Bien que la protéomique ait été largement appliquée pour l’étude du plasma humain, son application dans le domaine de la transfusion sanguine reste peu employée. En collaboration avec l’EFS, l’objectif de cette thèse a donc été de proposer des outils analytiques destinés à évaluer l’impact des traitements d’inactivation des agents pathogènes et des conditions de stockage sur les protéines plasmatiques. Le traitement au bleu de méthylène est le traitement d’inactivation virale le plus utilisé en France. Une approche globale et ciblée se sont intéressées aux modifications induites par ce traitement photochimique. Plusieurs modifications, notamment sur les sous-unités du fibrinogène, ont pu être identifiées, après analyse nanoLC-nanoESI-Qh-FT-ICR MS. L’origine de la diminution d’activité du fibrinogène a pu ainsi être expliquée. Une étude thermique a permis d’identifier un marqueur de dégradation plasmatique: la RBP4. Dans le plasma, elle forme un complexe avec la transthyrétine. Lors de la dégradation du plasma, ce complexe se dissocie. Une méthode de quantification absolue, basée sur des peptides AQUA, a été développée permettant de doser RPB4 libérée dans le plasma au cours de la conservation du plasma. Enfin, deux matrices innovantes pour l’électrophorèse sur gel ont été évaluées pour la séparation de protéines plasmatiques. L’une incorpore un polymère préformé, le dextran, à une solution d’acrylamide classique. L’autre fait appel à un polymère hydrophile, le NAT. Toutes deux présentent de bonnes propriétés optiques et mécaniques, augmentent significativement la résolution des spots protéiques et facilitent l’identification des protéines par MS. / Proteomics has been widely applied to study plasmatic proteins; its application to the field of transfusion medicine is s quite recent. In partnership with the French blood agency (EFS), the main objective of the Ph.D work was to provide analytical tools to evaluate the impact of pathogen inactivation treatments and storage conditions on plasmatic proteins. Photochemical treatment using methylene-blue is the most used for pathogen inactivation in France. Both a global and targeted studies were carried to determine the proteins modifications involved by this treatment. Based on nanoLC-nanoESI-Qh-FT-ICR MS analyses, several modifications were pointed out, especially targeting the sub-unit of fibrinogen. This allows the decrease in fibrinogen clottability after methylene-blue treatment to be explained.A study of thermal degradation on plasma sample pointed out a new marker of plasma degradation: the RBP4. It circulates associated to with transthyretin as a macromolecular complex: during degradation, this complex dissociates releasing RBP4 in plasma. An absolute quantification method was developed using AQUA peptides to assay the amount of the free form of RBP4 in plasma during storage.Two innovative matrices for gel electrophoresis were developed and evaluated for plasma protein separation. One of them relies on the use on a preformed polymer incorporated prior to acrylamide polymerization. The other one is based on a hydroxylated acrylamide monomer, the N-acryol-tris(hydroxymethyl)-amino methane. Both exhibited interesting optical and mechanical properties, enhanced spot resolution and outstanding protein/peptide recovery, which facilitates protein identification by MS.

