma doença hereditária causada por uma deficiência de Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, cuja característica bioquímica é a acumulação de Pro no plasma e tecidos causando diversos problemas, incluindo dano cerebral em alguns pacientes. Vários investigadores demonstram a Pro como uma fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) e uma relação entre uma concentração elevada de Pro e sintomas neurológicos tem sido demonstrada em pacientes com HPII. Uma vez que as mitocôndrias constituem uma fonte importante de EROs, investigou-se a geração de EROs mediada por Pro em mitocôndrias de fígado de rato. Os resultados sugeriram que uma função normal do complexo III da cadeia transportadora de elétrons (CTE) parece ser essencial para a toxicidade da Pro, enquanto que a atividade dos complexos I e IV, e presença Ca+2, aparentemente, não são necessárias. Como existe uma escassez de informações sobre as funções da Pro no crescimento e desenvolvimento do feto e recém-nascido, bem como uma falta de novas estratégias terapêuticas, também investigamos a ação do piruvato e de creatina sobre os efeitos desencadeados pela administração crônica de Pro em ratas durante a gravidez e lactação sobre o cérebro da prole. administração de Pro nas mães induziu estresse oxidativo e diminuiu as atividades da piruvato quinase e creatina quinase no cérebro da prole. No entanto, a co-administração de creatina e piruvato preveniram apenas parcialmente as alterações causadas pela administração de Pro. / Proline (Pro) is metabolized by its own specialized enzymes with their own tissue and subcellular localizations and mechanisms of regulation. Inborn errors of Pro metabolism have been described. Type II Hyperprolinemia is an inherited disorder caused by a deficiency of Δ1-pyrroline- 5-carboxilic acid dehydrogenase, whose biochemical hallmark is Pro accumulation in plasma and tissues causing several problems including cerebral damage in some affected patients. Several investigators have shown that Pro is a source of reactive oxygen species (ROS) and a relationship between a high concentration of Pro and neurological symptoms has been demonstrated in patients with HPII. Since mitochondria constitute a major source of ROS, we investigated the generation of Pro-mediated ROS by Pro in rat liver mitochondria. We found that a normal function of complex III of the electron transport chain (ETC) seems to be essential for Pro toxicity, whereas activity of complexes I and IV and Ca+2 presence apparently are not required. Because there is a paucity of information about roles for Pro in growth and development of the fetus and neonate, as well as a lack on new therapeutic strategies, we also investigated the action of pyruvate and creatine on the effects elicited by chronic Pro administration to female rats during pregnancy and lactation on the offspring brain. We found that Pro administration to the mothers induced oxidative stress and diminished the pyruvate kinase and creatine kinase activities in the brain of the offspring. However, co-administration of creatine plus pyruvate did not fully prevented the alterations caused by Pro administration.

Os estresses abióticos, tais como seca, alta salinidade e temperaturas extremas são as causas primárias de quebras de safra na agricultura mundial, reduzindo a produção das principais culturas em mais de 50%. Dentre os estresses citados, a seca é um dos principais responsáveis pelas perdas na produção, mesmo que as plantas, ao longo da evolução, já tenham desenvolvido complexas vias metabólicas de resistência à falta de água. As funções classicamente conhecidas da parede celular são: estruturação da planta, determinação do tamanho e do formato das células vegetais e atuação como barreira mecânica à invasão de patógenos. Além disso, vários genes que codificam proteínas da parede celular têm sua regulação alterada mediante alta salinidade, seca e baixas temperaturas, indicando sua participação na resposta ao estresse hídrico. As Proteínas Híbridas Ricas em Prolina (HyPRPs) são glicoproteínas de parede celular com função pouco conhecida. O gene SbPRP (Glyma14g14220), membro da família HyPRP de soja, teve sua expressão aumentada perante a seca, ao estresse salino, a hormônios vegetais, ao ácido salicílico e a infecções virais em um trabalho onde foi utilizada a técnica de Northern blot. Com o objetivo de entender a atuação da proteína SbPRP na aclimatação da soja para tolerância à seca, a região codificadora do gene SbPRP foi isolada por PCR a partir do DNA total de Glycine max (cultivar IAS5), utilizando-se iniciadores específicos. Através