Les os, qui sont à la fois résistants et légers, assurent des fonctions mécaniques, structurales et métaboliques. Afin d'assurer ces fonctions, les os sont soumis à un remodelage continuel qui implique la destruction (résorption), puis la formation d'un nouveau tissu osseux calcifié. Ce processus se produit par l'intermédiaire de cellules spécialisées : les ostéoclastes assurant la résorption osseuse et les ostéoblastes responsables de la formation de nouveau tissu osseux. Ainsi, un déséquilibre entre ces deux processus mène, dans bien des cas, à l'ostéoporose qui est une pathologie caractérisée par une faible densité minérale des os et également par une baisse de la masse osseuse. Récemment, différentes études ont permis de démontrer que les lipoprotéines sont impliquées dans le maintien de l'intégrité osseuse. En effet, il a été démontré que les chylomicrons permettent de réguler la formation osseuse en assurant l'acheminement de la vitamine K aux ostéoblastes. Le transfert de cette vitamine se fait par un processus de captation globale qui consiste en la prise de la lipoprotéine en son entier, contrairement à la captation sélective où seulement les esters de cholestérol (EC) de la lipoprotéine sont transférés à la cellule. Ce processus de prise sélective est surtout attribué au récepteur scavenger de classe B (SR-B). Cette famille inclut les récepteurs scavenger de classe B et de type l et II (SR-BI et SR-BII) ainsi que le cluster of differenciation-36 (CD36). Ces récepteurs ont la capacité de prendre de façon sélective les EC contenus dans les lipoprotéines de faible et de haute densité (respectivement les LDL et HDL). Cependant, l'expression de ces récepteurs et le rôle des LDL et HDL dans les fonctions ostéoblastiques demeurent à ce jour inexplorés, malgré le fait que ce sont deux classes de lipoprotéines abondantes chez l'humain et qui sont en plus reconnues pour transporter de l'oestrogène, une hormone impliquée dans l'activité de formation osseuse des ostéoblastes. Ainsi, ce projet de doctorat visait d'une part à déterminer si les LDL et les HDL ont la capacité d'acheminer du cholestérol et de l'oestrogène aux cellules ostéoblastiques et par conséquent, de déterminer également l'identité des récepteurs de lipoprotéines impliqués dans ce métabolisme. Pour ce faire, les lipoprotéines ont été marquées au niveau de leur partie protéique et lipidique et des essais d'association, de dégradation et de compétition ont été réalisés. Les résultats obtenus montrent que les ostéoblastes captent le cholestérol contenu dans les LDL et les HDL. De plus, nous avons démontré que cette prise du cholestérol peut se faire autant par captation globale que par captation sélective. En accord avec la présence de ce dernier mécanisme, nous avons démontré que les cellules ostéoblastiques expriment les récepteurs reconnus pour faire de la captation sélective, soit le SR-BI, le SR-BII et le CD36, et que ces derniers sont impliqués dans la captation sélective faite à partir des LDL et des HDL. Nous avons également démontré, par l'incorporation d'estradiol marquée radioactivement dans les LDL et les HDL, que ces lipoprotéines peuvent transférer de manière sélective l'oestrogène qu'elles contiennent par un processus impliquant aussi les SR-B. Il a aussi été démontré que les lipoprotéines sont impliquées dans le développement de l'ostéoporose, puisqu'une corrélation positive entre l'ostéoporose et l'athérosclérose a été démontrée par des études épidémiologiques et génétiques ainsi que par des études faites chez la souris. Étant donné que la progression des maladies cardiovasculaires est directement reliée au niveau des LDL en circulation, et que ces lipoprotéines deviennent pro-athérogéniques suite à une modification oxydative, les LDL oxydées (LDLOx) ainsi générées constituent un facteur qui pourrait être responsable du développement parallèle de l'athérosclérose et de l'ostéoporose. D'ailleurs, il a été démontré que la différenciation ostéoblastique est inhibée lorsque les ostéoblastes sont exposés à des LDLOx. Ainsi, le présent projet visait également à caractériser l'impact du métabolisme ostéoblastique des LDLOx sur la viabilité des ostéoblastes. Les résultats obtenus suite à des essais de transformation mitochondriale du jaune de tétrazolium (MTT) et des expériences d'incorporation de thymidine indiquent que les LDLOx induisent la prolifération des cellules ostéoblastiques lorsqu'elles sont présentes à de faibles concentrations. Cependant, à de fortes concentrations, les LDLOx induisent plutôt l'apoptose des ostéoblastes, puisqu'il y a une externalisation de la phosphatidylsérine et de la fragmentation d'ADN. De plus, nous avons montré que cet effet apoptotique provient d'une incapacité des ostéoblastes à effectuer le métabolisme des LDLOx. En effet, les LDLOx sont faiblement dégradées par les ostéoblastes, ce qui entraîne une accumulation Iysosomale telle que démontrée par la perte d'intégrité de la membrane des lysosomes. Cette perméabilisation lysosomale est responsable de l'induction de l'apoptose, puisque la présence de chloroquine (agent inhibant l'activité lysosomale) accentue la mort des ostéoblastes. De plus, puisque certaines études ont démontré l'existence d'une corrélation positive entre les niveaux de HDL en circulation et la densité osseuse, nous avons tenté d'établir si cet effet pouvait provenir d'une inhibition des effets toxiques des LDLOx, telle que rapportée au niveau cardio-vasculaire. Les résultats obtenus montrent que les HDL inhibent l'apoptose induite par les LDLOx. Cet effet protecteur est dû à la capacité des HDL d'empêcher l'association des LDLOx aux ostéoblastes. De plus, nous avons montré que les HDL ont la capacité de moduler le métabolisme des LDLOx et ainsi d'empêcher la mort induite pas les LDLOx. En effet, l'exposition des ostéoblastes à des HDL résulte en une hausse de l'expression du SR-BI. Ce changement dans l'expression de ce récepteur entraîne une diminution de l'association protéique des LDLOx et aussi une hausse de la captation sélective faite à partir de ces lipoprotéines modifiées. Ces effets résultent en une préservation de l'intégrité Iysosomale qui est perdue en présence de LDLOx. Ainsi, ces données suggèrent l'importance de maintenir des niveaux de HDL élevés afin de prévenir la mort des ostéoblastes exposés à des conditions athérogéniques.

