En aquest treball es caracteritzen les proteïnes espermàtiques bàsiques (PEB) que condensen el DNA de l'espermatozoide de diferents grups de deuteròstoms, tant procordats (tunicats o urocordats i cefalocordats) com vertebrats (agnats, peixos cartilaginosos i peixos ossis), fent especial èmfasi en el cas dels peixos ossis. L'objecte d'aquesta anàlisi ha estat l'intent d'obtenir més informació sobre l'evolució molecular de les PEB en els deuteròstoms, ja que no hi havia informació fins al moment referent als urocordats, cefalocordats i agnats.Concretament, dins dels tunicats s'han estudiat extensivament dues espècies del gènere Styela (classe Ascidiacea) així com 7 espècies més pertanyents també a aquesta classe i una pertanyent a la classe Thaliacea. Els resultats mostren que la PEB característica dels ascidiads és la proteïna que hem anomenat PI, apareixent en el gènere Styela una proteïna específica adicional P2. Aquestes proteïnes (PI, P2), malgrat ser totes dues altament bàsiques (50-70%), presenten característiques diferents tant en la mida, mobilitat electroforètica, composició i estructura. L'estudi de la PI à'Styela alicata mostra que es tracta d'una proteïna relacionada amb la histona HI o proteïnes afins; així presenta un nucli resistent a la tripsina la composició aminoacídica del qual és molt similar al d'aquesta família de proteïnes. Igualment, l'estudi de la seqüència parcial d'aquesta proteïna (extrem N-terminal, zona globular central i part de l'extrem C-terminal) mostra una estreta relació entre ambdós tipus de proteïnes. Una peculiaritat de la PI és el presentar un braç Nterminal extraordinàriament reduït, consistent només en dues arginines. Per la seva banda, la P2 es mostra com una molècula més especialitzada, de mida menor, menor diversitat aminoacídica i major basicitat (per un major acúmul d'Arg). La composició de la P2 recorda molt la de la PI, fet que fa pensar en un possible origen d'aquesta proteïna a partir de la PI.L'única espècie estudiada d'entre els cefalocordats, Branchiostoma floridae, mostra al nucli del seu espermatozoide una proteïna molt especialitzada que substitueix pràcticament la totalitat de les histones al llarg de l'espermiogènesi. Aquesta proteïna consta només de 6 tipus diferents d'aminoàcids destacant-ne els aminoàcids bàsics (24.7% de Lys, 25.3% d'Arg). Hem estudiat la seqüència aminoacídica parcial de l'extrem N-terminal d'aquesta proteïna descobrint la presència del motiu alternant Arg-Ser (que es troba també en altres PEB de grups no relacionats).Durant l'espermiogènesi de Petromyzon marinus (agnat cefalaspidomorf) les histones no es veuen substituïdes per cap altra proteïna específica de l'espermatozoide sinó que es mantenen com a úniques proteïnes responsables de la condensació de la cromatina del nucli espermàtic.Dins dels peixos cartilaginosos, hem estudiat les PEB d'Hydrolagus colliei (condricti de la línia dels holocèfals) i hem vist que malgrat el "model" de contingut de proteïnes espermàtiques bàsiques és el mateix (una proteïna no queratinosa més dues de queratinoses), les característiques de les molècules en sí difereixen substancialment. Així, l'estudi de la seqüència parcial de la proteïna no queratinosa R3 d'aquesta espècie mostra diferències importants respecte a la corresponent proteïna trobada als elasmobranquis i amb la protamina típica dels peixos ossis, amb qui sovint se l'ha relacionada.Entre els osteïctis hem estudiat les PEB de 32 espècies representants de 24 famílies corresponents a 9 ordres diferents de teleostis. Es disposa de la caracterització electroferètica de totes, l'anàlisi composicional de 16, i s'han estudiat les estructures primàries de dues espècies més. En aquest grup hem trobat una gran varietat de continguts de proteïnes espermàtiques bàsiques: a) protamines típiques; b) histones sense cap altra proteïna addicional; c) histones somàtiques amb un increment de l'Hi; d) histones amb proteïnes específiques addicionals; e) proteïnes específiques diferents de les protamines típiques (però que també substitueixen les histones). La distribució d'aquests diferents tipus de continguts no mostra una relació amb la classificació filogenètica de les espècies implicades (no obstant, el model de PEB presentat és consistent dins de cada família). Tenint en compte aquesta distribució, així com consideracions de tipus funcional, es discuteixen les posibles