Protein phosphorylation constitutes an important mechanism for cellular regulation in both Eucarya and Bacteria. All living organisms evolved from a common progenitor; this implies that protein phosphorylation as a means of regulation also exists in Archaea. Previously, in the sulfur-dependent archaeon Sulfolobus solfataricus a gene was cloned encoding a protein-serine/threonine phosphatase that was similar to eucaryal protein-serine/threonine phosphatases type 1, 2A, and 2B. To identify protein phosphatases in other archaeons, oligonucleotides encoding conserved regions of eucaryal protein-serine/threonine phosphatases were used in the polymerase chain reaction to amplify genomic DNA from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. From the PCR reaction a fragment of DNA was isolated that encoded a portion of a protein phosphatase. Using this DNA fragment as a probe, the entire phosphatase gene was isolated. The amino acid sequence of the phosphatase encoded by this gene displayed greater than 30% identity with eucaryal protein-serine/threonine phosphatase type 1. The gene encoding the Methanosarcina phosphatase was expressed in Escherichia coli. The expressed protein exhibited protein serine phosphatase activity that was sensitive to inhibitors of eucaryal phosphatases such as okadaic acid, microcystin, calyculin, and tautomycin. In order to identify potential endogenous substrates of archaeal protein-serine/threonine phosphatases and kinases, a study was initiated to characterize the most prominent phosphoproteins in S. solfataricus. Cell extracts were incubated with [γ-³²P] ATP, MgCl₂, and MnCl₂, and the proteins in the extracts were separated by SDS-PAGE. Autoradiography of the gels revealed four prominent phosphoproteins with apparent molecular masses of 35, 46, and 50 kDa. N-terminal sequence analysis and enzymatic assays of the 35 kDa phosphoprotein identified this phosphoprotein as the a-subunit of succinyl-CoA synthetase. N-terminal sequence analysis and enzymatic assays revealed that the 50 kDa phosphoprotein was a hexosephosphate mutase. Neither the 50 kDa nor the 35 kDa phosphoprotein appeared to be the target of protein kinases or phosphatases. Therefore, while protein-serine phosphatases exist in Archaea, the targets of these phosphatases have yet to be determined. / Ph. D.

A proteína serina/treonina fosfatase do tipo 1 (PP1) é a principal serina/treonina fosfatase envolvida na regulação de diversos processos tais como metabolismo, crescimento e divisão celular, síntese protéica e processamento de RNA. A holoenzima PP1 é constituída de uma subunidade catalítica conservada (PP1c) e subunidades reguladoras variáveis. Em mamíferos já foram identificados dezenas de polipeptídeos que associam-se direta ou indiretamente a PP1c, gerando holoenzimas com localizações celulares e especificidades distintas. Entre as proteínas que se associam a PP1c, muitas têm função inibitória como o inibidor-1 (I-1) e o inibidor-2 (I-2). A partir de extratos de micélios de Neurospora crassa foi purificada uma proteína, denominada INc-1, que atua in vitro como inibidor da atividade de fosforilase fosfatase de PP1c e constitui-se no primeiro exemplo de subunidade reguladora da PP1 descrito em fungos filamentosos. INc-1 apresenta diversas características bioquímicas comuns ao I-2 de mamíferos. Seqüências parciais de aminoácidos de três fragmentos proteolíticos obtidos de INc-1 permitiram a identificação de uma ORF (fase aberta de leitura) no genoma de N. crassa que provavelmente codifica INc-1. A análise dessa ORF mostrou que a sequência de aminoácidos do INc-1 é similar a do I-2, especialmente em regiões supostamente envolvidas em sua interação com a PP1c. Neste trabalho descrevemos a clonagem e a expressão em bactérias da sequência codificadora de INc-1. A atividade inibidora de PP1c de duas isoformas recombinantes purificadas, INc-1L e INc-1, foram avaliadas e comparadas. A forma denominada INc-1L apresenta em sua região aminoterminal um segmento de 38 aminoácidos derivado da retenção de um íntron, sem alterar a fase de leitura. Ambas proteínas recombinantes exibiram efeito inibidor sobre a atividade de fosforilase fosfatase de PP1c recombinante, sendo que a IC50 determinada para INc-1L foi de ~50nM e para INc-1 foi de ~11nM, sugerindo que a retenção do segmento de aminoácidos codificado pelo íntron na isoforma INc-1L diminui seu potencial inibitório. Verificamos também que o mRNA de INc-1 é expresso durante o crescimento vegetativo de N.crassa, apresentando níveis máximos na fase exponencial. / Type 1 protein serine/threonine phosphatases (PP1) play important roles in the regulation of many cellular functions including metabolism, cell growth and division, protein synthesis and pre-mRNA splicing. PP1 holoenzyme consists of one highly conserved catalytic subunit (PP1c) and variable regulatory subunits. A number of proteins that interact with PP1c have been described in mammals and the respective holoenzymes present distinct substrate specificity and/or different subcelular localization. Among the proteins that interact with PP1c, there are many with inhibitory effect such as inhibitor-1 (I-1) and inhibitor-2 (1-2). It has been demonstrated that a protein denominated INc-1, purified from Neurospora crassa extracts, specifically inhibits PP1c and has biochemical properties that resemble those of mammalian I-2. INc-1 is the first example of a PP1c regulatory subunit in filamentous fungi. Partial amino acid sequences of INc-1 led to the identification of an ORF (open reading frame) in Neurospora crassa genome which appears to encode INc-1. This ORF shows similarity with mammalian I-2 mainly in regions mapped as sites for interaction with PP1c. In this work we report the cloning and bacterial expression of the coding sequence for INc-1. The PP1c inhibitory activities of two recombinant isoforms, named INc-1L and INc-1, were compared. INc-1L aminoacid sequence presents an in frame segment of 38 residues encoded by an non-processed intron. 80th recombinant proteins showed inhibitory effect against phosphorylase phosphatase activity of recombinant PP1c, with IC50 of ~50nM for INc-1L and ~11nM for INc-1, suggesting that retention of the 38 residue segment decrease the inhibitory potential of INc-1L. We have also verified that INc-1 mRNA is expressed during N.crassa vegetative growth with maximum level at the exponential phase.