La sténose aortique (SA) est actuellement la maladie valvulaire la plus commune et sa prévalence est en constante augmentation dans les pays occidentaux. Elle consiste en une rigidification des feuillets de la valve aortique, qui peut évoluer en calcification dans le stade le plus avancé de la maladie, entrainant ainsi un rétrécissement de l'ouverture de la valve et une obstruction du flux sanguin du ventricule gauche vers l'aorte. À ce jour, aucun traitement pharmacologique n' existe pour le traitement ou la prévention de cette maladie. La seule option reste le remplacement de la valve aortique calcifiée par une prothèse (mécanique ou biologique). La lipoprotéine(a) [Lp(a)] a été identifiée comme principal facteur de risque de de la SA. Cette lipoprotéine est constituée d'une particule de type développement lipoprotéine de faible densité (LDL) reliée à une partie protéique, l'apolipoprotéine(a) [apo(a)]. L'apo(a) est composée de domaines kringles (KIV₁₋₁₀ et KV), tous présents e n un unique exemplaire excepté le KIV₂ qui peut être présent en de multiples copies, dont le nombre est principalement déterminé génétiquement. Ce nombre de KIV₂ génère des isoformes d'apo(a) de différentes tailles. Il a été démontré génétiquement que la taille de l'apo(a) est inversement proportionnelle à la concentration plasmatique en Lp(a), et au risque conféré par ces concentrations. Certains domaines kringles de la Lp(a) possèdent des sites de liaison à la lysine, qui pourraient lui permettre de se lier à des protéines. La Lp(a) étant constituée d'une particule de type LDL, elle en possède les caractéristiques athérogènes. Néanmoins, elle est encore plus athérogène et ce potentiel délétère pourrait être lié à la présence de protéines sur son apo(a). Ainsi, l'objectif principal de cette thèse était de caractériser le protéome de la Lp(a) et d'investiguer son association avec la SA. Dans un premier temps, nous avons ainsi étudié le protéome de la Lp(a) en utilisant une méthode non ciblée pour identifier de façon non biaisée les protéines qui la rendent plus athérogène que les LDL d'une part, et expliquant son rôle dans le développement de la SA d'autre part. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'association de la Lp(a) avec une enzyme, l'autotaxine (ATX). En effet, des travaux ont récemment démontré que l' ATX était transportée par la Lp(a) au sein de la valve aortique dans la SA, mais également que son activité plasmatique était augmentée dans le cadre de cette pathologie dans une étude épidémiologique. Cette enzyme, principalement sécrétée par le tissu adipeux, est à l'origine de la formation de l'acide lysophosphatidique (LysoPA), qui est impliqué dans des processus pro-inflammatoires, menant, entre autres, à la calcification de la valve aortique. En utilisant des analyses protéomiques en label free , nous avons pu identifier 15 protéines préférentiellement associées à la Lp(a) comparativement aux LDL, dont certaines semblaient être impliquées dans des mécanismes athérogènes. Dans une étude de randomisation mendélienne, nous avons démontré qu'une exposition à des concentrations élevées en Lp(a) avait des effets mineurs sur le protéome plasmatique. Une seconde étude de protéomique a révélé des différences potentielles entre Lp(a) de sujets avec et sans SA qui pourraient expliquer pourquoi certaines personnes avec Lp(a) élevée ne développent pas de SA. De plus, une étude transcriptomique sur des valves calcifiées explantées a démontré qu'un gène était potentiellement différentiellement exprimé en présence vs en absence de Lp(a), suggérant ainsi différents mécanismes. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à l'ATX, et avons confirmé son association avec la Lp(a), via sa partie apo(a). La mesure du complexe ATX-Apo(a) permettait également de mieux prédire le développement de la SA, et donc pourrait être utilisée comme potentiel nouveau biomarqueur. Enfin, nous avons investigué l'impact de la chirurgie bariatrique sur les concentrations plasmatiques de l'ATX et avons démontré une diminution de cette enzyme après ce type de chirurgie. Cette dernière étude ouvre la porte à l'hypothèse selon laquelle une intervention visant à réduire les niveaux d'une des protéines associées à la Lp(a) pourrait avoir un potentiel thérapeutique. Ces travaux nous ont permis de mieux caractériser le protéome de la Lp(a) et d'identifier de potentiels nouveaux biomarqueurs de la SA, ce qui pourrait aider à mieux cibler les sujets dont le protéome est plus « à risque » et qui bénéficieraient le plus d'un traitement ciblant la Lp(a). / Calcific aortic valve stenosis (CAVS) is currently the most common valvular disease, and its prevalence, over the years, is increasing in developed countries. CAVS is first characterized by valve leaflet thickening which may lead to calcification at the most advanced phase of the disease. This leads to blood flow obstruction from the left ventricle to the aorta. There is currently no pharmacological treatment or prevention for this disease, the only therapeutic option being the aortic valve replacement by a prosthesis (biological or mechanical). Lp(a) as been identified as the main risk factor for the development of CAVS. Lp(a) is an LDL-like particle bound to a protein part, apo(a). Apo(a) is composed of different kringle domains (KIV₁₋₁₀ and KV), all present once except for KIV₂ which can be present in several copies (mainly genetically determined), generating different size isoforms. Apo(a) siz e is inversely proportional to Lp(a) levels and to the Lp(a) attributable risk. As LDL is a part of Lp(a), Lp(a) has all its atherogenic properties, but has more deleterious effects, potentially linked to apo(a). Indeed, kringles in apo(a) have lysine binding sites that could