Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Andréa Regina Baptista Rossit / Banca: Patrick Jack Spencer / Resumo: A tuberculose é uma doença infecciosa que representa um dos principais problemas sociais, econômicos e de saúde pública do mundo. Muitos antígenos potentes demonstraram proteção contra tuberculose nos modelos experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock protein Hsp65 kDa de Mycobacterium leprae. Situações como altas temperaturas, presença de radicais livres e deficiências nutricionais levam ao aumento da produção das Heat Shock Proteins (Hsp's). A principal função das Hsp's é manter a estrutura e função das proteínas e, conseqüentemente, preservar as funções celulares essenciais, agindo como chaperonas moleculares. A Hsp65 de Mycobacterium leprae é altamente imunogênica, acarretando em infecções micobacterianas, reações humorais e celulares por parte do hospedeiro. Além disso, foi evidenciada que a Hsp65 de M. leprae apresenta uma possível atividade de oligopeptidase. Dessa forma, esse projeto teve como alvo principal a expressão e purificação da Hsp65 de M. leprae em grau de pureza e quantidade adequada para realizar estudos estruturais. Devido ao uso de condições desnaturantes para a solubilização da proteína, o espectro de Dicroísmo Circular (CD) foi utilizado para analisar a presença de estrutura secundária. Com o objetivo de investigar a estrutura terciária da Hsp65 (Cpn 60-2), a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi realizada tendo sido observado que a solução apresenta-se monodispersa com um raio hidrodinâmico médio de 10 nm, caracterizando um estado trimérico. A tentativa de cristalização dessa amostra está em andamento e sob intensa observação. Algumas outras condições estão em fase de refinamento na tentativa de se conseguir cristais difratáveis para os estudos estruturais. Além do projeto principal, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tuberculosis is an infectious disease that represents one of the most important social, economic and health problems in the world. Many antigens have demonstrated strong protection against tuberculosis in experimental models and the most recent antigen studied for the development of a vaccine againt tuberculosis is the Hsp65 kDa heat shock protein from Mycobacterium leprae.The production of heat shock proteins (Hsp) is greatly enhanced by stress stimuli such as high temperatures, presence of free radicals and nutricional deficiencies. The main function of Hsp's is to preserve the structure and function of proteins and, consequently, the essential cellular functions, acting as molecular chaperones. The M. leprae Hsp65 has been identified as a remarkable immunodominant antigen, since it estimulates humoral immune response and activation of T cells in the host during this bacterial infection. In addition, it was demonstrated that this protein presents a possible enzymatic activity. This project aims at expression, purification and further structural studies of the M. leprae Hsp65. During this project, pure protein was obtained in high amounts. Due to the use of chaotropic agent for resolubilization of the protein present in inclusion bodies far-UV CD studies were accomplished aiming to observe the presence of secondary structures. DLS studies were also carried out to determine the oligomeric state of this Hsp65 (Cpn 60-2), showing that the protein solution was monodisperse with an approximate radius of 10 nm (trimer). Attempts to obtain mono crystals of this sample are currently in progress and under intense observation. Some other refinement conditions are in process in order to obtain crystals suitable for structural studies. The work conducted in parallel with the NUDEL protein (nuclear distribution element-like) was...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-06-29T13:12:56Z No. of bitstreams: 1 2012_MurieleTabordaLottermann.pdf: 2431324 bytes, checksum: 6ce4316335a6c074d43d053cafea80ce (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-29T14:10:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MurieleTabordaLottermann.pdf: 2431324 bytes, checksum: 6ce4316335a6c074d43d053cafea80ce (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-29T14:10:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MurieleTabordaLottermann.pdf: 2431324 bytes, checksum: 6ce4316335a6c074d43d053cafea80ce (MD5) / A crise energética que vem atualmente sendo estabelecida mundialmente deve-se principalmente à elevação de preços e escassez de fontes de petróleo. Em virtude disso, novas fontes para a produção de combustíveis tem sido exploradas, entre elas, o amido para a produção de bioetanol. Para