La sténose aortique (SA) est actuellement la maladie valvulaire la plus commune et sa prévalence est en constante augmentation dans les pays occidentaux. Elle consiste en une rigidification des feuillets de la valve aortique, qui peut évoluer en calcification dans le stade le plus avancé de la maladie, entrainant ainsi un rétrécissement de l'ouverture de la valve et une obstruction du flux sanguin du ventricule gauche vers l'aorte. À ce jour, aucun traitement pharmacologique n' existe pour le traitement ou la prévention de cette maladie. La seule option reste le remplacement de la valve aortique calcifiée par une prothèse (mécanique ou biologique). La lipoprotéine(a) [Lp(a)] a été identifiée comme principal facteur de risque de de la SA. Cette lipoprotéine est constituée d'une particule de type développement lipoprotéine de faible densité (LDL) reliée à une partie protéique, l'apolipoprotéine(a) [apo(a)]. L'apo(a) est composée de domaines kringles (KIV₁₋₁₀ et KV), tous présents e n un unique exemplaire excepté le KIV₂ qui peut être présent en de multiples copies, dont le nombre est principalement déterminé génétiquement. Ce nombre de KIV₂ génère des isoformes d'apo(a) de différentes tailles. Il a été démontré génétiquement que la taille de l'apo(a) est inversement proportionnelle à la concentration plasmatique en Lp(a), et au risque conféré par ces concentrations. Certains domaines kringles de la Lp(a) possèdent des sites de liaison à la lysine, qui pourraient lui permettre de se lier à des protéines. La Lp(a) étant constituée d'une particule de type LDL, elle en possède les caractéristiques athérogènes. Néanmoins, elle est encore plus athérogène et ce potentiel délétère pourrait être lié à la présence de protéines sur son apo(a). Ainsi, l'objectif principal de cette thèse était de caractériser le protéome de la Lp(a) et d'investiguer son association avec la SA. Dans un premier temps, nous avons ainsi étudié le protéome de la Lp(a) en utilisant une méthode non ciblée pour identifier de façon non biaisée les protéines qui la rendent plus athérogène que les LDL d'une part, et expliquant son rôle dans le développement de la SA d'autre part. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'association de la Lp(a) avec une enzyme, l'autotaxine (ATX). En effet, des travaux ont récemment démontré que l' ATX était transportée par la Lp(a) au sein de la valve aortique dans la SA, mais également que son activité plasmatique était augmentée dans le cadre de cette pathologie dans une étude épidémiologique. Cette enzyme, principalement sécrétée par le tissu adipeux, est à l'origine de la formation de l'acide lysophosphatidique (LysoPA), qui est impliqué dans des processus pro-inflammatoires, menant, entre autres, à la calcification de la valve aortique. En utilisant des analyses protéomiques en label free , nous avons pu identifier 15 protéines préférentiellement associées à la Lp(a) comparativement aux LDL, dont certaines semblaient être impliquées dans des mécanismes athérogènes. Dans une étude de randomisation mendélienne, nous avons démontré qu'une exposition à des concentrations élevées en Lp(a) avait des effets mineurs sur le protéome plasmatique. Une seconde étude de protéomique a révélé des différences potentielles entre Lp(a) de sujets avec et sans SA qui pourraient expliquer pourquoi certaines personnes avec Lp(a) élevée ne développent pas de SA. De plus, une étude transcriptomique sur des valves calcifiées explantées a démontré qu'un gène était potentiellement différentiellement exprimé en présence vs en absence de Lp(a), suggérant ainsi différents mécanismes. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à l'ATX, et avons confirmé son association avec la Lp(a), via sa partie apo(a). La mesure du complexe ATX-Apo(a) permettait également de mieux prédire le développement de la SA, et donc pourrait être utilisée comme potentiel nouveau biomarqueur. Enfin, nous avons investigué l'impact de la chirurgie bariatrique sur les concentrations plasmatiques de l'ATX et avons démontré une diminution de cette enzyme après ce type de chirurgie. Cette dernière étude ouvre la porte à l'hypothèse selon laquelle une intervention visant à réduire les niveaux d'une des protéines associées à la Lp(a) pourrait avoir un potentiel thérapeutique. Ces travaux nous ont permis de mieux caractériser le protéome de la Lp(a) et d'identifier de potentiels nouveaux biomarqueurs de la SA, ce qui pourrait aider à mieux cibler les sujets dont le protéome est plus « à risque » et qui bénéficieraient le plus d'un traitement ciblant la Lp(a). / Calcific aortic valve stenosis (CAVS) is currently the most common valvular disease, and its prevalence, over the years, is increasing in developed countries. CAVS is first characterized by valve leaflet thickening which may lead to calcification at the most advanced phase of the disease. This leads to blood flow obstruction from the left ventricle to the aorta. There is currently no pharmacological treatment or prevention for this disease, the only therapeutic option being the aortic valve replacement by a prosthesis (biological or mechanical). Lp(a) as been identified as the main risk factor for the development of CAVS. Lp(a) is an LDL-like particle bound to a protein part, apo(a). Apo(a) is composed of different kringle domains (KIV₁₋₁₀ and KV), all present once except for KIV₂ which can be present in several copies (mainly