link different proteins. The first objective of this study was to investigate the Lp(a) proteome to see if Lp(a) carries proteins involved in atherosclerotic pathways, and if Lp(a) proteome could help explain the development of CAVS in subjects with high Lp(a). For this purpose, we isolated and compared Lp(a) and LDL proteome from healthy subjects and Lp(a) from healthy and CAVS patients. Using label free mass spectrometry analysis, we identified 15 proteins preferentially associated with Lp(a) compared to LDL. These proteins appear to be involved in pro inflammatory or pro atherosclerotic mechanisms. Additional genetic analysis shows that lifelong exposure to Lp(a) did not influence the plasma proteome. The second proteomic study found 9 proteins potentially associated with the Lp(a) of CAVS subjects, and 3 with the Lp(a) of controls. A transcriptomic analysis on explanted calcified aortic valves revealed one gene potentially differently regulated according to Lp(a) levels, and different pathways influenced by these different concentrations. To complete our untargeted proteomic analysis, we chose to study autotaxin, for which the link with Lp(a) and CAVS has already been demonstrated. Recent work has suggested that ATX was transported by Lp(a) into the aortic valve in CAVS, and its activity was also increased in CAVS. ATX is mainly secreted by adipose tissue and is a key enzyme for the formation of lysophosphatidic acid, which is involved in pro inflammatory processes which can lead to aortic valve calcification. Our initial study allowed us to confirm the association between Lp(a) and ATX, via apo(a). Moreover, ATX-Apo(a) levels seemed to predict CAVS, and thus could be used as a new biomarker. Finally, we studied the effect of bariatric surgery on ATX levels and showed a decreased of ATX levels after surgery. To conclude, the study of the Lp(a) proteome could provide new biomarkers and potential therapeutic targets for CAVS and could help targeting subjects with a more deleterious Lp(a) proteome. Moreover, interventions leading to a decrease in Lp(a) associated proteins could lead to a decrease of Lp(a) associated risk of disease.

La sténose aortique (SA) est la maladie valvulaire la plus fréquente dans notre société. Elle est caractérisée par un remodelage fibrocalcique conduisant à une obstruction progressive du flux sanguin. La lipoprotéine(a) (Lp[a]), une lipoprotéine similaire à la lipoprotéine de faible densité, est un facteur de risque génétique fortement associé à la SA. Malheureusement, les concentrations plasmatiques de Lp(a) sont très peu influencées par des facteurs extrinsèques, tels qu’un régime alimentaire ou une médication hypolipidémiante. Des études suggèrent que la Lp(a) serait associée aux processus de calcification dans le développement de la SA. La tomographie par émission de positons couplée à la tomographie axiale permet de détecter le processus précoce lié à calcification de la valve aortique. En effet, cette technique d’imagerie nucléaire permet d’identifier et de quantifier la microcalcification au niveau de la valve aortique, un marqueur fortement lié au développement futur de calcium. L’impact de la Lp(a) sur la microcalcification de la valve aortique n’a jamais été évalué. La mesure de la microcalcification chez des individus sans SA ayant des concentrations plus ou moins élevées de Lp(a) a été effectuée. Notre hypothèse était que les individus ayant des concentrations élevées de Lp(a) ont une microcalcification plus élevée, lorsque comparée aux individus ayant des concentrations plus faibles de Lp(a). Les résultats de cette étude ont révélé que les individus sans SA mais ayant des concentrations élevées de Lp(a) présentent une microcalcification plus importante que les individus ayant de plus faibles concentrations de Lp(a). La réalisation de ce projet de recherche nous a permis d’observer cliniquement un processus actif de calcification chez des individus avec des concentrations élevées de Lp(a), et ce, malgré l’absence clinique de la maladie, illustrant l’importance de cette lipoprotéine dans le développement de la SA. / Aortic stenosis (AS) is the most common valve disease in our society. It is characterized by fibrocalcific remodelling leading to progressive obstruction of blood flow. Lipoprotein(a) (Lp[a]), a lipoprotein similar to low-density lipoprotein, is a genetic risk factor strongly associated with AS. Plasma concentrations of Lp(a) are very little influenced by extrinsic factors, such as diet or lipid-lowering medication. Studies suggest that Lp(a) would be associated with calcification processes in the development of AS. Positron emission tomography coupled with computed tomography allows the early process related to calcification of the aortic valve to be detected. This nuclear imaging technique identifies and quantifies microcalcification at the aortic valve, a marker strongly linked to the future development of calcium. The impact of Lp(a) on aortic valve microcalcification has never been evaluated. Microcalcification measurements in individuals without AS with high or low concentrations of Lp(a) were performed. Our hypothesis was that individuals with high concentrations of Lp(a) have higher microcalcification when compared to individuals with lower concentrations of Lp(a). The results of this study revealed that individuals without AS but with high concentrations of Lp(a) have a higher microcalcification than individuals with lower concentrations of Lp(a). The completion of this research project allowed us to observe clinically an active calcification process in individuals with high concentrations of Lp(a) despite the clinical absence of the disease, illustrating the importance of this lipoprotein in the development of AS.

