Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2002. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format.

Zugl.: Düsseldorf, Univ., Diss., 2008

Stuttgart, Univ., Diss., 2008.

Würzburg, Univ., Diss., 2005.

München, Techn. Univ., Diss., 2003.

München, Techn. Universiẗat, Diss., 2002.

Universiẗat, Diss., 2003--Heidelberg.

RS1, ein Genprodukt von RSC1A1, ist entscheidend an der zelldichteabhängigen transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 in LLC-PK1 Zellen und an der post-transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 im Dünndarm beteiligt. RS1 hemmt die Freigabe von SGLT1 enthaltenden Vesikeln aus dem trans-Golgi Netzwerk und wandert in den Zellkern wo es die Transkription von SGLT1 inhibiert. In der vorliegenden Arbeit identifizierten wir eine neuartige 21 Aminosäuren lange nicht-konventionelle Kernlokalisierungssequenz (RS1 NLS) in RS1 vom Schwein (pRS1), die für die Kernlokalisierung von pRS1 nötig und ausreichend ist. RS1 NLS ist von zwei Konsensussequenzen für Phosphorylierung umrahmt, welche für die konfluenzabhängige Regulierung von RS1 NLS verantwortlich sind: Eine Stelle für Casein Kinase 2 (CK2) in der Position 348 und eine Stelle für Protein Kinase C (PKC) in der Position 370. Es wurde eine konfluenz-abhängige Kernlokalisierung mit den Aminosäuren 342-374 (R-NLS-Reg) beobachtet. Die Mutationsanalyse deutete darauf hin, dass Kernlokalisierung durch die Phosphorylierung von Serin 370 (PKC) geblockt wird, und dass die Phosphorylierung von Serin 348 (CK2) die Phosphorylierung von Serin 370 verhindert. Da während der Konfluenz CK2 herunterreguliert und PKC hochreguliert wird, deuten unsere Daten darauf hin, dass die Kernlokalisierung die zelldichteabhängigen Veränderungen in der transkriptionellen und posttranskriptionellen Hemmung von SGLT1 Expression koordiniert. / RS1, a gene product of RSC1A1, is critically involved in cell density-dependent transcriptional down-regulation of SGLT1 in LLC-PK1 cells and in the post-transcriptional down-regulation of SGLT1 in small intestine. RS1 inhibits the release of SGLT1 containing vesicles from the trans-Golgi network and migrates into the nucleus where it inhibits transcription of SGLT1. In the present work we identified a novel 21 amino acids-long nonconventional nuclear localization sequence (RS1 NLS) in porcine RS1 (pRS1) that is necessary and sufficient for nuclear targeting of pRS1. RS1 NLS is framed by two consensus sequences for phosphorylation which are responsible for confluence-dependent regulation of RS1 NLS: a casein kinase 2 (CK2) site in position 348 and a protein kinase C (PKC) site in position 370. Confluence-dependent nuclear targeting was observed with amino acids 342-374 (R-NLS-Reg). Mutation analysis suggested that nuclear targeting is blocked by phosphorylation of serine 370 (PKC) and that phosphorylation of serine 348 (CK2) prevents phosphorylation of serine 370. Because CK2 is down-regulated and PKC is up-regulated during confluence of LLC-PK1 cells, our data suggest that nuclear localization coordinates cell density-dependent changes in transcriptional and post-transcriptional inhibition of SGLT1 expression.