fermentação alcoólica o amido deve ser clivado para liberação das moléculas de glicose presentes em sua estrutura. Uma das enzimas necessárias nesse processo é a α-amilase, responsável pela hidrólise das ligações α-1,4 do amido liberando maltose e oligossacarídeos. Neste trabalho apresentamos estudo biofísico e estrutural de uma α-amilase (Amy1), proteína da levedura Cryptococcus flavus, expressa em Saccharomyces cerevisiae. A Amy1 foi obtida a partir do crescimento da levedura recombinante por 72 horas em meio de cultura com extrato de levedura como fonte de nitrogênio e purificada por cromatografia de troca iônica e de exclusão molecular. Essa enzima apresenta atividade ótima em pH 5,5. Estudos de dicroísmo circular (CD) da Amy1 recombinante em comparação com a proteína selvagem mostraram que a expressão em um organismo diferente não alterou significativamente a estrutura da α-amilase recombinante. A estrutura secundária da Amy1 recombinante em água a 25°C é constituída de 9,1% de α-hélice e 32,7% de folhas-β e da Amy1 selvagem de 8,2% de α-hélice e 34,7% de folhas-β. Nenhuma das proteínas apresentou padrão de desnaturação com a elevação da temperatura até 95°C, indicando a estabilidade estrutural dessas moléculas. Estudos de atenuação de fluorescência, utilizando atenuadores carregados e neutros e ajustes de Stern-Volmer, revelaram que a proteína recombinante apresenta uma população de triptofano predominantemente semi-enterrada. O microambiente desse aminoácido é parcialmente carregado positivamente, indicado pelos valores das constantes de Stern-Volmer (Ksv) obtidas para a partir da atenuação de fluorescência pela acrilamida, cloreto de césio e iodeto de potássio, nos pHs 5,5; 7,0 e 9,0. Mudanças conformacionais da proteína ocorrem em pHs neutro e alcalino levando a inativação da enzima. No entanto, as mudanças ocorridas em pH 5,5 são importantes para o aumento da atividade catalítica dessa enzima. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The energy crisis currently established worldwide has been the main motivation to explore new sources for fuel production, as starch used for bioethanol. In this process the α-amylase, responsible for the hydrolysis of the starch α-1-4 covalent bonds, is used to release maltose and oligosaccharides. Here, we present structural and biophysical studies of the α-amylase (Amy1) from yeast Cryptococcus flavus, expressed in Saccharomyces cerevisiae. The Amy1 was obtained from recombinant yeast in culture medium for 72 hours with yeast extract as nitrogen source. The enzyme was purified by ion exchange and molecular exclusion chromatography and presents optimal activity in pH 5.5. Structural studies using circular dichroism (CD) spectroscopy showed that recombinant and wild type amylases (Amy1) are structurally similar. The secondary structure content of recombinant and wild Amy1 in water at 25°C consists of 9.1% and 8.2% α-helix, 32.7% and 34.7% β-sheet, respectively. The amylases were characterized as thermal stable proteins, since none denaturation profile was observed under increasing temperature up to 95°C. Fluorescence decay studies using charged and neutral quenchers and Stern-Volmer approximation revealed that the recombinant protein has a population of tryptophan predominantly semi-buried. The tryptophan microenvironment is partially positively charged, indicated by the values of the Stern-Volmer constant (KSV) obtained from attenuation of fluorescence by acrylamide, cesium chloride and potassium iodide at pH 5.5, 7.0 and 9.0. Protein conformational changes occur in neutral and alkaline pH leading to inactivation of the enzyme. However, at pH 5.5 these conformational changes are important for increasing the catalytic activity of this enzyme.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-09-14Bitstream added on 2014-06-13T21:01:33Z : No. of bitstreams: 1 martins_al_dr_sjrp_parcial.pdf: 169834 bytes, checksum: f95bbfe4b3ea069b9bc61e9a309bbee1 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-08-22T14:57:04Z: martins_al_dr_sjrp_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-08-22T15:02:07Z : No. of bitstreams: 1 000707231.pdf: 1624095 bytes, checksum: e89222e48298ae5ccc2e0464958b408b (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O enovelamento de proteínas é um problema fundamental em Biofísica Molecular. Propõe8se neste trabalho um método de crescimento de estruturas proteicas utilizando uma rede denominada cubo8octaédrica. Neste processo de crescimento a partir da estrutura primária utiliza8se um potencial estatístico de interação entre pares de resíduos a fim de determinarmos a estrutura terciária da sequência. Para o ensemble