Tübingen, Univ., Diss., 2007.

In einer Beobachtungsstudie an 20 Patienten mit fokal sklerosierender und membranöser Glomerulonephritis wurde der Effekt einer Therapie mit ACE- Hemmer, Methylprednisolon und Ciclosporin A über einen Zeitraum von bis zu 10 Jahren verfolgt. Die Effektivität der genannten Therapie ist in der Literatur gut dokumentiert. Die Studie beobachtet folgende neue, bislang nicht beschriebene Ergebnisse: 1. Das Ausmaß der Proteinurie beim nephrotischen Syndrom unterliegt einem 28-Tage-Zyklus. Als Arbeitshypothese nehmen wir zyklische Schwankungen in der Aktivität des Immunsystems an. 2. Die bislang gängige Praxis, das nephrotische Syndrom ein halbes Jahr lang oder allenfalls bis zur ersten Abnahme der Proteinurie zu therapieren bedarf einer Korrektur. Erst wenn die Periodizität der Proteinurie sistiert, kann die Therapie ausgeschlichen werden, ohne ein Rezidiv befürchten zu müssen. Auf jeden Fall muss wesentlich länger therapiert werden als gegenwärtig in der Literatur berichtet. 3. Vor allem Patienten der Kategorie mit sehr langem Intervall zwischen Erstmanifestation und Therapiebeginn bedürfen einer möglicherweise lebenslangen Therapie um kein Endstage Renal Failure zu erleiden. 4. Das bislang gültige therapeutische Fenster der Ciclosporin-A-Therapie von 80 – 120 ng/ml Talspiegel kann bei gutem Ansprechen auf 60 – 80 ng/ml reduziert werden ohne hohes Rezidivrisiko. / 20 patients with focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) and membranous nephropathy (mGN) are examined in a clinical trial, concerning the effect of a combined therapy with ACE inhibitor, prednisolone and cyclosporine A in a period of 10 years. The efficiency of this therapy is well documented in literature. The trial recognizes the following yet unknown facts: 1. The level of proteinuria in nephrotic syndrome describes a 28 days cycle. We suppose a connection to the cyclic change of the immune system. 2. The common therapy of the nephrotic syndrome lasting a half year needs a change. The immunsuppressive therapy may only be reduced after the suspending of the cycles of the proteinuria, without risking a relapse. 3. A long period between the first symptoms and the beginning of the therapy is a bad prediction. 4. The common blood level of cyclosporine A of 80 - 120 ng/ml may be reduced to 60 - 80 ng/ml without risking a higher relapse rate.

Hintergrund: Die interstitielle Fibrose spielt bei der Verschlechterung der Nierenfunktion mit dem Endstadium der Urämie eine große Rolle. In diesem Geschehen kommt der Interaktion der im Krankheitsfall vermehrt filtrierten Proteine mit der proximalen Tubuluszelle, dem Ort der Proteinrückresorption, eine entscheidende Bedeutung zu. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand eines Zellkulturmodells den Einfluss eines vermehrten Albuminangebots auf die Kollagenhomöostase kultivierter proximaler Tubuluszellen zu untersuchen, dabei involvierte Signaltransduktionswege aufzuzeigen und die zentrale Rolle der Albuminendozytose im Rahmen des Geschehens zu beurteilen. Methoden: Für unsere Untersuchungen verwendeten wir überwiegend die kultivierten proximalen Tubuluszellen des Opossums, welche – wie auch die LLC-PK1 Zellen - die für die Proteinendozytose notwendigen Komponenten - nämlich die Rezeptoren Megalin und Cubilin sowie den Natrium-Protonen-Austauscher 3 – besitzen und somit eine hohe Endozytoserate aufweisen. Diese wurden mit Albuminkonzentrationen - wie man sie bei erhöhter Proteinfiltration unter pathophysiologischen Bedingungen findet - inkubiert. Für Vergleichsstudien zogen wir Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) heran. Die Kollagenhomöostase wurde mittels Kollagenase-sensitiven Prolininkorporationsassay, Kollagen-ELISA und Kollagen-Western Blot, die Aktivität der Matrixmetalloproteinasen mittels Zymographie und Gelatinaseassay erfasst. Die Aktivierung von Signaltransduktionswegen wurde mittels eines SEAP-Reporter Gen Assays untersucht. Ergebnisse: Albuminexposition führte bei den Zelllinien mit hoher endozytotischer Aktivität (OK- und LLC-PK1- Zellen) zu einer vermehrten Sekretion von Kollagen Typ I, III und IV. Bei den Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) kam es nach Albuminexposition zu einem Rückgang der Kollagensekretion. Im Kollagen-Western Blot zeigte sich nach Inkubation mit Albumin eine Zunahme des zellulären Kollagens. Mittels Zymographie und