Protein kinase B (PKB), a serine threonine kinase, is highly involved in the regulation of cellular proliferation and survival. To characterize PKB’s function in lymphocyte development and activation, transgenic (tg) mice that express a membrane targeted constitutively active form of PKBa (myr PKB) in T and B cells were analysed. Thymocytes from myr PKB tg mice showed enhanced proliferation after T cell receptor (TCR) engagement compared to wild type (wt) mice. Astonishingly, myr PKB tg thymocytes were capable to proliferate in response to PMA only and were also less sensitive to inhibition by the calcineurin inhibitors CsA or FK506, which indicates the proliferative response of myr PKB tg T cells is relatively independent of calcium mobilisation and calcineurin activity. In addition, when TCR signalling was inhibited by the MEKinase inhibitor PD98059 or the Srckinase inhibitor PP1 myr PKB tg thymocytes again were more resistant to inhibition. Western blot analysis revealed myr PKB enhances activation of the kinases Lck, Raf and Erk after TCR/CD3 stimulation. Thus, myr PKB renders proliferative responses of thymocytes more sensitive to TCR signals by positive regulation of the Lck-Raf-MEK-Erk signalling pathway. Studies on the cellular location of the tg protein showed myr PKB is located in membrane socalled “lipid rafts”. Furthermore, we found that after TCR/CD3 ligation endogenous cytoplasmic PKB moves into “lipid rafts”, which highlights PKB as a crucial mediator of TCR proximal signalling events. Analysing three different TCR tg model systems for positive and negative selection of immature precursors in the thymus, we found myr PKB promotes positive selection of CD4+ but not CD8+ T cells. This most likely results from PKB’s positive cross-talk on Lck-Raf-Erk signalling, which is known to influence thymocyte selection and CD4/CD8-lineage choice. Furthermore, myr PKB enhances phosphorylation of glycogen synthase kinase 3 (GSK3), a negative regulator of the transcription factor NFAT (nuclear factor of activated T cells) and T cell activation, and of the adapter protein c-Cbl. Concerning negative selection, myr PKB enhanced (OT1 mice), reduced (HY mice) or had no influence (OT2 mice) on negative selection. Thus, myr PKB’s effect on negative selection strongly depends on the model system analysed and this most likely results from differences in TCR affinity/avidity and TCR specificity for MHC. 106 Peripheral CD4+ T cells from myr PKB tg mice showed enhanced production of both Th1 and Th2 cytokines. Furthermore, after TCR/CD3 stimulation in the presence of TGF-b1, wt CD4+ T cells showed a drastic inhibition of proliferation, whereas myr PKB tg CD4+ T cells proliferated even better, i.e. they were resistant to the inhibitory TGF-b1 signals. Expression of myr PKB in B cells leads to reduced Ca2+ flux and proliferation after BCR stimulation, but activation of Lyn, SLP-65, c-Cbl and GSK-3 were enhanced. When we analysed B cell subsets in myr PKB tg mice, a decrease in immature and mature B cells became obvious, whereas cell numbers for marginal zone (MZ) B cells were normal. In aged myr PKB tg mice we detected a very strong reduction of pro/pre and immature B cell populations in the bone marrow, indicating PKB is very important for maintenance of B cell development. Furthermore, myr PKB also lead to a strong reduction of peritoneal B-1 cells. However, expression of NFATc1, which is required for B-1 cell development, was comparable between wt and myr PKB tg B-1 cells. To analyse the effect of myr PKB on immunoglobulin production, mice were immunized with thymus dependent (TD) and independent (TI) antigens. In both cases, B cell responses were strongly elevated in myr PKB tg mice. Finally, RT-PCR analyses of in vitro expanded B cells revealed increased Blimp-1 and Notch3 expression in myr PKB tg B cells, which might be primary candidates involved in their enhanced effector function. In summary, this study clearly shows an important cross-talk between PKB and various critical signalling molecules downstream of the TCR and BCR. Thereby active PKB modulates and regulates the thresholds for thymocyte selection and T cell activation as well as for B cell development and function. / Proteinkinase B (PKB), eine Serin-Threonin Kinase, spielt bei der Regulation der Proliferation und des Überlebens vieler Zelltypen eine wichtige Rolle ein. Um die Funktion von PKB bei der Reifung und Aktivierung von Lymphozyten zu verstehen, wurden transgene (tg) Mäuse