Les lipoprotéines sont des molécules sanguines composées de lipides et de protéines dont la fonction est de véhiculer les lipides, dont le cholestérol, vers les cellules de l'organisme. Le maintien de l'équilibre plasmatique en cholestérol est réalisé par le taux de synthèse et de captation qui peut s'effectuer principalement par deux voies. D'abord, la captation globale, est un processus d'épuration totale puisqu'elle consiste en la prise et la dégradation complète des lipoprotéines. Dans le cas des lipoprotéines à apoprotéine B, cette voie fait surtout intervenir le récepteur de lipoprotéine de faible densité (rLDL). Cependant, l'homéostasie cellulaire lipidique peut également être régulée par la voie de la captation sélective qui implique seulement la captation d'une fraction des lipides sans amener la dégradation des molécules protéiques. Cette voie fait intervenir l'action de récepteurs scavengers de classe B dont le scavenger de classe B type l (SR-BI). Le SR-BI, reconnu comme étant un récepteur de lipoprotéines de haute densité (HDL) ayant la capacité de prendre sélectivement les esters de cholestérol (EC), a également été reconnu pour sa capacité à lier et à capter sélectivement les EC d'autres classes de lipoprotéines, dont les LDL natives. Un autre récepteur dans la famille des récepteurs scavengers de classe B, le Cluster of differentiation-36 (CD36) manifeste également son implication dans le métabolisme des lipoprotéines. Cependant, son rôle a surtout été démontré au niveau des LDL oxydées (LDLox). Il aurait aussi une faible implication au niveau du métabolisme des HDL. Son rôle dans le métabolisme des LDL reste encore à être défini. Il est maintenant bien reconnu que de hauts niveaux de LDL plasmatiques ont une corrélation positive avec l'incidence de développement de maladies cardiovasculaires telle que l'athérosclérose. Ainsi, l'objectif du présent projet visait à élucider l'implication de CD36 dans le métabolisme des lipoprotéines de faible densité natives et oxydées à différents degrés. Cette étude a été réalisée grâce il des souris transgéniques déficientes pour le gène CD36 (-/-) et de souris sauvages (+/+) servant de contrôles. Le métabolisme des différentes lipoprotéines a été évalué selon des analyses de clairances plasmatiques. Pour ce faire, des lipoprotéines marquées radioactivement au niveau de leur portion protéique ou lipidique ont été injectées et des échantillons sanguins ont été prélevés pour mesurer la quantité de lipoprotéines résiduelles non métabolisées restant en circulation. Des courbes de clairances plasmatiques ont ensuite été tracées et à partir de celles-ci, le taux catabolique fractionnel (TCF) a été calculé pour chacune des parties (protéique et lipidique) des différentes lipoprotéines afin de quantifier la proportion de lipoprotéines métabolisées par les souris. Au terme de ces analyses, le foie des souris a été récolté et analysé pour son contenu en radioactivité dans le but d'évaluer la contribution de cet organe dans le métabolisme des lipoprotéines à l'étude. Les résultats montrent que les LDL et les LDL légèrement oxydées (LOX) sont soumises à la captation sélective, puisque la partie lipidique est éliminée plus rapidement que la partie protéique. Ce processus de prise sélective n'est toutefois pas retrouvé pour les LDL fortement oxydées (FOX) étant donné une clairance moins rapide en lipides qu'en protéines. L'absence de CD36 a pour effet d'accélérer la clairance de la partie protéique des LDL, mais ralentit de manière importante la clairance des LOX et des FOX. De plus, le foie contribue de façon importante au métabolisme des différentes lipoprotéines, mais le CD36 hépatique ne participe pas à cette prise hépatique. En somme, les LDL sont, en partie, éliminées par la voie de la captation sélective, mais leur oxydation progressive entraîne leur clairance via la captation globale. L'importance de CD36 dans l'élimination des LDL oxydées au niveau extra-hépatique suggère une contribution de ce récepteur dans le développement de l'athérosclérose. ______________________________________________________________________________

Il est connu que la grosseur d'une lipoprotéine est déterminée par sa composition lipidique. Celle-ci peut être modifiée par la captation sélective d'esters de cholestérol (EC) par le scavenger receptor class B type 1 (SR-BI). Comme montré par Brodeur et al. (2005), la captation sélective permet de diminuer la taille de la lipoprotéine de faible densité (LDL). Il devenait donc important de déterminer si la perte d'esters de cholestérol, subséquente à la captation sélective par SR-BI, permettrait une modification assez importante de la LDL afin de favoriser le métabolisme de la lipoprotéine par la voie de captation globale. Les sous-classes de LDL ont une composition lipidique différente. Cette différence pourrait être produite par une activité plus ou moins grande de captation sélective par le SR-BI. Les sous-classes ont été caractérisées par dosage enzymatique, migration sur gel et essai in vitro sur la lignée cellulaire Hep G2. Par la suite, le but était de développer un modèle in vitro, chez des cellules Hep G2, et in vivo, chez des rats Sprague-Dawley, des souris CD 1 et chez des souris C57BL/6, pour permettre la production de LDL étant appauvries en EC par la captation sélective. Pour ce faire, des LDL ont été exposées à des cellules Hep G2 ou encore injectées