estrutural analisam8se propriedades estruturais como o raio de giro das cadeias e o desvio médio quadrático das distâncias. Além deste estudo de previsão de estruturas, analisamos parâmetros energéticos termodinâmicos no estado de transição da proteína CI2 (cujo código PDB é 1 coa) bem como o cálculo dos valores de φ-values para os resíduos que fazem contatos no estado de transição / Protein folding is a fundamental problem in Molecular Biophysics. We present a method of chain growth algorithm to lattice generation of protein structure. The interaction between pairs of residues in this process is a statistical potential proposed by THOMAS and DILL. We examine properties as radius of gyration and root mean square deviation of ensemble protein structure. Finally, we verify the themodynamics energetic parameter in the transition state of protein folding 1 coa

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-18Bitstream added on 2014-06-13T19:19:08Z : No. of bitstreams: 1 camargo_fb_me_sjrp.pdf: 735046 bytes, checksum: 0006322f87ae9a50e39b65b0a2d314c9 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A tuberculose é uma doença infecciosa que representa um dos principais problemas sociais, econômicos e de saúde pública do mundo. Muitos antígenos potentes demonstraram proteção contra tuberculose nos modelos experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock protein Hsp65 kDa de Mycobacterium leprae. Situações como altas temperaturas, presença de radicais livres e deficiências nutricionais levam ao aumento da produção das Heat Shock Proteins (Hsp´s). A principal função das Hsp´s é manter a estrutura e função das proteínas e, conseqüentemente, preservar as funções celulares essenciais, agindo como chaperonas moleculares. A Hsp65 de Mycobacterium leprae é altamente imunogênica, acarretando em infecções micobacterianas, reações humorais e celulares por parte do hospedeiro. Além disso, foi evidenciada que a Hsp65 de M. leprae apresenta uma possível atividade de oligopeptidase. Dessa forma, esse projeto teve como alvo principal a expressão e purificação da Hsp65 de M. leprae em grau de pureza e quantidade adequada para realizar estudos estruturais. Devido ao uso de condições desnaturantes para a solubilização da proteína, o espectro de Dicroísmo Circular (CD) foi utilizado para analisar a presença de estrutura secundária. Com o objetivo de investigar a estrutura terciária da Hsp65 (Cpn 60-2), a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi realizada tendo sido observado que a solução apresenta-se monodispersa com um raio hidrodinâmico médio de 10 nm, caracterizando um estado trimérico. A tentativa de cristalização dessa amostra está em andamento e sob intensa observação. Algumas outras condições estão em fase de refinamento na tentativa de se conseguir cristais difratáveis para os estudos estruturais. Além do projeto principal,... / Tuberculosis is an infectious disease that represents one of the most important social, economic and health problems in the world. Many antigens have demonstrated strong protection against tuberculosis in experimental models and the most recent antigen studied for the development of a vaccine againt tuberculosis is the Hsp65 kDa heat shock protein from Mycobacterium leprae.The production of heat shock proteins (Hsp) is greatly enhanced by stress stimuli such as high temperatures, presence of free radicals and nutricional deficiencies. The main function of Hsp's is to preserve the structure and function of proteins and, consequently, the essential cellular functions, acting as molecular chaperones. The M. leprae Hsp65 has been identified as a remarkable immunodominant antigen, since it estimulates humoral immune response and activation of T cells in the host during this bacterial infection. In addition, it was demonstrated that this protein presents a possible enzymatic activity. This project aims at expression, purification and further structural studies of the M. leprae Hsp65. During this project, pure protein was obtained in high amounts. Due to the use of chaotropic agent for resolubilization of the protein present in inclusion bodies far-UV CD studies were accomplished aiming to observe the presence of secondary structures. DLS studies were also carried out to determine the oligomeric state of this Hsp65 (Cpn 60-2), showing that the protein solution was monodisperse with an approximate radius of 10 nm (trimer). Attempts to obtain mono crystals of this sample are currently in progress and under intense observation. Some other refinement conditions are in process in order to obtain crystals suitable for structural studies. The work conducted in parallel with the NUDEL protein (nuclear distribution element-like) was...(Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Fernando Alves de Melo / Banca: Júlio César Borges / Banca: Luis Octávio Regasini / Resumo: A proteína adaptadora Grb2 é uma importante reguladora da proteína quinase FGFR2 antes de estímulos extracelulares e é conhecida por formar complexos protéicos responsáveis por ativar a via de sinalização da MAPK, relacionada com a proliferação celular. Quando Grb2 é fosforilada ela se dissocia de FGFR2. Está por sua vez, adquire a capacidade de recrutar proteínas parceiras do citosol para iniciar vias de sinalização importantes para realização do metabolismo celular. A desfosforilação de Grb2 pela fosfatase Shp2 refaz o complexo FGFR2-Grb2 retomando controle sobre FGFR2. Desta maneira, devido a esta versatilidade em executar funções variadas dentro da célula, Grb2 torna-se um alvo importante para testar sua interação com moléculas conhecidas por apresentar propriedades farmacológicas. Sendo assim, as moléculas Morina (2',3,4',5,7-pentahidroxiflavona) e Rutina (Quercetina-3-O-α-L-Rhamnopiranosil-(1→6)-β-D-Glucopiranosídeo), foram escolhidas devido a suas propriedades anti-tumorais conhecidas na literatura e pela ausência de estudos em nível molecular que relacionem as propriedades destas moléculas com as proteínas que atuam nesta via de sinalização. Por conseguinte, utilizou-se espectroscopia de fluorescência em estado estacionário e ressonância magnética nuclear, com o objetivo de caracterizar a interação entre Morina e Rutina com Grb2. Através da determinação do perfil termodinâmico de interação destas moléculas com Grb2, obtidos por fluorescência, pudemos inferir um... / Abstract: Grb2 adaptor protein is an important regulator of FGFR2 before extracellular stimuli and is known to form complexes that activate MAPKinase pathway. When phosphorylated Grb2 dissociates from FGFR2 that gets able to recruit protein partners from the cytosol in order to start important signaling pathways inside cells. Dephosphorylating of Grb2 by Shp2 recue the FGFR2-Grb2 complex resulting in a control upon FGFR2. Because Grb2 shows to be versatile to performing functions inside the cell other than adaptor protein, it becomes an important target to test the interaction with molecules known to have anti-tumor properties. Therefore, the molecules Morin (2',3,4',5,7-pentahydroxyflavone) and Rutin (quercetin-3-O-α-L-Ramnopiranosil-(1→6)-β-D-glucopyranoside), were chosen because to its anti-inflammatory and anti-tumor properties known in the literature and because the absence of studies at the molecular level that brings up information about the properties of these molecules to specific protein targets. Thus, we have used static fluorescence spectroscopy and nuclear magnetic resonance in order to characterize the interaction between those molecules and Grb2. The thermodynamic profile got from fluorescence assays allow us to infer that the interaction between the molecules with Grb2 is entropically driven, compatible with hydrophobic interactions for both molecules where the equilibrium constants can be found between 104 and 105 M-1. Furthermore, nuclear magnetic resonance has ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-01Bitstream added on 2014-06-13T20:01:01Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_rj_dr_sjrp.pdf: 3645510 bytes, checksum: 181949bcc7d9fbd2c0929fdd73a9cf0a (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A difusão desempenha um papel importante na cinética de eno-velamento de proteínas. Nessa tese, desenvolvemos métodos analíticos e computacionais para o estudo do coeficiente de difusão dependente da posi-ção e do tempo. Para estes estudos, utilizou-se sobretudo o modelo baseado na estrutura (modelo G¯o) via simulação computacional da representação em carbonos alfa. Investigou-se o efeito da difusão no enovelamento da proteína cold-shock (TmCSP). Encontrou-se que o efeito temporal da difusão leva a cinéticas não-exponenciais e a estatística não-poissônica da distribuição de tempos de enovelamento. Com relação a dependência com a posição, o coeficiente de difusão revelou ter um comportamento não-monotônico que foi compreendido pela análise dos valores- e da entropia residual no estado nativo. Para uma versão frustrada do modelo, encontrou-se que um baixo nível de frustração energética aumenta a difusão no estado nativo e torna o estado de transição mais homogêneo. Esses resultados corroboram com experimentos recentes de fluorescência de uma única molécula. Esse trabalho também propõe um método para a determinação da superfície de energia de enovelamento de proteína. A partir da caracterização