do sistema Gateway-Invitrogen de clonagem por recombinação foram obtidas construções para superexpressão e silenciamento de SbPRP. Conjuntos embriogênicos somáticos das cultivares IAS5 e Vencedora foram submetidos ao protocolo de transformação, que combina bombardeamento com o sistema Agrobacterium e ao protocolo de biolística. Atualmente, embriões histodiferenciados encontram-se na fase de regeneração, já tendo sido obtidas cinco plântulas trifolioladas relativas à construção de superexpressão. Com o sequenciamento do genoma da soja foi possível a identificação de 35 genes HyPRP. Através de análises filogenéticas, envolvendo os 35 membros HyPRP de soja, o gene SbPRP (Glyma14g14220) ficou agrupado no mesmo clado composto por outros três genes HyPRP (Glyma04g06970, Glyma06g07070 e Glyma17g32100). Na tentativa de aumentar o conhecimento do papel biológico das HyPRPs em soja, foram delineados experimentos para verificação da resposta dos quatro genes do clado monofilético (Glyma04g06970, Glyma06g07070, Glyma17g32100 e Glyma14g14220). Transcritos do gene Glyma06g07070 não puderam ser detectados, sendo excluídos das análises. Foi possível avaliar os transcritos de três destes genes por PCR em Tempo Real, a partir de RNA de plantas de soja submetidas a tratamentos de alta salinidade, ácido abscísico (ABA), ácido salicílico e infecção por Phakopsora pachirizi (fungo causador da ferrugem asiática). Foram constatados aumentos significativos na expressão dos genes em diversos tempos após a inoculação de urediniósporos de P. pachirizi, em resposta a tratamento com ABA e em resposta ao ácido salicílico. O tratamento com sal reprimiu a expressão dos genes Glyma14g14220 e Glyma17g32100. Os resultados obtidos reforçam a possibilidade das HyPRPs estarem envolvidas em resposta a estresses bióticos e abióticos. / Abiotic stresses like drought, high salinity and high temperatures are the main causes of yield losses in agriculture, causing production decreases of more than 50% in the major crops around the world. Among the cited stresses, drought figures as one of the most important agents causing production decrease, even though plants have developed complex metabolic pathways to tolerate water deficit along evolution. The traditional cell wall functions known are: plant structure, cell format and size determination, and a role as mechanical barrier against pathogen attacks. Besides that, many genes encoding cell wall proteins have their regulation modified by high salinity, drought and low temperatures, which indicates a participation in response to water stress. The Hybrid Proline Rich Proteins (HyPRPs) are cell wall glycoproteins with poorly known function. The gene SbPRP (Glyma14g14220), a HyPRP soybean member, has its expression increased under drought conditions, high salinity, treatment with hormones, salicylic acid and viral infections. Aiming to understand the role of the SpPRP protein in the soybean drought tolerance acclimatation, the SbPRP gene coding sequence was isolated by PCR cloning using specific primers and Glycine max (cultivar IAS5) genomic DNA as template. Constructions were obtained through the Gateway system for SbPRP super expression and silencing. Somatic embryogenic (IAS5 and Vencedora soybean cultivars) sets were submitted to the combined Agrobacterium/bombardment or biolistic protocols. Histo-differentiated embryos are presently in the regeneration phase, and five tree-leaf-seedlings containing the super expression construction were already obtained. After the soybean genome sequencing, it was possible to identify 35 HyPRP genes. Based on phylogenetic analysis, the SbPRP gene has grouped in the same clade formed by three other HyPRP genes (Glyma04g06970, Glyma06g07070 and Glyma17g32100). Trying to increase the knowledge about a possible biological role of the soybean HyPRPs, experiments were delineated to check the response of the four monophyletic clade forming genes (Glyma04g06970, Glyma17g32100 and Glyma14g14220). Transcripts of three genes were detected and analyzed with Real Time PCR experiments after high salinity, ABA, and salicylic acid treatments, and Phakopsora pachirizi infection (Asian rust agent). Transcripts of the gene Glyma06g07070 were not detected in any experiment. An increase in the genes’ expression was observed after different treatment times after the P. pachirizi urediniospores inoculation, and in response to ABA and salicylic acid treatments. Salt treatment repressed the expression of Glyma14g14220 and Glyma17g32100. The results reinforce the possibility of HyPRP involvement in biotic and abiotic responses.