Gelatinaseassay konnte eine Albumin-induzierte Abnahme der MMP-Aktivität nachgewiesen werden. Inkubation der OK-Zellen mit Albumin führte im SEAP-Reporter-Gen-Assay zu einer Aktivierung des NF-kappaB-, AP-1- und CRE-Singalweges. Hemmung der NF-kappaB-, PKC- und PKA- Aktivierung hatte eine teilweise Reduktion der Albumin-inudzierten Kollagensekretion zur Folge. Eine Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels des NHE3-Inhibitors EIPA verminderte sowohl die Kollagensekretion als auch die Aktivierung der untersuchten Signaltransduktionswege. Diskussion: Unsere Daten zeigen, dass ein Mehrangebot an Albumin die Kollagenhomöostase der proximalen Tubuluszellen aufgrund einer vermehrten Kollagensynthese und eines verminderten Kollagenabbaus stört. Dabei scheinen vor allem Kollagen Typ I und III zur tubulointerstitiellen Fibrose beizutragen. Albuminexposition aktiviert PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 und CRE. Für PKC, PKA und NF-kappaB konnte eine direkte Beteiligung an der Albumin-induzierten Kollagensekretion nachgewiesen werden. Albumin muss mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in die proximale Tubuluszelle aufgenommen werden, um die beobachteten Effekte zu vermitteln. Die alleinige Anwesenheit von Protein im proximalen Tubulus reicht dafür nicht aus. Es ist anzunehmen, dass die gestörte Matrixhomöostase zu einer Progression der interstitiellen Fibrose und somit zum Fortschreiten der Niereninsuffizienz führt. Albuminurie ist also nicht nur ein Marker, sondern ein Motor der Nierenfibrose. / Background: Interstitial fibrosis is of major importance for the deterioration of renal function, leading to uremia. Interaction of filtered proteins with proximal tubular cells is crucial for the onset and development of tubulointerstitial damage. In the present study we investigated the effects of albuminuria on collagen homeostasis and signaling pathways of the proximal tubular cells. Methods: Therefore we exposed cultured cells derived from the proximal tubule (OK-, LLC-PK1-cells) with high endocytic activity by expressing the endocytic machinery typical for the proximal tubule (megalin, cubilin, NHE3) to albumin concentrations in a range expected during enhanced protein filtration. For comparative studies we used renal epithelial cells (MDCK-, IHKE1-, NHE3-deficient-OK-cells) with low endocytic activity. Collagen homeostasis was assessed by collagenase-sensitive proline incorporation assay, collagen ELISA and collagen Western blot; matrix metalloproteinase activity was assessed by zymography and gelatinase assay. Signaling pathways were monitored by SEAP reporter gene asssay. Results: Albumin exposure led to an increase of secreted collagen type I, III and IV in cells with high endocytic activity. In cells with low endocytic activity albumin exposure inhibited collagen secretion. Collagen Western blot analysis showed an albumin-induced increase of cellular collagen. MMP activity was significantly decreased by albumin exposure shown by zymography and gelatinase assay. Furthermore, albumin exposure led to activation of the NF-kappaB-, AP1- and CRE-pathways detected by SEAP reporter gene assay. Inhibition of NF-kappaB, PKC and PKA partially reversed the effects of albumin-induced collagen secretion. Inhibition of receptor-mediated albumin endocytosis by NHE3-inhibitor EIPA reduced collagen secretion and activation of the above investigated pathways. Discussion: The data show that protein exposure, in a concentration range expected during enhanced protein filtration, disturbs collagen homeostasis of proximal tubular cells due to increased collagen synthesis and decreased collagen degradation. Especially collagen type I and III may contribute to tubulointerstitial fibrosis. The signaling pathways activated by albumin exposure include PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 and CRE; stimulation of PKC, PKA and NF-kappaB directly contribute to collagen secretion. There has to be efficient receptor-mediated protein endocytosis in order to stimulate collagen secretion and signaling pathways; the mere presence of protein in the proximale tubule is not sufficient. The disturbed matrix homeostasis probably supports the progression of interstitial fibrosis, which is of importance for the development of renal insufficiency. Therefore albuminuria is not only a marker, but also a motor or renal fibrosis.