da superfície de energia, definimos a quantidade (LD – Landscape Descriptor) que mostrou uma forte correlação entre a cinética e a termodinâmica de uma dezena de proteínas globulares, tornando-se um método útil para classificar proteínas / Diffusion plays an important role in protein folding kinetics. In this thesis we developed analytical and computational methods in order to study the diffusion coefficient dependent on position and time. For these studies we used mainly the structure-based model (G¯o model) via computer simulation of the alpha-carbon representation. We investigated the effect of diffusion in the folding of the cold-shock protein (TmCSP). We found that the time dependence on diffusion leads to non-exponential kinetics and non-Poisson statistics of folding time distribution. With respect to the position dependence, the diffusion coefficient reveled a non-monotonic behavior that was understood by analyzing the -values and the residual entropy in the native state. For a frustrated version of the model, we found that a low level of frustration energy stabilizes and increases the diffusion in the native state and the transition state becomes more homogeneous. These results are supported by recent single-molecule fluorescence experiments. This work also proposes a method to determine the protein folding energy landscape. With the energy landscape characterized, we defined the quantity (LD – Landscape Descriptor) which showed a strong correlation between kinetics and thermodynamics of a dozen globular proteins making it a useful method to classify proteins

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-09-26Bitstream added on 2014-06-13T21:01:34Z : No. of bitstreams: 1 fadel_v_dr_sjrp.pdf: 3914657 bytes, checksum: 33f667f3dc51502de2df4a24d382b1cf (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Resumo: De acordo com a OMS, a tuberculose mata 5000 pessoas por dia, e se não controlada, são estimados 35 milhões de novos casos nos próximos vinte anos. A alta susceptibilidade dos infectados por HIV para a tuberculose, bem como a proliferação da tuberculose multidroga-resistente (MDR), tem criado um grande interesse mundial de expansão nos programas atuais de pesquisas sobre a tuberculose. A Purina Nucleosídeo Fosforilase do Mycobacterium tuberculosis (MtPNP) é um potencial alvo para novas drogas anti-tuberculose visto que é responsável pela síntese de novo de ribonucleotídeos de purina. A Inibição específica da PNP poderia potencialmente levar o M. tuberculosis ao estado latente. O objetivo desde trabalho é resolver a estrutura da MtPNP complexada com adenina, e analisar as interações com os ligantes. A MtPNP foi cristalizada utilizando condições experimentais descritas posteriormente, e o ligante (adenina) foi adicionado por soaking. Os dados de difração de raios X foram coletados no detector CCD utilizando fonte de radiação síncotron (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, LNLS, Campinas, Brazil). O programa MOSFLM foi utilizado para o processamento, e os dados foram escalonados através do programa SCALA, apresentando o grupo espacial ortorrômico P21212 (a=118,96Å, b=134,65 Å, c=44,42 Å). O cristal foi determinado utilizando o método de substituição...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In according to the WHO, the tuberculosis kills 5000 people every day, if does not controlled, are esteemed 35 millions of new cases in next 20 years. The high susceptibility of human immunodeficiency virus infected persons to the disease and the proliferation of multidrug-resistant (MDR) strains have created a worldwide interest in expanding current programs in tuberculosis research. The Purine Nucleoside Phosphorylase from Mycobacterum tuberculosis (MtPNP) is a potential target for new drug anti-tuberculosis, whereas is responsible for de novo synthesis of purine ribonucleotides. The specific inhibition of M. tuberculosis PNP could potentially lead to the latent state of M. tuberculosis. The objective of this work is to solve the structure from MtPNP complexed with adenine, and to analyze their interactions with the ligand. MtPNP was crystallized using the experimental conditions described elsewhere, and the ligand (adenine) was added by soaking. The X-ray diffraction data were collected on a CCD detector using synchrotron radiation source (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, LNLS, Campinas, Brazil). It was used the MOSFLM program to processing, and the data were scaled through the program SCALA, presenting orthorhombic spatial group P21212 (a=118,96Å, b=134,65 Å, c=44,42 Å). The crystal was determined by molecular replacement methods using the program AMoRe. The final model has Rfree and Rfactor of 23.87% and 17.51% respectively, and maximum resolution of 1.86Å. It was observed a large...(Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Fernanda Canduri / Coorientador: Walter Filgueira de Azevedo Júnior / Banca: José Roberto Ruggiero / Banca: Flávio Augusto Vicente Seixas / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-03T20:38:24Z No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 3205780 bytes, checksum: 3bcc450ab74953bdffd4e6c59d584dc0 (MD5) / Approved for entry into archive by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-11T16:56:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 3205780 bytes, checksum: 3bcc450ab74953bdffd4e6c59d584dc0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-11T16:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 3205780 bytes, checksum: 3bcc450ab74953bdffd4e6c59d584dc0 (MD5) Previous issue date: 2018-09-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / A presença de uma camada proteica de superfície (camada S) é comum em organismos procarióticos. As proteínas que compõem essa camada apresentam a propriedade de se auto-organizar em arranjos simétricos estáveis, que as confere um alto potencial biotecnológico. Apesar de presente em quase todas as archaeas, existem poucos relatos do uso de proteínas de camada S desses organismos em estudos aplicados. Além disso, os estudos descrevendo a estrutura de proteínas desse tipo são escassos. Assim, esse trabalho tem o objetivo de caracterizar estruturalmente as proteínas de camada S da archaea halófila Haloferax volcanii, utilizá-las para a construção de envelopes celulares biomiméticos para o estudo de membranas e a expressão dessa proteína em E. coli para construção de fusões gênicas de interesse. As proteínas foram obtidas a partir da cultura de células de H. volcanii e caracterizadas por ensaios de espalhamento de luz dinâmico, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para observar a formação do arranjo cristalino das proteínas purificadas, bem como de envelopes celulares de H. volcanii. Foram produzidas monocamadas lipídicas por Langmuir-Blodgett utilizando os lipídios DPPE, DPPC e DPhPE. A estrutura secundária da proteína é afetada pelo pH, de maneira que uma maior quantidade de folhas beta foi detectada em valores mais altos. Esse mesmo fator influencia também a sua estrutura terciária, de maneira que em valores mais alcalinos as regiões próximas aos resíduos de triptofano da proteína interagem mais com o meio. No entanto, ensaios de espalhamento de luz dinâmico indicaram formação de oligômeros em todos os pHs testados, havendo picos monodispersos, indicando a capacidade de cristalização da proteína em todas as condições. No entanto, imagens de microscopia revelam que os arranjos formados nessas condições não estão de acordo com o normalmente observado na superfície celular desse organismo, algo que foi somente possível em condições de alta salinidade. A concentração de íons de sódio, magnésio e cálcio no meio afeta a estrutura secundária e terciária da proteína, influenciando assim a sua propriedade de auto-arranjo. Nos ensaios de Langmuir-Blodgett, foi observada a cristalização das proteínas sobre as diferentes superfícies lipídicas, sugerindo assim um possível potencial no uso dessas proteínas para produção de envelopes celulares artificiais. Foi também possível a expressão de proteínas de camada S de H. volcanii em E. coli. / The presence of a protein surface layer, known as the S-layer, is commonly found in prokaryotic cell envelopes. This layer is composed of proteins that self-assemble into a paracrystalline surface structure, a property that has been extensively used in biotechnological research. Despite its detection in almost all archaea described to date, there are very few reports in the literature using these proteins for applied purposes. Furthermore, studies describing structural aspects of these proteins are scarce. Thus, the objective of the present study was to investigate the structural properties of the Haloferax volcanii S-layer protein, use them for production of biomimetic S-layer supported lipid platforms and heterologous expression of S-layer fusion proteins in E. coli. The S-layer proteins were purified directly from H. volcanii cells and their structural properties were evaluated through dynamic light scattering, circular dichroism and fluorescence spectroscopy. Transmission electron microscopy was used for analyses of the protein’s self-assembly properties as well as H. volcanii cell envelope preparations. Lipid monolayers using DPPE, DPPC and DPhPE were produced through Langmuir-Blodgett. The