Os estresses abióticos, tais como seca, alta salinidade e temperaturas extremas são as causas primárias de quebras de safra na agricultura mundial, reduzindo a produção das principais culturas em mais de 50%. Dentre os estresses citados, a seca é um dos principais responsáveis pelas perdas na produção, mesmo que as plantas, ao longo da evolução, já tenham desenvolvido complexas vias metabólicas de resistência à falta de água. As funções classicamente conhecidas da parede celular são: estruturação da planta, determinação do tamanho e do formato das células vegetais e atuação como barreira mecânica à invasão de patógenos. Além disso, vários genes que codificam proteínas da parede celular têm sua regulação alterada mediante alta salinidade, seca e baixas temperaturas, indicando sua participação na resposta ao estresse hídrico. As Proteínas Híbridas Ricas em Prolina (HyPRPs) são glicoproteínas de parede celular com função pouco conhecida. O gene SbPRP (Glyma14g14220), membro da família HyPRP de soja, teve sua expressão aumentada perante a seca, ao estresse salino, a hormônios vegetais, ao ácido salicílico e a infecções virais em um trabalho onde foi utilizada a técnica de Northern blot. Com o objetivo de entender a atuação da proteína SbPRP na aclimatação da soja para tolerância à seca, a região codificadora do gene SbPRP foi isolada por PCR a partir do DNA total de Glycine max (cultivar IAS5), utilizando-se iniciadores específicos. Através do sistema Gateway-Invitrogen de clonagem por recombinação foram obtidas construções para superexpressão e silenciamento de SbPRP. Conjuntos embriogênicos somáticos das cultivares IAS5 e Vencedora foram submetidos ao protocolo de transformação, que combina bombardeamento com o sistema Agrobacterium e ao protocolo de biolística. Atualmente, embriões histodiferenciados encontram-se na fase de regeneração, já tendo sido obtidas cinco plântulas trifolioladas relativas à construção de superexpressão. Com o sequenciamento do genoma da soja foi possível a identificação de 35 genes HyPRP. Através de análises filogenéticas, envolvendo os 35 membros HyPRP de soja, o gene SbPRP (Glyma14g14220) ficou agrupado no mesmo clado composto por outros três genes HyPRP (Glyma04g06970, Glyma06g07070 e Glyma17g32100). Na tentativa de aumentar o conhecimento do papel biológico das HyPRPs em soja, foram delineados experimentos para verificação da resposta dos quatro genes do clado monofilético (Glyma04g06970, Glyma06g07070, Glyma17g32100 e Glyma14g14220). Transcritos do gene Glyma06g07070 não puderam ser detectados, sendo excluídos das análises. Foi possível avaliar os transcritos de três destes genes por PCR em Tempo Real, a partir de RNA de plantas de soja submetidas a tratamentos de alta salinidade, ácido abscísico (ABA), ácido salicílico e infecção por Phakopsora pachirizi (fungo causador da ferrugem asiática). Foram constatados aumentos significativos na expressão dos genes em diversos tempos após a inoculação de urediniósporos de P. pachirizi, em resposta a tratamento com ABA e em resposta ao ácido salicílico. O tratamento com sal reprimiu a expressão dos genes Glyma14g14220 e Glyma17g32100. Os resultados obtidos reforçam a possibilidade das HyPRPs estarem envolvidas em resposta a estresses bióticos e abióticos. / Abiotic stresses like drought, high salinity and high temperatures are the main causes of yield losses in agriculture, causing production decreases of more than 50% in the major crops around the world. Among the cited stresses, drought figures as one of the most important agents causing production decrease, even though plants have developed complex metabolic pathways to tolerate water deficit along evolution. The traditional cell wall functions known are: plant structure, cell format and size determination, and a role as mechanical barrier against pathogen attacks. Besides that, many genes encoding cell wall proteins have their regulation modified by high salinity, drought and low temperatures, which indicates a participation in response to water stress. The Hybrid Proline Rich Proteins (HyPRPs) are cell wall glycoproteins with poorly known function. The gene SbPRP (Glyma14g14220), a HyPRP soybean member, has its expression increased under drought conditions, high salinity, treatment with hormones, salicylic acid and viral infections. Aiming to understand the role of the SpPRP protein in the soybean drought tolerance acclimatation, the SbPRP gene coding sequence was isolated by PCR cloning using specific primers and Glycine max (cultivar IAS5) genomic DNA as template. Constructions were obtained through the Gateway system for SbPRP super expression and silencing. Somatic embryogenic (IAS5 and Vencedora soybean cultivars) sets were submitted to the combined Agrobacterium/bombardment or biolistic protocols. Histo-differentiated embryos are presently in the regeneration phase, and five tree-leaf-seedlings containing the super expression construction were already obtained. After the soybean genome sequencing, it was possible to identify 35 HyPRP genes. Based on phylogenetic analysis, the SbPRP gene has grouped in the same clade formed by three other HyPRP genes (Glyma04g06970, Glyma06g07070 and Glyma17g32100). Trying to increase the knowledge about a possible biological role of the soybean HyPRPs, experiments were delineated to check the response of the four monophyletic clade forming genes (Glyma04g06970, Glyma17g32100 and Glyma14g14220). Transcripts of three genes were detected and analyzed with Real Time PCR experiments after high salinity, ABA, and salicylic acid treatments, and Phakopsora pachirizi infection (Asian rust agent). Transcripts of the gene Glyma06g07070 were not detected in any experiment. An increase in the genes’ expression was observed after different treatment times after the P. pachirizi urediniospores inoculation, and in response to ABA and salicylic acid treatments. Salt treatment repressed the expression of Glyma14g14220 and Glyma17g32100. The results reinforce the possibility of HyPRP involvement in biotic and abiotic responses.