analysiert, die eine konstitutiv-aktive, myristoylierte Form der PKBa (myr PKB) in der T- und B-Zelllinie exprimieren. Thymozyten von myr PKB tg Mäusen zeigten im Vergleich zu wildtypischen (wt) Mäusen nach T-Zell-Rezeptor (TZR)-Stimulation eine deutlich erhöhte Proliferation. Myr PKB tg Thymozyten konnten zudem nur durch PMA zur Proliferation angeregt werden und waren auch weniger sensitiv gegenüber Inhibition durch die Calcineurin-Inhibitoren CsA und FK506. Dies weist darauf hin, dass die Aktivierung von T Zellen der myr PKB tg Mäuse relativ unabhängig von der Calcium-Mobilisierung und der Calcineurin-Aktivität ist. Wurde die TZR-Signalübertragung durch MEKinase-Inhibitor PD98059 oder den Src-Kinase- Inhibitor PP1 blockiert, so waren myr PKB tg Thymozyten wiederum sehr viel schlechter inhibierbar als wt Thymoyzten. Western-Blot-Analysen zeigten sodann, dass myr PKB nach TZR/CD3-Stimulation die Aktivierung der Kinasen Lck, Raf und Erk verstärkt. Somit führt aktive PKB über die positive Regulation des Lck-Raf-Mek-Erk Signalwegs zu einer erhöhten TZR-Sensitivität. Weiterhin verstärkt myr PKB die Phosporylierung der Glykogen Synthase Kinase 3 (GSK3), ein negativer Regulator des Transkriptionsfaktors NFAT (Nucleärer Faktor Aktivierter TZellen) und der T-Zell-Aktivierung sowie des Adaptorproteins c-Cbl. Unsere Untersuchungen zur zellulären Lokalisation von myr PKB ergaben, dass myr PKB in den sog. „lipid rafts“ der Membran lokalisiert ist. Weiterhin konnten wir zeigen, dass endogene cytoplasmatische PKB nach TZR/CD3-Stimulation in diese „lipid rafts“ wandert. Diese Daten weisen auf eine profunde Rolle von aktiver PKB bei der frühen und proximalen TZR-Signalübertragung hin. Die Analysen drei verschiedener TZR-tg Modellsysteme zur Selektion von unreifen TZellvorläufern im Thymus zeigten, dass myr PKB die positive Selektion von CD4+ aber nicht von CD8+ T-Zellen fördert. Dies resultiert sehr wahrscheinlich aus der positiven Regulation des Lck-Raf-Erk Signalweges, welcher ein zentraler Regulator der Thymozytenselektion und CD4/CD8-Linienentscheidung ist. Was den Einfluss von myr PKB auf die negative Selektion 108 betrifft, so verstärkte (OT1-Mäuse), verminderte (HY-Mäuse) oder hatte diese keinen Effekt (OT2-Mäuse). Die Effekte von myr PKB auf die negative Selektion sind daher stark abhängig vom Modellsystem, d.h. von der TZR-Affinität/Avidität und der Spezifität der TZRs für MHC-Moleküle. Periphere CD4+ T-Zellen von myr PKB tg Mäusen wiesen eine erhöhte Produktion von sowohl Th1- als auch Th2-Cytokinen auf. Erstaunlicherweise führte TZR/CD3-Stimulation in Anwesenheit von inhibitorischen TGF-b1-Signalen, ganz im Gegensatz zu wt T-Zellen, in myr PKB tg CD4+ T Zellen zu keiner Inhibition der Expansion, sondern sie proliferierten sogar stärker. Dies könnte mit der beobachteten erhöhten Zytokinproduktion von IL-2 und IFNg und/oder der erhöhten Phosphorylierung der Smad2/3 Proteine in myr PKB tg CD4+ T Zellen in Verbindung stehen. Die Expression von myr PKB in B-Zellen führte zu reduziertem Calcium-Flux und reduzierter Proliferation, wobei jedoch eine verstärkte Aktivierung von Lyn, SLP-65, c-Cbl und GSK-3 nachgewiesen werden konnte. Die Analyse der B-Zell-Populationen der myr PKB tg Mäuse zeigte eine Abnahme der unreifen und reifen B-Zellen in der Milz, jedoch war die Anzahl der Marginalzonen (MZ)-B-Zellen normal. Interessanterweise führte myr PKB zu einer sehr starken Reduktion peritonealer B-1-Zellen. Die Expression von NFATc1, welcher für die Entwicklung von B-1-Zellen benötig wird, war jedoch in den B-1-Zellpopulationen von wt und myr PKB tg Mäusen durchaus vergleichbar. Ältere myr PKB tg Mäuse zeigten einen starken Verlust der pro-/prä- und unreifen B-Zellen des Knochenmarks. Dies weist stark darauf hin, dass PKB für die Aufrechterhaltung der BZellentwicklung entscheidend ist. Darüber hinaus war, obgleich reduzierter B-Zellen, die Immunantwort auf Thymus-abhängige (TD) und –unabhängige (TI) Antigene in myr PKB tg Mäusen verstärkt. In RT-PCR Analysen von in vitro expandierten B-Zellen wurde sodann eine erhöhte Expression von Blimp-1 und Notch3 beobachtet, die zu der erhöhten Immunglobulin-Produktion der myrPKB tg B-Zellen beisteuern könnte. Zusammenfassend zeigen diese Arbeiten, dass aktive PKB die Expression/Aktivität zahlreicher wichtiger Signalmoleküle der TZR- und BZR-induzierten Signalleitung reguliert und somit die Schwellenwerte für die Selektion und Aktivierung von T-Zellen sowie für die Entwicklung und Funktion von B-Zellen entscheidend moduliert.