dans l'animal puis récupérées par ponction cardiaque pour ensuite être à nouveau isolées. Les LDL modifiées in vivo et in vitro ont été caractérisées par dosage enzymatique, migration sur gel et essai in vitro sur la lignée cellulaire Hep G2. L'étude des sous-classes a démontré qu'une diminution en EC permet une augmentation de la captation globale en augmentant l'association protéique et la dégradation de la sous-classe III. Ceci est bénéfique pour l'organisme. Pour ce qui est de la portion de l'étude in vitro, celle-ci n'a pas donné de résultats concluants. Cette production de LDL a permis de diminuer la quantité d'EC composant la LDL. Par contre, cette diminution est observable tant en présence qu'en absence de cellules Hep G2. Donc cette diminution n'est pas nécessairement due à l'action de la captation sélective. La production in vivo de LDL appauvries en EC chez le rat Sprague-Dawley a démontré une diminution de la quantité d'EC composant les lipoprotéines. Par contre, cette diminution s'accompagne d'une forte diminution en triglycérides (TG) due à l'activité de la lipoprotéine lipase qui est présente dans l'animal. La diminution en TG ne voulant pas être étudiée, ceci faisait du rat un modèle moins intéressant à utiliser. La souris CD 1 a elle aussi permis la production de LDL appauvries en EC, par contre si l'on regarde au niveau de ses caractéristiques celles-ci sont plus chargées, ce qui pourrait indiquer un début d'oxydation et un métabolisme dont la captation globale serait diminuée et la captation sélective augmentée. Ainsi, en se fiant aux résultats des sous-classes, la captation sélective serait bénéfique pour le métabolisme des LDL. Par contre, les résultats obtenus par la production in vivo semblent dire que les LDL produites sont plus susceptibles à l'oxydation, ce qui serait néfaste. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : LDL, SR-BI, Captation sélective, Oxydation, Sous-classe.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) constituent la principale cause de décès au monde. Chez la femme, les MCV représentent un fardeau puisque les manifestations et la pathophysiologie des MCV sont en partie différentes de celles des hommes. La lipoprotéine(a) (Lp[a]), une lipoprotéine semblable à une lipoprotéine de faible densité (LDL), est l’un des facteurs de risques génétiques associés aux MCV. Cependant, les études portant sur l’impact de la Lp(a) sur les MCV en fonction du sexe sont rares. Nos hypothèses étaient que les niveaux sanguins élevés de Lp(a) génétiquement déterminés et mesurés sont associés aux à la sténose aortique (SA), l’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique et aux maladies coronariennes (MC), autant chez les hommes que chez les femmes, et que l’association entre les niveaux sanguins de Lp(a) élevés génétiquement déterminés et chacune des trois maladies était indépendante des niveaux sanguins de LDL spécifique au sexe. Nos résultats révèlent qu’il y a une association entre les niveaux de Lp(a) mesurés et le risque de SA et de MC chez l’homme et la femme, mais pas pour l’AVC ischémique. Les résultats d’associations entre les concentrations de Lp(a) génétiquement déterminées et le risque de ces trois maladies vont dans la même direction que les résultats d’analyses observationnelles. Finalement, nous avons déterminé qu’il existe une relation de cause à effet probable entre les niveaux élevés de Lp(a) et le risque de SA chez la femme et de SA et de MC chez l’homme indépendamment des niveaux de LDL. L’ensemble de ces résultats suggère qu’il existe une relation causale probable entre les concentrations élevées de Lp(a) et le risque de SA et de MC pour les hommes et les femmes. Notre étude démontre que l’inhibition de la Lp(a) pourrait avoir des effets bénéfiques sur le risque de plusieurs MCV autant chez l’homme que chez la femme. / Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death globally. CVD represents an important burden in women because clinical manifestations, mechanisms and risk factors for CVD may be different from those of men. Lipoprotein(a) (Lp[a]), similar to low density lipoprotein (LDL), is one of the genetic risk factors associated with CVD. Unfortunately, sex-specific studies of the impact of Lp(a) impact on CVD sex-specific are rare. Our hypotheses were that genetically elevated Lp(a) levels and plasma Lp(a) levels are associated with aortic stenosis (AS), ischemic stroke (IS) and coronary heart disease (CAD) in men and women, and the association between genetically-elevated Lp(a) plasma levels and each disease was independent of LDL plasma levels in men and women. Our results suggest that the association between Lp(a) plasma levels and the risk of AS and CAD in men and women separately, but not for IS. The results of the association between genetically-elevated Lp(a) plasma levels and the risk of these three diseases point in the same direction as the results of observational analyzes. Finally, we determined that there is a causal effect relationship between elevated concentration of Lp(a) and the risk of AS in women and AS and CAD in men regardless of LDL plasma levels. Together these results suggest that there is a causal relationship between high Lp(a) plasma levels and the risk of AS and CAD for men and women. Our study shows that Lp(a)-lowering therapy could be useful in reducing CVD risk in both men and women with high Lp(a) levels.