Prolina (Pro) é metabolizada por suas próprias enzimas especializadas com seus próprios mecanismos de regulação e localizações teciduais e subcelulares. Foram descritos erros inatos no metabolismo da Pro em seres humanos. A Hiperprolinemia tipo II é uma doença hereditária causada por uma deficiência de Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, cuja característica bioquímica é a acumulação de Pro no plasma e tecidos causando diversos problemas, incluindo dano cerebral em alguns pacientes. Vários investigadores demonstram a Pro como uma fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) e uma relação entre uma concentração elevada de Pro e sintomas neurológicos tem sido demonstrada em pacientes com HPII. Uma vez que as mitocôndrias constituem uma fonte importante de EROs, investigou-se a geração de EROs mediada por Pro em mitocôndrias de fígado de rato. Os resultados sugeriram que uma função normal do complexo III da cadeia transportadora de elétrons (CTE) parece ser essencial para a toxicidade da Pro, enquanto que a atividade dos complexos I e IV, e presença Ca+2, aparentemente, não são necessárias. Como existe uma escassez de informações sobre as funções da Pro no crescimento e desenvolvimento do feto e recém-nascido, bem como uma falta de novas estratégias terapêuticas, também investigamos a ação do piruvato e de creatina sobre os efeitos desencadeados pela administração crônica de Pro em ratas durante a gravidez e lactação sobre o cérebro da prole. administração de Pro nas mães induziu estresse oxidativo e diminuiu as atividades da piruvato quinase e creatina quinase no cérebro da prole. No entanto, a co-administração de creatina e piruvato preveniram apenas parcialmente as alterações causadas pela administração de Pro. / Proline (Pro) is metabolized by its own specialized enzymes with their own tissue and subcellular localizations and mechanisms of regulation. Inborn errors of Pro metabolism have been described. Type II Hyperprolinemia is an inherited disorder caused by a deficiency of Δ1-pyrroline- 5-carboxilic acid dehydrogenase, whose biochemical hallmark is Pro accumulation in plasma and tissues causing several problems including cerebral damage in some affected patients. Several investigators have shown that Pro is a source of reactive oxygen species (ROS) and a relationship between a high concentration of Pro and neurological symptoms has been demonstrated in patients with HPII. Since mitochondria constitute a major source of ROS, we investigated the generation of Pro-mediated ROS by Pro in rat liver mitochondria. We found that a normal function of complex III of the electron transport chain (ETC) seems to be essential for Pro toxicity, whereas activity of complexes I and IV and Ca+2 presence apparently are not required. Because there is a paucity of information about roles for Pro in growth and development of the fetus and neonate, as well as a lack on new therapeutic strategies, we also investigated the action of pyruvate and creatine on the effects elicited by chronic Pro administration to female rats during pregnancy and lactation on the offspring brain. We found that Pro administration to the mothers induced oxidative stress and diminished the pyruvate kinase and creatine kinase activities in the brain of the offspring. However, co-administration of creatine plus pyruvate did not fully prevented the alterations caused by Pro administration.