genetically determined), generating different size isoforms. Apo(a) siz e is inversely proportional to Lp(a) levels and to the Lp(a) attributable risk. As LDL is a part of Lp(a), Lp(a) has all its atherogenic properties, but has more deleterious effects, potentially linked to apo(a). Indeed, kringles in apo(a) have lysine binding sites that could link different proteins. The first objective of this study was to investigate the Lp(a) proteome to see if Lp(a) carries proteins involved in atherosclerotic pathways, and if Lp(a) proteome could help explain the development of CAVS in subjects with high Lp(a). For this purpose, we isolated and compared Lp(a) and LDL proteome from healthy subjects and Lp(a) from healthy and CAVS patients. Using label free mass spectrometry analysis, we identified 15 proteins preferentially associated with Lp(a) compared to LDL. These proteins appear to be involved in pro inflammatory or pro atherosclerotic mechanisms. Additional genetic analysis shows that lifelong exposure to Lp(a) did not influence the plasma proteome. The second proteomic study found 9 proteins potentially associated with the Lp(a) of CAVS subjects, and 3 with the Lp(a) of controls. A transcriptomic analysis on explanted calcified aortic valves revealed one gene potentially differently regulated according to Lp(a) levels, and different pathways influenced by these different concentrations. To complete our untargeted proteomic analysis, we chose to study autotaxin, for which the link with Lp(a) and CAVS has already been demonstrated. Recent work has suggested that ATX was transported by Lp(a) into the aortic valve in CAVS, and its activity was also increased in CAVS. ATX is mainly secreted by adipose tissue and is a key enzyme for the formation of lysophosphatidic acid, which is involved in pro inflammatory processes which can lead to aortic valve calcification. Our initial study allowed us to confirm the association between Lp(a) and ATX, via apo(a). Moreover, ATX-Apo(a) levels seemed to predict CAVS, and thus could be used as a new biomarker. Finally, we studied the effect of bariatric surgery on ATX levels and showed a decreased of ATX levels after surgery. To conclude, the study of the Lp(a) proteome could provide new biomarkers and potential therapeutic targets for CAVS and could help targeting subjects with a more deleterious Lp(a) proteome. Moreover, interventions leading to a decrease in Lp(a) associated proteins could lead to a decrease of Lp(a) associated risk of disease.

De nos jours, l’augmentation du volume des données de séquençage est bien plus forte que celle de notre capacité à analyser ces données. En lien avec ce déluge de données et le besoin urgent de nouveaux outils bioinformatiques pour les analyser, notre travail consiste à développer de nouveaux algorithmes pour mieux comprendre les relations entre séquence, structure, et fonction des protéines. Les protéines contiennent de larges portions de séquences périodiques, qui forment des motifs d’acides aminés répétés les uns à la suite des autres que l’on appelle des répétitions en tandem. Elles se retrouvent dans 14% des protéines. De nombreuses études ont montré leur importance fonctionnelle ainsi que leur implication dans de nombreuses maladies humaines, notamment le cancer. Ici, nous montrons l’importance d’adopter une approche incluant plusieurs outils de détection de répétition en tandem afin de s’assurer d’obtenir le jeu de données le plus complet. Nous avons ainsi réalisé un pipeline approprié, et développé deux outils spécifiques : un filtre, pour gagner en rapidité, et un score, pour sélectionner les répétitions les plus pertinentes dans les régions structurées des protéines. Enfin, nous avons utilisé ce pipeline sur une sélection de 94 protéomes. Cette analyse a permis de mettre à jour le précédent recensement des répétitions, montrant que 64% des protéines contenaient des répétitions en tandem. Elle a également permis de mieux comprendre les répétions en tandem dans leurs caractéristiques, leurs compositions et leurs implications dans les maladies humaines. / Today, the growth of protein sequencing data significantly exceeds the growth of capacities to analyze these data. In line with this data deluge and urgent needs in new bioinformatics tools our work deals with the development of new algorithms to better understand the sequence-structure-function relationship. Proteins contain a large portion of periodic sequences representing arrays of repeats that are directly adjacent to each other, so called tandem repeats (TRs). TRs occur at least in 14% of all proteins. Highly divergent, they range from a single amino acid repetition to domains of 100 or more repeated residues. Numerous studies demonstrated the fundamental functional importance of such TRs and their involvement in human diseases, especially cancers. Here we show the importance of integrating several TR detectors to get the most complete set of TRs in proteomes. We designed an appropriate pipeline and developed a filter to speed the process as well as a new scoring module to select relevant structured TRs. In addition, we undertook a large scale analysis of TRs in 94 proteomes. This large scale analysis allowed us to update previous census of TR showing that TRs occurs in 64% of all proteins and leads to a better understanding of TR in terms of their characteristics, composition and implication in human disease.