explicacions d'aquesta "esporadicitat" observada.Hem seqüenciat les PEB de dos peixos representants dels dos casos generals de substitució de les histones al nucli espermàtic que hem trobat. Així, hem seqüenciat completament la PEB de Dicentrarchus labrax (protamina típica) i parcialment la de Mullus surmuletus (proteïna específica de l'espermatozoide diferent de les protamines típiques). Aquesta última proteïna es mostra relacionada amb la família de les histones HI o afins. Així, consta d'uns extrems N i C-terminals enriquits en aminoàcids bàsics i una zona central resistent a la tripsina on s'acumulen els residus hidrofòbics. Tant l'anàlisi de la seva estructura primària parcial (extrem N-terminal, zona globular i part de l'extrem C-terminal) com de l'estructura secundària predida mostren una gran similitud amb les corresponents de les histones HI, especialment en la zona globular central, que és el domini més conservat en les His.Hem classificat les diferents PEB trobades als grups estudiats en dos tipus generals de molècules: a) proteïnes relacionades amb histones (generalment l'Hi); i b) proteïnes especialitzades. Les primeres correspondrien a molècules grans amb una zona més hidrofòbica resistent a la tripsinització, i un o dos extrems molt bàsics i no resistents (ex. PI dels ascidiacis, PEB del Mullus ï altres proteïnes específiques addicionals trobades en peixos ossis). Les molècules que anomenem especialitzades correspondrien a proteïnes menors i amb baixa proporció o sense aminoàcids hidrofòbics, sent l'Arg i la Lys els aminoàcids que constitueixen la major part de la molècula (ex. P2 d'Sty ela, P de l'amfiox, R3 d'H. colliei, protamines típiques dels peixos ossis).No sembla existir una relació d'homologia entre les proteïnes bàsiques del nucli de l'espermatozoide trobades en cada un dels grups de deuteròstoms estudiats sinó que més aviat es tracta de solucions a un mateix problema adoptades amb independència (encara que per camins similars en alguns casos).

La nucleoplasmina (NP) és la proteïna majoritària del nucli dels oòcits i ous no fecundats de la granota "Xenopus laevis" i altres amfibis. Es tracta d'una proteïna acídica amb tres trams acídics principals (A1, A2, A3). La NP participa en la remodelació de la cromatina durant la fecundació, mediatitzant la descondensació de la cromatina espermàtica i facilitant l'acoblament de nucleosomes gràcies a la seva funció de xaperona molecular. En el decurs d'aquest treball s'ha continuat l'estudi dels diferents recombinants de la NP de què disposem, posant especial èmfasi en la forma mutant r-NP142, que es caracteritza pel fet que té el tram acídic principal A2 molt exposat. Interessava determinar la influència de diferents condicions en l'estabilitat i el grau de pentamerització de la molècula. En aquesta mateixa línia es va estudiar el paper de les Cys de la NP en la pentamerització. Mitjançant mutagènesi dirigida es van substituir les Cys per Ser i es va observar que concretament la mutació de la Cys 45 afavoria la monomerització de la forma r-NP142, però no afectava l'oligomerització de les formes r-NP i r-NP121, les quals romanien pentamèriques. Aquests resultats suggereixen que no hi hauria ponts disofre en l'estructura pentamèrica de la nucleoplasmina. La caracterització estructural de la nucleoplasmina es va intentar abordar a diferents nivells. A nivell de l'estructura secundària, es van utilitzar tècniques de dicroisme circular. Concretament es va determinar que el mutant r-NP142 C45S tenia una estructura plegada a l'atzar (random coil). D'altra banda, per a ordres estructurals superiors es van utilitzar tècniques de microscòpia electrònica i tècniques cristal·logràfiques. Un altre objectiu d'aquest treball va ser la caracterització de les interaccions de l'NP amb histones del nucli del nucleosoma. Estàvem especialment interessats a veure si la interacció NP-histones era fonamentalment de tipus electrostàtic o bé podria tractar-se d'algun altre tipus d'interacció. Mitjançant ultracentrifugació analítica i gradients de sacarosa es va poder determinar que la NP podia unir els quatre tipus d'histones nucleosòmiques. Aquesta unió tindria una estequiometria corresponent a 1 mol de pentàmer de NP per mol d'octàmer d'histones. Cal destacar que la NP pot unir també histones tripsinitzades (sense les cues bàsiques) mantenint la mateixa estequiometria que per al cas de les