Prolina (Pro) é metabolizada por suas próprias enzimas especializadas com seus próprios mecanismos de regulação e localizações teciduais e subcelulares. Foram descritos erros inatos no metabolismo da Pro em seres humanos. A Hiperprolinemia tipo II é uma doença hereditária causada por uma deficiência de Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, cuja característica bioquímica é a acumulação de Pro no plasma e tecidos causando diversos problemas, incluindo dano cerebral em alguns pacientes. Vários investigadores demonstram a Pro como uma fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) e uma relação entre uma concentração elevada de Pro e sintomas neurológicos tem sido demonstrada em pacientes com HPII. Uma vez que as mitocôndrias constituem uma fonte importante de EROs, investigou-se a geração de EROs mediada por Pro em mitocôndrias de fígado de rato. Os resultados sugeriram que uma função normal do complexo III da cadeia transportadora de elétrons (CTE) parece ser essencial para a toxicidade da Pro, enquanto que a atividade dos complexos I e IV, e presença Ca+2, aparentemente, não são necessárias. Como existe uma escassez de informações sobre as funções da Pro no crescimento e desenvolvimento do feto e recém-nascido, bem como uma falta de novas estratégias terapêuticas, também investigamos a ação do piruvato e de creatina sobre os efeitos desencadeados pela administração crônica de Pro em ratas durante a gravidez e lactação sobre o cérebro da prole. administração de Pro nas mães induziu estresse oxidativo e diminuiu as atividades da piruvato quinase e creatina quinase no cérebro da prole. No entanto, a co-administração de creatina e piruvato preveniram apenas parcialmente as alterações causadas pela administração de Pro. / Proline (Pro) is metabolized by its own specialized enzymes with their own tissue and subcellular localizations and mechanisms of regulation. Inborn errors of Pro metabolism have been described. Type II Hyperprolinemia is an inherited disorder caused by a deficiency of Δ1-pyrroline- 5-carboxilic acid dehydrogenase, whose biochemical hallmark is Pro accumulation in plasma and tissues causing several problems including cerebral damage in some affected patients. Several investigators have shown that Pro is a source of reactive oxygen species (ROS) and a relationship between a high concentration of Pro and neurological symptoms has been demonstrated in patients with HPII. Since mitochondria constitute a major source of ROS, we investigated the generation of Pro-mediated ROS by Pro in rat liver mitochondria. We found that a normal function of complex III of the electron transport chain (ETC) seems to be essential for Pro toxicity, whereas activity of complexes I and IV and Ca+2 presence apparently are not required. Because there is a paucity of information about roles for Pro in growth and development of the fetus and neonate, as well as a lack on new therapeutic strategies, we also investigated the action of pyruvate and creatine on the effects elicited by chronic Pro administration to female rats during pregnancy and lactation on the offspring brain. We found that Pro administration to the mothers induced oxidative stress and diminished the pyruvate kinase and creatine kinase activities in the brain of the offspring. However, co-administration of creatine plus pyruvate did not fully prevented the alterations caused by Pro administration.

Foi demonstrado que a L-prolina é fundamental para o metabolismo das formas intracelulares de T.cruzi e está envolvida em processos de resistência a diferentes condições de estresse. O ácido L-tiazolidina-4-carboxílico (T4C) age como inibidor competitivo do transporte de prolina para o interior do parasita, desta forma, pode-se assumir que, quando aplicado como agente terapêutico simula uma situação de hipoprolinemia no hospedeiro mamífero. Sobre esta base, propomos que a prolinemia poderia estar relacionada com a severidade da infecção pelo T. cruzi, portanto, decidimos inverter o racional e obter nesse trabalho um modelo de hiperprolinemia. Inicialmente foi estabelecido um modelo murino de hiperprolinemia transiente. Camundongos da linhagem BALB/c que foram tratados com prolina, por via intraperitonial (i.p), em 30 minutos já apresentaram concentrações plasmáticas de 1,359 ± 0,121 mM, porém, após 3 horas seus níveis plasmáticos retornaram ao normal, 0,4361 ± 0,03496. Utilizando este modelo, foi avaliado o efeito da hiperprolinemia transiente em camundongos infectados pelo T.cruzi. Em três ensaios de um total de seis foi observado um aumento significativo da parasitemia em camundongos tratados, sem nenhuma diferença na mortalidade e na carga parasitária de diversos tecidos. Essa inconsistência observada no perfil da parasitemia redirecionou os experimentos para um modelo de hiperprolinemia hereditário previamente estabelecido. Interessantemente, foram observados diminuições na parasitemia, porém, a mortalidade foi aumentada. Foi hipotetizado que, diferentemente do que acontece com a hiperprolinemia transiente, com os níveis plasmáticos aumentados de maneira estável, as formas intracelulares de T.cruzi teriam acesso ao aminoácido em quantidades e tempo