Focal segmental glomerulosclerosis is one of the commonest cause of the nephrotic syndrome in adults patients. It is a damage of glomerulus characterized by leakage of proteins to urine and oedemas which usually develops into the end-stage renal disease within 10 years. Recently have been described familial forms of this disease which arise from injury to proteins making up filtration barrier of kidney. In 2005 non-selective ion channel TRPC6 was assigned among these proteins. In this thesis I focused on summarizing existing knowledge of the nephrotic syndrome, focal segmental glomerulosclerosis and involvement of TRPC6 in their origin. Second part of this work is devoted to the screening analysis of TRPC6 gene to discover possible mutations and polymorfisms in 47 patients with histologically proven focal segmental glomerulosclerosis or minimal change disease. The used methods were high resolution melting and direct sequencing. In the group of patients was detected no pathogenic mutation, only 2 known polymorfisms P15S and A404V and few changes which do not result in alteration of amino acid. So it seems TRPC6 gene mutations are a rare cause of the focal segmental glomerulosclerosis in adult patients in the Czech Republic.

The main focus of our research was to compare changes in ion excretion in urine, osmolality, indicators of exercise-induced proteinuria and tubular markers before and after dynamic exercise on a bicycle ergometer. The test sample consisted of 7 healthy, physically active women aged 27.4 years ( σ = 3.82 ). For dynamic exercise we uniformly set parameters 65 % VO2max and duration of load in 50 minutes. We compared the laboratory results of urine samples taken just before the exercise with urinary samples that we have collected immediately after exercise. The results of our measurements showed a significant changes in exercise-induced urinary sodium ions, creatinine and phosphorus. Statistically insignificant changes excretion was found between markers: chlorine, urine, osmolality, and N-acetyl-beta- d-glucosaminidase. These markers, however, show a trend the significance. Statistically insignificant changes after exercise have shown excretion of urinary markers: potassium, gelatinase-associated lipocalin, neutrophil microalbuminuria and alpha-1-microglobulin. Tubular markers of kidney damage after exercise is not at the reference values, that would indicate the tubular kidney damage.

RESUME Contexte La maladie rénale chronique (MRC) constitue un problème mondial majeur de Santé publique. Son ampleur réelle en Afrique demeure inconnue. Malgré, les progrès réalisés dans lidentification et la prévention de la MRC et le traitement de la phase terminale de la maladie, ces domaines restent un grand défi en Afrique Sub-saharienne à cause du manque cruel des ressources nécessaires. Objectif Ce travail a pour objectif de cerner lépidémiologie de la MRC à Kinshasa en vue délaborer des stratégies de dépistage précoce et de prévention adaptées. Le but ultime est de contribuer à la réduction de la morbidité et la mortalité rénales mais aussi cardiovasculaires. Méthodes : Le présent travail est une revue synthétique de 4 études menées à Kinshasa : Une étude documentaire des 412 cas réalisée aux Cliniques Universitaires de Kinshasa (CUK), durant la période allant de Janvier 2001 à Décembre 2004 pour identifier le profil épidémiologique et clinique des patients atteints de la MRC. Les résultats de cette étude ont motivé le besoin dévaluer lampleur de la maladie dans la population et dans les structures de santé existantes. Il en a résulté trois études. Une étude épidémiologique de type transversal effectuée à partir de 503 ménages sélectionnés de manière aléatoire selon un plan de sondage à plusieurs degrés dans 10 des 35 Zones de santé composant Kinshasa, capitale de la République Démocratique du Congo (RDC). Une seconde étude, aussi de type transversal, réalisée à partir de 527 patients à risque de MRC, fréquentant neuf Centres de santé (CS) de niveau primaire et quatre hôpitaux de référence de la ville de Kinshasa. Une campagne de dépistage de la protéinurie et des facteurs de risque de la MRC chez 3.018 sujets. Résultats : Lanalyse des données enregistrées en milieu hospitalier a montré : Une augmentation annuelle progressive et inquiétante des proportions (60,6%, 65,9%, 67,4% et 70,5%) de la MRC admises aux CUK quasi exclusivement au stade terminal de la maladie nécessitant une prise en charge rapide par la dialyse péritonéale. Malheureusement, 11% seulement pouvaient accéder à ce traitement onéreux. La majorité des malades à