Le cholestérol, molécule complexe, est depuis longtemps associé aux maladies cardiovasculaires. Bien qu'il ait des effets bénéfiques lorsqu'il est, par exemple, précurseur de sels biliaires, de la vitamine D et d'autres stéroïdes, s'il est en excès dans le sang, il peut être à l'origine de la formation de plaques athéromateuses. Le transport du cholestérol dans la circulation est assuré par les lipoprotéines qui sont évacuées de la circulation par des récepteurs spécifiques au niveau du foie. Le récepteur de lipoprotéines de faible densité (LDL) mène à la captation et à la dégradation complète de la particule, tandis que le récepteur « scavenger » de classe B type J (SR-BI) est capable de retirer de façon sélective les esters de cholestérol des LDL et des lipoprotéines de haute densité (HDL). Les lipoprotéines sont reconnues par ces récepteurs grâce aux apolipoprotéines (apo) présentes à la surface de la particule. Des études antérieures ont démontré que l'apoC-I peut inhiber la captation de lipoprotéines riches en triglycérides et moduler l'activité d'enzymes impliquées dans le métabolisme du cholestérol. L'objectif de la présente étude est d'examiner si les différents taux de sécrétion d'apoC-I par les cellules hépatiques induisent un changement au niveau du métabolisme des LDL et des HDL. Des essais de captation des HDL et des LDL par des cellules d'hépatome humain HepG2 ont été réalisés en présence de concentrations croissantes d'apoC-I purifiées. Ces essais ont démontré une diminution dose dépendante de la captation sélective des esters de cholestérol des LDL et des HDL (95 % et 98% d'inhibition respectivement, en présence de 5 µg/ml d'apoC-I), sans provoquer de changement dans l'association protéique et la dégradation de ces lipoprotéines. Pour caractériser l'impact des différents taux de sécrétion d'apoC-I endogène, des transformants stables de cellules HepG2 ont été obtenus exprimant 290 % et 380 % du niveau d'apoC-I secrétée par les cellules HepG2. D'autre part, l'expression de cette apolipoprotéine a été inhibée de 55 % de son niveau d'expression par les cellules HepG2 en utilisant la stratégie des siRNA (short interfering RNA). Les essais d'association et de dégradation des HDL et des LDL par ces différents types de cellules ont démontré qu'une diminution de l'expression de l'apoC-I induit une augmentation de la captation sélective des esters de cholestérol des HDL de 29 % par l'apport à celle des cellules contrôles. Les associations protéique et lipidique des LDL ont été aussi plus élevées pour les cellules sous-exprimant l'apoC-I (23 % et 15 % d'augmentation respectivement). Contrairement aux résultats obtenus avec les cellules sous-exprimant l'apoC-I, le métabolisme des lipoprotéines n'a pas été modifié dans les cellules sur-exprimant l'apoC-I. Les analyses de clairances plasmatiques des LDL et des HDL injectées à des souris, réalisées en présence d'apoC-I purifiée, visant à élucider l'impact de cette apolipoprotéine dans le métabolisme des lipoprotéines in vivo, n'ont pas donné les résultats escomptés. D'autre part, les essais de liaison de l'apoC-I marquée à l'iode-125 aux cellules HepG2 ont révélé que celle apolipoprotéine se lie de façon spécifique à la membrane plasmique de ces cellules. De plus, les résultats d'incubation des LDL et des HDL en présence de cette apoC-I marquée ont démontré que celle-ci s'associe également aux lipoprotéines. Enfin, la définition du rôle de l'apoC-I dans le métabolisme des HDL et des LDL pourrait mener à une intervention d'ordre thérapeutique visant à diminuer le taux de synthèse de cette apolipoprotéine, et ainsi diminuer le taux de cholestérol sanguin et en conséquence l'incidence de maladies cardiovasculaires. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : LDL, HDL, Apolipoprotéines, Cholestérol, Captation sélective.