protein’s secondary structure is affected by pH values in the medium, with higher beta sheet detection in more alkaline values. This factor also affects the protein’s tertiary structure, with higher tryptophan exposure to the environment in higher pH. Dynamic light scattering essays revealed oligomer formation in all pH values evaluated, indicating that the protein’s self-assembly process occurs in these conditions. However, micrograph images showed that these oligomers do not resemble the lattice found on the H. volcanii cell surface, and correct lattice formation was only achieved in higher salt concentrations. The concentrations of sodium, magnesium and calcium ions in the environment affect the protein’s secondary and tertiary structures, which influences the protein’s functional properties. On the Langmuir-Blodgett essays, an increase of surface pressure was detected on all lipid monolayers tested, indicating a potential use of the H. volcanii S-layer proteins in artificial lipid platform production. It was also possible to isolate the protein’s encoding gene and heterologous protein expression was successful in E. coli cells.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-13Bitstream added on 2014-06-13T20:56:17Z : No. of bitstreams: 1 goncalesgarcia_l_me_sjrp.pdf: 353281 bytes, checksum: 6786716aa7970dd6c603e25cad2d5709 (MD5) / As atividades realizadas compreenderam a produção de cDNA utilizando primer anti-senso e RNA purificado, amplificação do gene codificador da proteína 25K do Cole latent virus (CoLV25K), purificação do fragmento amplificado, ligação em vetor de multiplicação pGEM-T, transformação em células competentes de Escherichia coli linhagem TOP 10, purificação do vetor, digestão enzimática com as enzimas Bam HI e Hind III, subclonagem no vetor de expressão pET28a, transformação em células competentes de E. coli linhagem BL21-RIL, sequenciamento do gene no vetor de expressão e expressão da proteína a 37 o C . Quando expressa a 37 ºC, a proteína, de 25 kDa, foi encontrada em sua totalidade nos corpos de inclusão. Dessa forma, a proteína foi purificada sob condição desnaturante (utilizando 8 M de uréia) e submetida à diálise para seu reenovelamento. Após o reenovelamento, a proteína foi concentrada para aproximadamente 3 mg/mL e foram realizadas medidas de dicroísmo circular, para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária, e o espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados da deconvolução do experimento de dicroísmo circular indicam um percentual de 40-46% α-hélice, 12-14% folha-β, 15-22% voltas e 24-28% de outras estruturas, indicando que a proteína está estruturada; e os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável, monodispersa, mas apresenta um complexo de partículas que deve ser removido para que fique nas condições ideais de cristalização. Foram utilizadas também outras técnicas para tentar alcançar a solubilidade da proteína expressa: abaixando a temperatura... / The experiments performed were, the production of cDNA using anti-sense primers and purified RNA, amplification of the gene encoding the 25K protein of Cole latent virus (CoLV25K), purification of the amplified fragment, cloning in multiplication vector pGEM-T for cell transformation into competent Escherichia coli strain TOP 10, vector purification, enzymatic digestion using the enzymes Bam HI and Hind III, subcloning in expression vector pET28a, transformation into competent cells of E. coli strain BL21-RIL, sequencing of the gene cloned into the expression vector and protein expression at 37 o C. When expressed at 37 °C, the protein with a molecular mass of 25 kDa was detected in inclusion bodies. Thus, the protein was purified under denaturing conditions (using 8 M urea) and subjected to dialysis to stimulate refolding. After refolding, the protein was concentrated to approximately 3 mg / mL and the circular dichroism assay was performed to verify the content of secondary structure, and dynamic light scattering, to estimate the size distribution of particle populations which are present in solution. The data from the deconvolution of circular dichroism experiments indicate a percentage of 40-46% α-helix, 12-14% β-sheet, 15-22% turns and 24-28% of other structures, indicating a structured protein; and the data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable, monodispersive, but forms a large complex of particles which must be separated to before crystallization experiments. Other techniques were used to solubilize the expressed protein: lowering the temperature of expression to 18 °C, using the method... (Complete abstract click electronic access below)