prédominance masculine (sexe ratio 2,2/1) décèdent prématurément à un âge moyen (45,8±14,5 ans), à un moment de leur vie où ils sont encore économiquement très productifs. Les causes probables de la MRC chez ces patients sont la glomérulonéphrite chronique (37%), lhypertension artérielle (27%) et le diabète sucré (26%). Les études transversales dans la population générale et les institutions de santé traditionnelles de la ville de Kinshasa ont mis en évidence les caractéristiques épidémiologiques suivantes: La prévalence globale (tous les stades confondus) de la MRC est de 12% dans la population générale, mais 3% seulement sont conscients de leur état de rein. Celle de linsuffisance rénale chronique (IRC) estimée par le débit de filtration glomérulaire (DFGe) < 60 ml/min/1,73 m² est de 8%. Cette MRC touche particulièrement les adultes (52±15 ans). Les facteurs de risque potentiels de la MRC, liés à des maladies non transmissibles (MNT) sont en progression comparativement aux études antérieures. Ces facteurs sont lhypertension (28%), le diabète sucré (12%) et lobésité (15%). Dans les Centres de santé de Kinshasa, la prévalence globale de la MRC méconnue parmi les sujets à risque est le triple de celle rapportée dans la population générale de la même ville. Parmi cette population malade, les proportions de la MRC atteignent 44% chez les hypertendus, 39% chez les diabétiques ; 16% chez les obèses et 12% chez les sujets infectés par le Virus de limmunodéficience humaine (VIH). 82% des diabétiques avaient une glycémie à jeun non contrôlée (> 126 mg/dl) et 78% dhypertendus navaient pas une pression artérielle sous la cible la moins stricte, cest à dire contrôlée à moins de 140/90 mmHg. Les déterminants identifiés de lIRC ont été lhypertension (OR ajusté 3,3), le diabète sucré (OR 2) et la protéinurie (OR 2,9). Les principaux déterminants de DFGe < 60 ml/min/1,73 m² chez les diabétiques étaient lâge et la durée du diabète sucré. Les résultats de la campagne de dépistage de la protéinurie et des facteurs de risque de la MRC ont révélé ce qui suit : La prévalence de la protéinurie a été de 17%. Les autres facteurs de risque de la MRC identifiés chez les sujets en bonne santé apparente ont été: lhypertension (37%), le diabète sucré (9%), lobésité (11%) et le syndrome métabolique (5%). Pour identifier un cas de protéinurie, il est nécessaire de dépister 4 diabétiques, 5 hypertendus, 4 sujets avec syndrome métabolique, 5 sujets âgés de plus de 50 ans et 9 personnes ne présentant aucune des conditions susmentionnées. Les déterminants majeurs de la protéinurie étaient lâge > 50 ans (OR ajusté 1,4), le diabète sucré (OR 1,3), le surpoids (OR 1,2) et le niveau socio-économique bas (OR 1,4). Conclusion : Ces études établissent pour la toute première fois dans une population africaine la forte prévalence de la MRC et ses facteurs de risque notamment lhypertension, le diabète sucré, lobésité, lâge > 50 ans et linfection à VIH. La maladie affecte ladulte encore jeune comparée aux Etats-Unis où elle prédomine à la vieillesse. Nos études ont montré aussi à la fois la forte prévalence de la protéinurie chez les sujets sans facteurs de risque traditionnels précités, le déficit du dépistage précoce de la MRC et de prise en charge des facteurs de risque dans le système de santé traditionnel favorisant la référence tardive et/ou les décès prématurés, ainsi que les limites malheureuses par manque de moyens de la prise en charge de la maladie au stade tardif. Ces études plaident pour la nécessité dun renforcement de la capacité du personnel soignant dans le domaine de détection précoce et de prise en charge des MNT dont la MRC. Elles montrent également quun dépistage annuel de masse de la population de la protéinurie et des facteurs de risque de la MRC est faisable et pourra, nous lespérons, constituer la base dune élaboration dune politique nationale de prévention. Mots-clé : diabète sucré, équation (Cockcroft & Gault, MDRD), hypertension artérielle, maladie rénale chronique, prévalence, protéinurie. SUMMARY Background Chronic kidney disease (CKD) is a worldwide public health problem. Little is known about its burden in Africa. Despite the advances in identification and prevention of CKD and management of end stage renal disease (ESRD), sub-Saharan Africa has been left far behind regarding these advances. This is because of the scarcity of necessary resources. Objective This work was designed to ascertain the epidemiologic knowledge of CKD in Kinshasa in order to define suitable baseline preventive strategies. It would aims ultimately, to reduce the morbidity and mortality