La bactérie Bacillus subtilis est considérée comme une solution alternative aux pesticides conventionnels pour la gestion des agents phytopathogènes. Les mécanismes de biocontrôle de cette bactérie sont multiples et reposent fortement sur la production de lipopeptides. A l'heure actuelle, l'influence des mycètes/oomycètes phytopathogènes sur la physiologie et les mécanismes de biocontrôle de B. subtilis est peu connue. L'objectif de ce projet de doctorat était d'étudier chez B. subtilis l'influence de différents mycètes/oomycètes phytopathogènes sur les mécanismes de biocontrôle et plus particulièrement sur la production de lipopeptides. Dans un premier temps, les lipopeptides produits par B. subtilis PTB185 ont été caractérisés par spectrométrie de masse et une méthode permettant leur quantification relative a été développée à l'aide d'un MALDI-TOF. Cette première étape a permis de montrer que la souche PTB185 produit de la surfactine, de l'iturine et de la fengycine. Les essais de confrontation sur gélose ont montré que l'activité antagoniste et la production de lipopeptides par B. subtilis variaient significativement (P ≤ 0.05) selon l'agent pathogène testé. Aucune corrélation entre la production de lipopeptides et l'activité antimicrobienne de B. subtilis n'a toutefois été observée. Le mycélium autoclavé des agents phytopathogènes a également influencé significativement les quantités de lipopeptides produites par B. subtilis en milieu liquide. La production de fengycine et/ou d'iturine a augmenté significativement en présence du mycélium de Botrytis cinerea, Mucor sp., Pythium ultimum ou Rhizoctonia solani, alors que l'addition de mycélium n'a pas affecté de façon significative la production de surfactine, en comparaison avec le traitement témoin. Les bactéries cultivées en milieu liquide en présence du mycélium de Mucor sp. ont causé une réduction significativement plus importante de la croissance de B. cinerea, R. solani et S. sclerotiorum, comparativement aux bactéries cultivées en absence de mycélium. Ces résultats montrent pour la première fois l'influence du mycélium autoclavé des agents phytopathogènes sur l'activité antagoniste et la production de fengycine/iturine chez B. subtilis. Une étude plus approfondie de l'influence du mycélium autoclavé et des composés extracellulaires des mycètes/oomycètes phytopathogènes sur B. subtilis PTB185 a par la suite été réalisée en protéomique. Le mycélium autoclavé de tous les agents phytopathogènes testés a fortement inhibé les protéines associées au métabolisme et à la biosynthèse de la thiamine chez la bactérie. Le mycélium autoclavé de Mucor sp. a fortement stimulé les protéines associées au « phage-like element PBSX » et fortement diminué celles du métabolisme et de la biosynthèse de la biotine. Les composés extracellulaires de P. ultimum ont diminué les protéines associées à la formation des flagelles et stimulé celles associées à la production de subtilosine. Le mycélium autoclavé et les composés extracellulaires de R. solani ont augmenté de façon importante les protéines associées à la synthèse de sidérophores. Les composés extracellulaires de S. sclerotiorum ont pour leur part très faiblement impacté le protéome de la bactérie. Les résultats de cette étude, en plus de témoigner de l'influence des interactions biotiques sur la production des lipopeptides, apportent des informations supplémentaires quant à l'influence de ces dernières sur la physiologie/les mécanismes de biocontrôle de B. subtilis. Enfin, cette étude offre de nouvelles perspectives pour optimiser le milieu de culture de B. subtilis à des fins biotechnologiques. / The bacterium Bacillus subtilis is considered as a promising alternative to conventional pesticides for plant disease management. The mechanisms underlying the biocontrol properties of this bacterium are multiple and are closely related to the production of lipopeptides. Currently, little is known about the influence of plant pathogenic fungi/oomycetes on B. subtilis physiology and biocontrol mechanisms. The objective of this doctoral research project was to study the influence of fungi/oomycetes on B. subtilis biocontrol mechanisms, especially on the production of lipopeptides. In the first instance, the lipopeptides