Adaptation to alterations in nutrient availability ensures the survival of organisms. In vertebrates, adipocytes play a decisive role in this process due to their ability to store large amounts of excess nutrients and release them in times of food deprivation. In todays western world, a rather unlimited excess of nutrients leads to high-caloric food consumption in humans. Nutrient overload together with a decreased energy dissipation result in obesity as well as associated diseases such as insulin resistance, diabetes, and liver steatosis. Obesity causes a hormonal imbalance, which in combination with altered nutrient levels can aberrantly activate G-protein coupled receptors utilizing diacylglycerol (DAG) as secondary messenger. Protein kinase D (PKD) 1 is a DAG effector integrating multiple hormonal and nutritional inputs. Nevertheless, its physiological role in adipocytes has not been investigated so far. In this thesis, evidence is provided that the deletion of PKD1 in adipocytes suppresses lipogenesis as well as the accumulation of triglycerides. Furthermore, PKD1 depletion results in increased mitochondrial biogenesis as well as decoupling activity. Moreover, PKD1 deletion promotes the expression of the β3-adrenergic receptor (ADRB3) in a CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP)-α and δ-dependent manner. This results in elevated expression levels of beige markers in adipocytes in the presence of a β-agonist. Contrarily, adipocytes expressing a constitutive active form of PKD1 present a reversed phenotype. Additionally, PKD1 regulates adipocyte metabolism in an AMP-activated protein kinase (AMPK)-dependent manner by suppressing its activity through phosphorylation of AMPK α1/α2 subunits. Thus, PKD1 deletion results in an enhanced activity of the AMPK complex. Consistent with the in vitro findings, mice lacking PKD1 in adipocytes demonstrate a resistance to high-fat diet-induced obesity due to an elevated energy expenditure caused by trans-differentiation of white into beige adipocytes. Moreover, deletion of PKD1 in murine adipocytes improves systemic insulin sensitivity and ameliorates liver steatosis. Finally, PKD1 levels positively correlate with HOMA-IR as well as insulin levels in human subjects. Furthermore, inhibition of PKD1 in human adipocytes leads to metabolic alterations, which are comparable to the alterations seen in their murine counterparts. Taken together, these data demonstrate that PKD1 suppresses energy dissipation, drives lipogenesis, and adiposity. Therefore, increased energy dissipation induced by several complementary mechanisms upon PKD1 deletion might represent an attractive strategy to treat obesity and its related complications. / Die Anpassung an veränderte Nährstoffverfügbarkeiten sichert das Überleben eines jeden Organismus. Dabei spielen in Vertebraten vorallem Adipozyten eine entscheidende Rolle. Sie haben die Fähigkeit, große Mengen überschüssiger Nährstoffe zu speichern und diese in Zeiten des Mangels wieder freizusetzen. Heutzutage