maiores. No entanto, não se pode descartar como hipótese complementar, que a hiperprolinemia possa afetar a resposta imune e por sua vez, imunossuprimir ou imunoestimular o hospedeiro mamífero. Por esse motivo, avaliaram-se alguns parâmetros da resposta imune ex vivo. Ensaios ex vivo mostraram que tratamento com prolina diminui a produção de NO sob ativação por LPS, no entanto quando células peritoneais não ativadas por LPS são infectadas por T. cruzi, o tratamento com prolina não altera o perfil de NO. A expressão gênica da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) das células peritoneais diminui quando elas são cultivadas na presença de prolina, confirmando esses resultados. Mostrou-se dessa maneira que a hiperprolinemia pode interferir com a resposta imune do hospedeiro, o que levaria a uma eventual imunossupressão. Observou-se que, tanto células peritoneais infectadas como não infectados tratadas com prolina apresentam redução de seu volume celular o que poderia ser indício de sinal apoptótico. Ensaios de infecção (ex vivo) em células peritoneais de camundongos BALB/c com tripomastigotas da cepa MJL superexpressando o transportador de prolina apresentaram aumento da taxa de infecção enquanto que as infectadas por tripomastigotas da cepa Y superexpressando o mesmo transportador de prolina apresentaram diminuição da taxa de infeçção, quando comparadas aos controles, mostrando que a reposta de redução ou aumento da taxa de infecção ao tratamento com prolina é determinada também pela cepa de T. cruzi. Análises da prolinemia em soro de pacientes com sintomas de cardiopatia chagásica severa mostraram menores níveis de prolina sérica quando comparados aos controles (pacientes não infectados). Juntos, todos esses resultados colocam a prolina como um fator de severidade na infecção pelo T. cruzi. / It was shown that L-proline is essential for the metabolism of the intracellular forms of T. cruzi and is involved in resistance to different stress conditions. L-thiazolidine-4-carboxylic acid (T4C) acts as a competitive inhibitor of the proline transport to the inside of parasite, thus it can be assumed that when T4C is applied as a therapeutic agent simulates a hipoprolinemia situation in the mammalian host. On this basis, we propose that prolinemia could be related to the severity of T. cruzi infection, then, in this work we decided to reverse the rational and obtain a hyperprolinemia model. As a starting point, it was established a mouse transient hyperprolinemia model. BALB/c mice were intraperitoneally injected with proline showed an increased proline levels in sera after 30 min (1,359 ± 0,121 mM). However, these increased levels were diminished to normal levels after 3 h (0,4361 ± 0,03496 mM). Once established this model, was initially used to evaluate the effect of transient hyperprolinemia in mice infected by T.cruzi. In three out of six experiments an increase in parasitemia but not in mortality or in tissue parasite loads was observed. In the remaining three experiments no differences were detected. These inconsistencies directed the work to the search to a previously established hereditary model of mouse hyperprolinemia model. Interestingly, in this new model, a diminished parasitemia was recorded, however, mortality was higher. From this information it was hypothesized that, differently to what happens in the transient hyperprolinemia, a permanent hyperprolinemia exposes the T. cruzi infected cells (and so, the intracellular parasites) to higher concentrations of proline as well as for longer times. In addition, it cannot be disregarded the complementary hypothesis that hyperprolinemia could be affecting the immune response and, at the same time of its action on the parasite, it could be immunosupresing or immunostimulating the mammalian host. This possibility led us to evaluate some parameters of the immune response both, in vivo and ex vivo. Ex vivo assays showed that proline-treated LPS-activated peritoneal cells had a diminished production of NO while proline-treatment of T. cruzi infected, non-LPS-activated peritoneal cells did not affect their NO production. This data showed that hyperprolinemia could interfer the immune response leading the host to an eventual immunosupresion. In addition, both, infected and non-infected macrophages had their cellular volume diminished when treated with proline, which could be attributed to the iniciation of an apoptotic process. Infection assays (ex vivo) of perioneal cells from BALB/c mice with MJL strain trypomastigotes overexpressing a proline transporter had an increased infection rate, while the same type of cells infected with Y strain trypomastigotes overexpressing the same proline transporter showed a diminution in the infection rate. These results show that changes in the infection rate as a function of intracellular proline availability depends on T. cruzi strain. The analysis of prolinemia in patients serum with symptoms of Severe Chronic Chagasic Cardiopathy showed tat proline levels were diminished in comparison to control (non-infected patients). Taken together, these results prompt proline as a factor modulating the severity of T. cruzi infection.