produced by B. subtilis PTB185 were characterised by mass spectrometry and a method allowing the relative quantification of these compounds was developed using MALDI-TOF instrumentation. This first step displayed the capacity of strain PTB185 to produce surfactin, iturin, and fengycin. Confrontation assays conducted on agar showed that B. subtilis antagonistic activity and production of lipopeptides vary significantly (P ≤ 0.05) according to the pathogen tested. However, no correlation between lipopeptides production and B. subtilis antimicrobial activity was observed. Autoclaved mycelia of plant pathogens were also shown to significantly influence the quantities of lipopeptides produced by B. subtilis in liquid culture. Fengycin and/or iturin were produced in significantly higher amounts in presence of mycelium of Botrytis cinerea, Mucor sp., Pythium ultimum, or Rhizoctonia solani, while addition of mycelium in the medium did not significantly affect surfactin production as compared to the control. Bacteria grown in liquid medium amended with Mucor sp. mycelium caused a significantly higher reduction of mycelial growth of B. cinerea, R. solani, and Sclerotinia sclerotiorum as compared to the bacteria grown with no mycelium. These results show for the first time the influence of autoclaved plant pathogen mycelium on B. subtilis antagonistic ability and production of fengycin/iturin. The influence of autoclaved mycelia and extracellular compounds of plant pathogenic fungi/oomycetes on B. subtilis was further investigated by proteomics. Autoclaved mycelium of all tested pathogens strongly inhibited the proteins associated with B. subtilis thiamine metabolism and biosynthesis. Autoclaved mycelium of Mucor sp. strongly increased proteins associated with the phage-like element PBSX and strongly decreased those related to biotin metabolism and biosynthesis. Extracellular compounds of P. ultimum reduced proteins associated with flagellar assembly and stimulated those related to the production of subtilosin. Autoclaved mycelium and extracellular compounds of R. solani strongly increased proteins associated with the production of siderophores. Extracellular compounds of S. sclerotiorum barely affected the proteome of the bacterium. The results of this study, besides providing additional evidence of the influence of biotic interactions on lipopeptides production, give further information on the influence of the latter on B. subtilis physiology and biocontrol mechanisms. Finally, this study provides new insights into the optimisation of the culture medium to grow B. subtilis for biotechnological applications.

La SUMOylation est une modification post-traductionnelle, réversible, qui module une variété de processus cellulaires principalement associés à des événements nucléaires. Lors d'une analyse du protéome de fractions subcellulaires de prostate, nous avons révélé plusieurs caractéristiques incluant la présence d'une quantité particulièrement abondante de peptides SUMO-1 libres. Une observation similaire a été faite dans le pancréas exocrine, un tissu également spécialisé dans une activité unique de sécrétion. À partir de ces données, qui suggèrent que les peptides SUMO jouent un rôle important dans ces tissus, nous avons identifié une série de protéines membranaires potentiellement SUMOylées. Une caractérisation approfondie de ces candidats, à l'aide d'un système de surexpression dans les cellules LNCaP, indique que les protéines ANXA1 et ANXA2 sont SUMOylabiés. Nous avons démontré par mutagénèse dirigée que la SUMOylation de l'ANXAl correspond à une multi-SUMOylation qui a lieu à la fois dans une séquence consensus, sur le résidu K257, et au niveau de la région flexible du domaine N-terminal qui ne correspond à aucune séquence consensus. Des résultats similaires ont été obtenus pour TANXA2. Nous observons que la mutation Y21F diminue de façon marquée la SUMOylation de l'ANXAl, suggérant qu'une connexion existe entre la phosphorylation dépendante de l'EGF et la SUMOylation. L'ensemble de nos résultats montre que la SUMOylation est impliquée dans la régulation des fonctions de ANXA1 et ANXA2 et suggère la présence de mécanismes qui coordonnent le trafic membranaire dans les voies de l'exocytose et de l'endocytose.