Les lipoprotéines, complexes composés de protéines et de lipides, sont les principaux constituants permettant de transporter les lipides dans l'organisme et de les délivrer aux cellules. Elles peuvent être classées selon leur densité ou leur composition en apolipoprotéines. Ces dernières sont d'ailleurs les éléments permettant aux lipoprotéines d'être reconnues par la cellule puis d'être exploitées. Essentiellement, deux voies permettent aux lipides de passer de la lipoprotéine à la cellule. À chaque voie correspond des récepteurs particuliers, ainsi, la captation globale des lipoprotéines de faible densité (LDL), réalisée par le biais des récepteurs de LDL (rLDL), se décrit comme l'assimilation et la dégradation de la lipoprotéine dans sa totalité par la voie endosomale/lysosomale. La captation sélective, quant à elle, consiste en un transfert des lipides, en l'occurrence des esters de cholestérol (EC), de la lipoprotéine à la cellule par l'intermédiaire de récepteurs tels que le récepteur éboueur de classe B type I (SR-BI). Les produits de dégradation des esters de cholestérol qui sont des acides gras peuvent réguler la transcription de certains gènes du métabolisme des lipides, telle la protéine L-FAPB «liver fatty acid binding protein» dédiée au transport des acides gras. La capacité, de la L-FABP à lier le cholestérol, a été évoquée, mais demeure encore sujet à controverses. De précédents travaux menés par David Rhainds au sein de notre laboratoire ont révélé une forte augmentation de l'expression de la L-FABP dans des cellules HepG2 surexprimant le SR-BI. Le but de l'étude menée ici était de déterminer si la L-FABP travaille avec le SR-BI pour la captation sélective des esters de cholestérol ou si l'augmentation de la L-FABP remarquée est due aux acides gras produits par cette réaction. Pour cela, des cellules HepG2 ont été incubées avec des LDL afin de vérifier l'effet de la captation sélective sur les récepteurs pouvant être impliqués et sur la L-FABP. Ensuite une transfection stable de cellules HepG2 avec un vecteur contenant l'ADN de la L-FABP a été réalisée dans le but d'observer la contribution de la L-FABP dans différents processus. Ainsi, le niveau des récepteurs impliqués dans la captation sélective des (EC) a été vérifié chez ces clones. Des essais d'association et des mesures de captation sélective ont été effectués. Enfin des essais d'hydrolyse en absence et en présence d'un inhibiteur de l'hydrolyse des EC ont été réalisés pour statuer de l'éventuel impact de la L-FABP, en tant que transporteur de stérols, ou d'acides gras générés par l'hydrolyse d'EC sur les voies d'hydrolyse des EC. Dans cette même optique, une stimulation de la L-FABP avec des agonistes des « Peroxysome Proliferator Activated Receptor a» PPARa a été tentée. Enfin, une interférence à l'ARN de la L-FABP a été effectuée dans le but d'en vérifier l'impact sur le métabolisme des EC des LDL et HDL. Les résultats ne montrent pas de modulation des rLDL, SR-BI et L-FABP par l'entrée d'EC des LDL dans les cellules. Dans les cellules surexprimant la L-FABP, l'expression de SR-BI n'a pas été affectée. Les surexpressions ont aussi permis de remarquer que la L-FABP n'avait, ni d'effet significatif sur la captation sélective des EC des LDL ou HDL, ni d'impact sur la voie d'hydrolyse empruntée par ces derniers. L'interférence à l'ARN de la L-FABP, réalisée dans le but de voir l'effet d'une absence de cette protéine, fournissant la réponse à cette hypothèse n'a pas été assez efficace et demande encore une optimisation afin d'élucider de façon concluante le rôle le L-FABP dans le processus de captation sélective des EC des LDL et HDL. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : LDL, HDL, SR-BI, L-FABP, Captation sélective.

Le récepteur scavenger de classe B type 1 (SR-BI) est essentiel au transport inverse du cholestérol puisqu'il en effectue la dernière étape: la captation sélective (CS) des esters de cholestérol (EC) à partir des lipoprotéines, c'est-à-dire l'internalisation de leurs EC sans dégradation de leur portion protéique. Au niveau hépatique, ce mécanisme d'importance demeure cependant mal défini. Nous avions déjà montré qu'un mécanisme de rétroendocytose était responsable de la CS dans des cellules HepG2 et que la CS dépendait de la localisation membranaire du SR-BI. Ici, nous vérifions si des voies d'endocytose, qui sont indépendantes de la clathrine et dépendent de microdomaines membranaires comme les radeaux lipidiques, ne pourraient pas expliquer l'activité du SR-BI à l'égard des LDL et HDL). Le traitement des cellules avec des inhibiteurs «classiques» de l'endocytose (NH4 CI: choc hyperosmotique, privation d'ATP, chlorpromazine (CPZ), puis le traitement avec des inhibiteurs différentiant ces voies selon qu'elle dépendent ou non de la dynamine-2 (dynasore) ou de GTPases de la famille de Rho (sous unité B de la toxine de C. difficile (CDTxB)) révèlent que le SR-BI ne se conduit pas de façon identique à l'égard des deux ligands. Les résultats indiquent que la CS des EC-HDL), de par sa sensibilité aux NH4CI et CPZ et par son augmentation en présence de dynasore ou de CDTxB, serait effectuée par endocytose suivant une voie dépendant de la clathrine et qu'elle pourrait être régulée négativement par une voie dépendant de RhoA. La CS des EC-LDL, sensible à la CPZ et augmentée par la CDTxB, pourrait dépendre, elle, d'une voie d'endocytose régulée par Cdc42 ou la flotilline. En somme, les résultats permettent une caractérisation plus approfondie de la CS et les différences de régulation de la CS envers les deux principales classes de lipoprotéines chez l'humain s'ajoutent à celles déjà mises en évidence par nous. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : lipoprotéines, cholestérol, endocytose indépendante de la clathrine, radeaux lipidiques, cellules hépatiques