from renal disease and related cardiovascular events. Methods: This current work summarises results of 4 studies undertaken in Kinshasa: A retrospective cross sectional study of 412 cases which was done in the Academic hospital of Kinshasa (AHK), from January 2001 to December 2004 to identify the epidemiologic and clinical profile of patients with CKD. The results of this study motivated us to investigate the extent of the burden of CKD in the population and the existing structures of healthcare. Thus, three further studies were carried out; In an epidemiologic cross sectional study, 503 adult residents in 10 of the 35 health zones of Kinshasa, the capital of the DRC were studied in a randomly selected sample; In a second study of higher risk subjects, 527 people in primary and secondary health care areas in the city of Kinshasa were studied from a random sample of at-risk out-patients with hypertension, diabetes, obesity, or who were infected by HIV; Finally, a mass screening for proteinuria and CKD risk factors was conducted in Kinshasa which involved 3,018 subjects. Results: The analysis of the data recorded in health care had showed: An overwhelmingly annual increasing proportion of CKD (60.6%, 65.9%, 67.4% and 70.5%) in AHK, unfortunately for the majority at stage 5, in other words at ESRD. Tragically enough, only 11% of them could be treated by peritoneal dialysis depending on their financial resources. The majority of the patients are young males (sex ratio 2.2/1) undergoing premature death (45.8±14.5). The probable causes of CKD in these subjects were chronic glomerulonephritis (37%), hypertension (27%) and diabetes mellitus (26%). The cross-sectional studies in the general population and the traditional structures of health care (HC) of the city of Kinshasa highlighted the following: The overall prevalence of CKD is 12% in the general population, but only 3% of those with CKD were aware of their condition. The prevalence of chronic renal failure (CRF) (eGFR < 60 ml/min/1.73 m ²) is 8%; CKD affects particularly young adults (52±15 years); Risk factors for CKD considered in this study, including hypertension (28%), diabetes (12%) and obesity (15%), are increasing compared to the former studies. In HC, the overall prevalence of undiagnosed CKD among at-the risk subjects is three times higher the prevalence of CKD in the general population of the same city. In those with the at-risk conditions, the % of CKD was: 44% in the hypertensive, 39% in the diabetics; 16% in the obese and 12% in those who were infected by the human immunodeficiency virus (HIV). 82% of those with history of diabetes had fasting serum glucose levels (> 126 mg/dl), and 78% of those with a history of hypertension did not have blood pressure controlled to less than 140/90 mmHg. The strongest determinants of CRF or CKD 3+ were: hypertension (adjusted OR 3.3), diabetes (OR 2) and proteinuria (OR 2.9). The principal determinants of eGFR < 60 ml/min/1.73 m² in the diabetic patients were age and the duration of diabetes. The results of the campaign of early detection for proteinuria and CKD risk factors revealed that: The prevalence of proteinuria was 17%. The other CKD risk factors identified were: hypertension (37%), diabetes (9%), obesity (11%) and metabolic syndrome (5%). To identify 1 case of proteinuria, one would need to screen 4 persons with diabetes, 5 persons with hypertension, 4 subjects having metabolic syndrome, 5 subjects aged ≥ 50 years and 9 people without any of the conditions mentioned above. The strongest determinants of proteinuria were age > 50 years (adjusted OR 1.4), diabetes (OR 1.3) and overweight (OR 1.2) and low socioeconomic status (OR 1.4). Conclusion: This work documents for the first time in Africa the high prevalence of CKD and its risk factors mainly hypertension, diabetes, obesity and HIV infection. CKD affects younger people in DRC, in contrast to the United States, where CKD is more prevalent in older. Our work also shows the high prevalence of proteinuria among subjects with neither diabetes nor hypertension, the deficit of the early detection and management of CKD risk factors in the traditional health care system leading to late referral or premature deaths, and the limits of renal replacement treatment. They also show that an annual mass screening of the population for proteinuria and CKD risk factors is feasible and will, it is hoped, provide the basis for building a nationwide prevention strategy. Key words: chronic kidney disease, diabetes mellitus, equation (Cockcroft &Gault, MDRD), arterial hypertension, prevalence, proteinuria.