As hiperprolinemias são doenças causadas por altas concentrações de prolina no plasma e tecidos, que podem apresentar diversas manisfestações clínicas em crianças, dentre elas neurológicas. Considerado que essas mesmas crianças estão frequentemente expostas a diversos tipos de infecções, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da administração crônica de prolina sozinha e quando administrada concomitantemente a um lipopolissacarídeo altamente utilizado para induzir inflamação sistêmica e no sistema nervoso central. Para isso analisamos alguns parâmetros de estresse oxidativo, a atividade de algumas enzimas da rede de fosforiltransferência e a atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial. Os animais foram divididos em quatro grupos (salina, prolina, lipopolissacarídeo e prolina+lipopolissacarídeo) e a administração consistiu em 2 doses diárias, do 7º ao 21º dia de vida. Todos os animais foram eutanasiados no 22º dia de vida por decapitação sem anestesia e córtex cerebral e cerebelo foram removidos para análise. A administração de prolina sozinha não alterou nenhum dos parâmetros analisados. Enquanto a administração de lipopolissacarídeo foi capaz de aumentar a conteúdo de S100B e da proteína ácida fibrilar glial, os conteúdos das substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico e sulfidrilas e a atividade da catalase em ambos os tecidos. Além disso, aumentou a atividade da adenilato cinase e a atividade da creatina cinase mitocondrial, tanto no córtex cerebral quanto no cerebelo. Além disso, a isoforma citosólica da creatina aumentou somente no córtex cerebral. A atividade da hexocinase diminuiu em ambos os tecidos. Em adição a isso, o lipopolissacarídeo diminuiu a atividade dos complexos IV e succinato desidrogenase da cadeia respiratória mitocondrial. Em contrapartida a administração de prolina+lipopolissacarídeo preveniu os efeitos causados pelo lipopolissacarídeo em todos os parâmetros nos dois tecidos. Caso esses efeitos sejam confirmados em humanos a prolina poderia ser utilizada como um agente anti-inflamatório e antioxidante associado a terapias destinadas a doenças neurológicas envolvendo inflamação. / Hyperrpolinemias are diseases caused by high concentrations of proline in plasma and tissues that may present several clinical manifestations in children, among them neurological. Whereas these same children are often exposed to various types of infections the objective the present study was to evaluate the effects of chronic proline administration alone, in cerebral cortex and cerebellum, and when administered concomitantly to a lipopolysaccharide highly used to induce systemic and central neurvous system inflammation. For this we analyze some parameters of oxidative stress, the activity of some enzymes of the phosphoryltransfer network and the activity of the mitochondrial respiratory chain enzime complexes. Animals were divided into 4 groups: control, saline proline, lipopolisaccharide and lipopolisaccharide plus proline. Administration consisted of 2 daily doses from 7º to 21º day of life. All animals were euthanized at 22 days of age by decapitation without anesthesia and the brain cortex and cerebellum were removed for chemical determinations. The administration of alone proline did not alter any of the analyzed parameters. While the administration of lipopolisaccharide was able to increase content of S100B and the GFAP, content of the thiobarbituric acid reactive substances of and sulfhydril and activity of catalase in both tissues. Besides that, lipopolisaccharide increased adenilate kinase activity and mitochondrial creatine kinase in cerebral cortex and cerebellum. However, cytosolic isoform of creatine increased only in cerebral cortex. Hexokinase activity decreased in both tissues. In addition to this, lipopolisaccharide administration decreased complexes IV and succinate dehydrogenase activities of mitochondrial respiratory chain. In contrast, administration of proline+lipopolisaccharide prevent effects caused by the lipopolisaccharide in all parameters, in both tissues. If these proline effects were confirmed in humans, it would be a powerful antioxidant and anti-inflammatory agent associated with therapies for neurological disease involving inflammation.