Plusieurs études rapportent que les personnes ayant un taux élevé de LDL et souffrants d'athérosclérose ont un risque accru de développer l'ostéoporose. Le remodelage osseux est effectué par deux types de cellules. Les ostéoblastes sont responsables de la synthèse de la matrice osseuse et de la régulation de sa dégradation par les ostéoclastes. L'altération de ce processus de renouvellement mène à diverses pathologies osseuses. L'ostéoporose est caractérisée par une faible densité minérale du tissu osseux et une microarchitecture de piètre qualité augmentant les risques de fractures. Les LDL en forte concentration dans le plasma des patients athérosclérotiques subissent une oxydation progressive, ce qui accroit leur réactivité et les rend athérogéniques. Ainsi, le principal objectif de l'étude a été d'évaluer les effets des LDL oxydés (oxLDL), des oxystérols 7β-hydroxycholestérol et 7ketocholestérol et de la Iysophosphatidylcholine (IysoPC) sur les pré-ostéoblastes humains MG-63. Considérant la variété des effets induits par les oxLDL qui étaient rapportés dans la littérature, nous avons émis l'hypothèse que la réponse des ostéoblastes à des concentrations croissantes de oxLDL ne serait pas monophasique. L'exposition des MG-63 à des hox-LDL (LDL fortement oxydées) et au 7β-hydroxycholestérol pendant 48 heures produit une réponse de type hormèse lors des essais de viabilité cellulaire (activité réductrice MTT). Ainsi, il y a augmentation de l'activité réductrice cellulaire à faibles concentrations, effet perdu à fortes concentrations de hox-LDL et de 7β-hydroxycholestérol. Les nLDL (LDL natives) et les mox-LDL (LDL moyennement oxydées) induisent aussi une stimulation de l'activité MTT. Toutefois, celle-ci n'est pas de type hormèse, car il n'y a pas de chute de l'activité MTT à fortes concentrations. Par contre, le 7ketocholestérol réduit l'activité MTT de manière dose-dépendante et la lysoPC n'influence pas l'activité MTT. Contrairement aux nLDL, la stimulation de l'activité MTT par les hox-LDL et les mox-LDL est plus élevée que l'augmentation du nombre de cellules et le taux de division cellulaire (déterminé par la réduction de fluorescence du CFSE mesurée au cytofluoromètre) dans les mêmes conditions. De plus, aucune différence significative de taille cellulaire, de masse mitochondriale ni de l'état lysosomal n'a été observée. Cependant, l'exposition aux hox-LDL provoque une augmentation du potentiel membranaire mitochondrial et la production de ROS. Nous avions comme hypothèse que la stimulation d'activité MTT reflétait les niveaux de ROS cellulaire. Toutefois, une incubation avec l'antioxydant NAC n'a pas d'effet sur l'activité MTT et l'agent pro-oxydant BSO, qui favorise une augmentation de ROS cellulaire, diminue plutôt l'activité MTT. Par contre, nous avons démontré l'expression de l' ARNm d'une f1avoenzyme, la NADPH oxydase NOX-4. Cette enzyme est connue pour produire le radical superoxyde et être stimulée par les hox-LDL. L'inhibition des flavoenzymes avec le DPI a réduit l'activité MTT. De plus, l'analyse de l'autofluorescence des cellules au microscope confocale a permis de constater une augmentation de la fluorescence associée au NAD(P)H. Ces résultats démontrent que les enzymes réductrices dépendantes du NAD(P)H du type flavoenzymes, possiblement NOX-4, jouent un rôle dans l'augmentation du potentiel réducteur cellulaire. Nous voulions aussi vérifier l'hypothèse selon laquelle l'augmentation de la production de ROS induit un stress oxydatif pouvant être dommageable pour les ostéoblastes. Cette hypothèse est appuyée par nos résultats montrant une diminution des groupements thiols réduits (SH-) intracellulaires, de l'activité phosphatase alcaline et l'augmentation de l'expression de l'ARNm de l'enzyme de détoxification métallothionéine en présence de faibles concentrations de oxLDL. Nous proposons le mécanisme suivant: les oxLDL stimulent la production de ROS et des mécanismes intracellulaires associés aux thiols sont enclenchés afin de contrecarrer les effets de ces ROS. Il en découle un stress oxydatif qui oriente l'énergie cellulaire vers la production de NAD(P)H. Le NAD(P)H participe aux activités de flavoenzymes servant à régénérer les groupements thiols, mais il peut aussi être utilisé par la flavoenzyme NOX-4, qui contribue aussi à la production de ROS. Ainsi, les fonctions ostéoblastiques sont perturbées par le stress oxydatif et la réorientation de l'utilisation de l'énergie cellulaire, ce qui contribue à affaiblir la structure osseuse et mène à l'ostéoporose. En effet, les altérations de la prolifération, de la différenciation et de la migration cellulaire témoignent en ce sens. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Athérosclérose, Ostéoporose, oxLDL, Essais MTT, ROS, NADPH, Flavoenzyme, NADPH oxydase, NOX-4, Stress oxydatif, Thiols, Métallothionéine.