histones natives. Així mateix, la forma r-NP121 (sense el tram acídic A2) és capaç d'unir histones natives amb la mateixa estequiometria descrita per als casos anteriors. Aquests experiments indiquen que la interacció NP-histones no seria predominantment electrostàtica. Un altra línia de treball va ser estudiar la presència o no d'una NP-like a l'extracte d'oòcits de l'estrella de mar "Echinaster sepositus". S'ha trobat una proteïna majoritària que presenta les propietats de ser termoestable, acídica i parcialment resistent al sulfat amònic. Aquesta proteïna és reconeguda pels anticossos policlonals antinucleoplasmina obtinguts en ous de gallina. D'altra banda, no és capaç de descondensar nuclis espermàtics que contenen protamina.El darrer objectiu del treball va ser l'estudi estructural de la proteïna ?0. La ?0 és específica del nucli espermàtic de l'equinoderm "Holothuria tubulosa" i presenta propietats intermèdies entre les protamines i les histones. La cristal·lització d'una molècula d'aquestes característiques aportaria informació sobre l'estructura de les proteïnes que participen en la compactació de la cromatina i podria obrir un nou camí per a la cristal·lització de les protamines i dels complexos NP-protamina. / Nucleoplasmin (NP) is the most abundant protein found in the nuclei of oocytes and nonfertilized eggs of "Xenopus laevis" and other amphibians. It is an acidic protein with three main acidic tracts (A1, A2, A3). NP is involved in the remodelation of chromatin during fecundation, facilitating nucleosome assembly as a molecular chaperone.In the present work we have continued the study of different recombinant forms of nucleoplasmin which were obtained in our lab, specially the form r-NP142 which has the main acidic tract A2 very exposed. We were interested in how different conditions could affect the stability and pentamerization of the molecule. In this way we studied the importance of Cys in NP pentamerization. We used site directed mutagenesis in order to change Cys for Ser. We observed that the mutation of Cys 45 favoured the monomerization of r-NP142, but this change didn't affect the oligomerization of the forms r-NP and r-NP121, which remained pentameric. These results suggest the absence of disulfide bridges in the pentameric structure of nucleoplasmin. The structural characterization of nucleoplasmin has been studied at different levels. At the secondary structure level we have used circular dichroism techniques and we have determined that the mutant r-NP142 C45S is in random coil conformation. For higher structural levels we have used electron microscopy and crystallographic techniques.Another objective of this work was the characterization of the interactions between NP and nucleosomal core histones. We were specially interested in knowing if the interaction was fundamentally electrostatic. Using analytical ultracentrifugation and sucrose gradient experiments we could determine that NP can bind the four types of nucleosomal histones. This binding would have an stoichiometry equal to 1 mol of NP pentamer per mol of histone octamer. It is important to note that NP can bind trypsinated histones (without the basic tails) maintaining the same stoichiometry as in the case of native histones. In the same way, the r-NP121 form (without the acidic tract A2) is capable of binding native histones with the same stoichiometry described for the other cases. These result indicates that the interaction NP-histones is not mainly electrostaticaly driven.Another objective of this work was the study of the presence of some NP-like proteins in oocyte extracts of the starfish "Echinaster sepositus". We have found a very abundant protein which is termoestable, acidic and partially resistant to ammonium sulphate. This protein is recognized by policlonal antinucleoplasmin antibodies which were obtained in hen eggs. However, it is not able to decondense spermatic nuclei which contain protamine.The last objective of the present work was the structural study of the protein ?0 which is specific of the nuclei of the echinoderm "Holothuria tubulosa" and has intermediate properties between histones and protamines. The crystallization of a molecule like ?0 could bring information about the structure of proteins that participate in chromatin condensation and could offer a new way for the crystallization of protamines and NP-protamine complexes.