Das Alport-Syndrom ist eine erbliche, progredient verlaufende Nierenerkrankung, bei der es infolge von charakteristischen Veränderungen der glomerulären Basalmembran zu Hämaturie und Proteinurie kommt. Es gelangen Proteine in den Urin, welche die Erkrankung möglicherweise frühzeitig anzeigen können. In diesem Projekt soll der Urin von Wildtyp- und COL4A3-Knockout-Mäusen zum Zeitpunkt von 4,5 und 6 Wochen untersucht werden. Ziel ist es, diagnostische Proteinmarker zu finden, die im Urin von Alport-Mäusen klinisch relevant hochreguliert sind. Zur Erreichung dieses Ziels wird sich proteomischer Verfahren, Western-Blot und histologischer Schnitte bedient.

Aims: 1. Determination of AGEs (Advanced Glycation End products) in patients with various types of nephropathy. 2. Association AGEs with nutritional parameters and anemia. 3. Influence of renal parameters on sRAGE (soluble form of Receptor for Advanced Glycation End products) levels. 4. Technics and proceeding methods of the podocytes cultivation. 5. Determination of urine podocytes. Methods: We determined fluorescent AGEs by spectrofluorometry, sRAGE by Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Podocytes were passaged and identified immunocytochemically. Podocytes in urine were specified by flow cytometry method. Results: 1. We did not find significant differences in AGEs serum levels among various types of nephropathy, even though the pathogenesis differs. 2. The albumin and prealbumin levels positively and haemoglobin levels negatively correlate with AGEs in patients with CKD grade 1-5, without necessity of dialysis. 3. Serum sRAGE levels are increased in patients with decreased renal function independently on the course of renal disease. 4. We implemented the methods and technics of podocyte cultivation. 5. Urine podocytes observation and confirmation that podocyturia relates to disease activity. Conclusion: We confirmed that AGEs serum levels depend more on renal function than the type of...

Aims: 1. Determination of AGEs (Advanced Glycation End products) in patients with various types of nephropathy. 2. Association AGEs with nutritional parameters and anemia. 3. Influence of renal parameters on sRAGE (soluble form of Receptor for Advanced Glycation End products) levels. 4. Technics and proceeding methods of the podocytes cultivation. 5. Determination of urine podocytes. Methods: We determined fluorescent AGEs by spectrofluorometry, sRAGE by Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Podocytes were passaged and identified immunocytochemically. Podocytes in urine were specified by flow cytometry method. Results: 1. We did not find significant differences in AGEs serum levels among various types of nephropathy, even though the pathogenesis differs. 2. The albumin and prealbumin levels positively and haemoglobin levels negatively correlate with AGEs in patients with CKD grade 1-5, without necessity of dialysis. 3. Serum sRAGE levels are increased in patients with decreased renal function independently on the course of renal disease. 4. We implemented the methods and technics of podocyte cultivation. 5. Urine podocytes observation and confirmation that podocyturia relates to disease activity. Conclusion: We confirmed that AGEs serum levels depend more on renal function than the type of...