A proteína serina/treonina fosfatase do tipo 1 (PP1) é a principal serina/treonina fosfatase envolvida na regulação de diversos processos tais como metabolismo, crescimento e divisão celular, síntese protéica e processamento de RNA. A holoenzima PP1 é constituída de uma subunidade catalítica conservada (PP1c) e subunidades reguladoras variáveis. Em mamíferos já foram identificados dezenas de polipeptídeos que associam-se direta ou indiretamente a PP1c, gerando holoenzimas com localizações celulares e especificidades distintas. Entre as proteínas que se associam a PP1c, muitas têm função inibitória como o inibidor-1 (I-1) e o inibidor-2 (I-2). A partir de extratos de micélios de Neurospora crassa foi purificada uma proteína, denominada INc-1, que atua in vitro como inibidor da atividade de fosforilase fosfatase de PP1c e constitui-se no primeiro exemplo de subunidade reguladora da PP1 descrito em fungos filamentosos. INc-1 apresenta diversas características bioquímicas comuns ao I-2 de mamíferos. Seqüências parciais de aminoácidos de três fragmentos proteolíticos obtidos de INc-1 permitiram a identificação de uma ORF (fase aberta de leitura) no genoma de N. crassa que provavelmente codifica INc-1. A análise dessa ORF mostrou que a sequência de aminoácidos do INc-1 é similar a do I-2, especialmente em regiões supostamente envolvidas em sua interação com a PP1c. Neste trabalho descrevemos a clonagem e a expressão em bactérias da sequência codificadora de INc-1. A atividade inibidora de PP1c de duas isoformas recombinantes purificadas, INc-1L e INc-1, foram avaliadas e comparadas. A forma denominada INc-1L apresenta em sua região aminoterminal um segmento de 38 aminoácidos derivado da retenção de um íntron, sem alterar a fase de leitura. Ambas proteínas recombinantes exibiram efeito inibidor sobre a atividade de fosforilase fosfatase de PP1c recombinante, sendo que a IC50 determinada para INc-1L foi de ~50nM e para INc-1 foi de ~11nM, sugerindo que a retenção do segmento de aminoácidos codificado pelo íntron na isoforma INc-1L diminui seu potencial inibitório. Verificamos também que o mRNA de INc-1 é expresso durante o crescimento vegetativo de N.crassa, apresentando níveis máximos na fase exponencial. / Type 1 protein serine/threonine phosphatases (PP1) play important roles in the regulation of many cellular functions including metabolism, cell growth and division, protein synthesis and pre-mRNA splicing. PP1 holoenzyme consists of one highly conserved catalytic subunit (PP1c) and variable regulatory subunits. A number of proteins that interact with PP1c have been described in mammals and the respective holoenzymes present distinct substrate specificity and/or different subcelular localization. Among the proteins that interact with PP1c, there are many with inhibitory effect such as inhibitor-1 (I-1) and inhibitor-2 (1-2). It has been demonstrated that a protein denominated INc-1, purified from Neurospora crassa extracts, specifically inhibits PP1c and has biochemical properties that resemble those of mammalian I-2. INc-1 is the first example of a PP1c regulatory subunit in filamentous fungi. Partial amino acid sequences of INc-1 led to the identification of an ORF (open reading frame) in Neurospora crassa genome which appears to encode INc-1. This ORF shows similarity with mammalian I-2 mainly in regions mapped as sites for interaction with PP1c. In this work we report the cloning and bacterial expression of the coding sequence for INc-1. The PP1c inhibitory activities of two recombinant isoforms, named INc-1L and INc-1, were compared. INc-1L aminoacid sequence presents an in frame segment of 38 residues encoded by an non-processed intron. 80th recombinant proteins showed inhibitory effect against phosphorylase phosphatase activity of recombinant PP1c, with IC50 of ~50nM for INc-1L and ~11nM for INc-1, suggesting that retention of the 38 residue segment decrease the inhibitory potential of INc-1L. We have also verified that INc-1 mRNA is expressed during N.crassa vegetative growth with maximum level at the exponential phase.