herrscht jedoch besonders in Industrieländern ein ausreichendes Angebot an Nahrungsmitteln, was zu einer übermäßigen Kalorienzufuhr einzelner Individuen führt. Durch überschüssige Energiezufuhr in Verbindung mit einem verringerten Energieverbrauch kommt es zu Fettleibigkeit und damit verbundenen Erkrankungen wie Insulinresistenz, Diabetes und nichtalkoholischer Fettleber. Übergewicht führt zu einem hormonellen Ungleichgewicht, das im Zusammenhang mit veränderten Nährstoffgehalten, unter Verwendung von Diacylglycerol (DAG) als sekundären Botenstoff, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren unkontrollierten aktiviert. Protein Kinase D (PKD) 1 ist ein DAG Effektor, der an unterschiedlichsten hormonellen und ernährungsphysiologischen Vorgängen beteiligt ist. Die zugrunde liegende physiologische Rolle von PKD1 in Adipozyten ist jedoch weitgehend unverstanden. In dieser Doktorarbeit wird gezeigt, dass eine Adipozyten spezifische PKD1 Defizienz sowohl Lipogenese als auch die Akkumulation von Triglyceriden unterdrückt. Darüber hinaus wird durch die Deletion von PKD1 sowohl der Mitochondriengehalt als auch die Dynamik erhöht und die Entkopplungsaktivität gesteigert. Zudem wird die Expression des β3-adrenergen Rezeptors (ADRB3) durch die PKD1 Defizienz in einer CCAAT/Enhancer-Bindungsprotein (C/EBP) -α und δ-abhängigen Weise gefördert. In Gegenwart eines β-Agonisten kommt es dadurch zu einer erhöhten Expression von Genen, die auf beige Fettzellen hindeuten. Im Gegensatz dazu weisen Adipozyten, die eine konstitutiv aktive Form von PKD1 exprimieren, einen umgekehrten Phänotyp auf. Zusätzlich reguliert PKD1 den Adipozytenmetabolismus abhängig von AMP-aktivierter Proteinkinase (AMPK). PKD1 unterdrückt die AMPK-Aktivität durch Phosphorylierung von AMPK-α1/α2-Untereinheiten. Daher steigert die PKD1-Deletion die Tätigkeit des AMPK-Komplexes. In Übereinstimmung mit den In-vitro-Daten zeigen Mäuse, denen PKD1 in Adipozyten fehlt, eine Resistenz gegen nahrungsinduzierte Fettleibigkeit. Dies lässt sich durch eine gesteigerte Transdifferenzierung von weißen zu beigen Fettzellen erklären, die einen erhöhten Energieumsatz aufweisen. Weiterhin verbessert die Deletion von PKD1 in Adipozyten der Maus die systemische Insulinsensitivität und schützt vor einer Lebersteatose. In humanen Fettzellen zeigen sich ähnliche Veränderungen im Metabolismus, wie bereits in den Adipozyten der Maus beobachtet wurden. Des Weiteren korreliert die Expression von PKD1 in humanem Fettgewebe positiv mit HOMA-IR, einem Marker für Insulin-Resistenz sowie den Insulinwerten beim Menschen. Zusammengefasst weisen die Daten dieser Thesis auf, dass PKD1 den Energieverbrauch unterdrückt und sowohl Lipogenese als auch Adipositas fördert. Adipozyten, denen PKD1 fehlt, zeigen demnach einen erhöhten Energieumsatz, der durch unterschiedliche komplementäre Mechanismen verursacht wird. Dadurch könnte sich eine attraktive Strategie zur Behandlung von Fettleibigkeit und den damit verbundenen Komplikationen ergeben.