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The role of ecological opportunity in adaptive radiation has been demonstrated by the diversification of the bacterium Pseudomonas fluorescens SBW25 in a spatially structured microcosm. This provides an ideal system for studying the genetics of adaptation and asking questions about the genes that matter in evolution. Previous studies have identified the genes that are necessary for the evolved, biofilm-forming, niche-specialist genotype, the wrinkly spreader (WS). These genes are organised in two operons: the wss operon that encodes the genes for cellulose biosynthesis, and the wsp operon that encodes a chemosensory pathway. The terminal gene in the wsp operon, wspR, encodes a novel response regulator thought to regulate the activity of the wss operon. This gene forms the basis of this study, which assesses the role of regulatory genes in adaptive evolution. The structure-function relationship of WspR is established through the phenotypic analysis of overexpressed wspR random point mutants. On this basis a model of WspR activity is proposed which is tested by molecular genetic analysis. The role of phosphorylation is demonstrated by site-directed mutagenesis, and domain liberation is used to study the interaction of WspR with the other components of the signalling pathway. As the overexpression of certain wspR mutant alleles mimics the evolutionary transition from ancestor to niche-specialist, the fitness effects of such overexpression are measured. It is found that some, but not all, wspR alleles do indeed cause adaptation. It is also found that a phenotypically-plastic genotype, with enhanced fitness, can be created by artificial manipulation, but does not occur naturally; this demonstrates the existence of a constraint on evolution. Sequence analysis of independently-isolated WS genotypes shows no evidence of wspR sequence variation, despite its capacity to enhance fitness. A further proteomic and phenotypic characterisation shows variation between ancestral and WS genotypes, and also between different WS genotypes. This demonstrates that there are different mutational routes to the same adaptation.

Certains composants nutritionnels sont capables de moduler la réaction inflammatoire et la réponse immune. Ils pourraient être très utiles dans l’augmentation de la résistance de l’hôte aux maladies infectieuses, en particulier dans l’infection pulmonaire à P. aeruginosa qui est caractérisée par une réponse inflammatoire excessive et dont la sévérité est associée à une réponse immunitaire de type Th2. Le premier objectif de ce travail a été de tester l’effet anti-inflammatoire d’un régime enrichi acides gras polyinsaturés n-3 (EPA/DHA) au cours d’une infection pulmonaire aigue à P. aeruginosa sur des souris déficientes pour le gène cftr. Des résultats antérieurs suggérant que les souris femelles sont plus sensibles à l’infection que les souris mâles, les bénéfices de cette alimentation ont été analysés selon le sexe des souris. Le second objectif a été d’étudier l’effet des oligosaccharides acides dérivés de la pectine de Citrus (pAOS) au cours d’une infection pulmonaire chronique à P. aeruginosa. L’hypothèse testée était que les pAOS en favorisant le balancement de la réponse Th2 vers une réponse Th1 pourrait améliorer le pronostic de l’infection. Leur effet immunomodulateur a été évalué chez deux fonds génétiques murins différents : des souris BALB/c et C57BL/6 connues pour développer respectivement une réponse immune de type Th2 et Th1. Ces 3 études sont basées sur l’administration endo-trachéale d’une suspension de P. aeruginosa pour l’infection aigue ou de P. aeruginosa inclus dans des billes d’agar pour une infection chronique chez des souris nourries pendant 6 semaines (souris cftr-/-) et 5 semaines (BALB/c et C57BL/6) par une diète contrôle ou d’une diète spécifique. Les paramètres cliniques mesurés sont la survie et la clairance bactérienne pulmonaire, et les paramètres biologiques sont pour la réponse inflammatoire le dénombrement des polynucléaires, des macrophages et le dosage de cytokines pro- et anti-inflammatoires et pour la réponse immune le dosage des cytokines Th1 et Th2, l’expression de marqueurs de différentiation des lymphocytes Th1, Th2 et de polarisation des macrophages M1 et M2. Les souris BALB/c et C57BL/6 survivantes à une première infection ont été réinfectées et leur charge bactérienne pulmonaire a été mesurée. / Some nutritional components are able to modulate the inflammatory response and the immune response. They could be very useful in increasing the host resistance to infectious diseases, particularly in the P. aeruginosa pulmonary infection which is characterized by an excessive inflammatory response and the severity of which is associated with a Th2 type immune response. The first objective of this study was to test the anti-inflammatory effect of a diet enriched in n-3 polyunsaturated fatty acids (EPA/DHA) during an acute pulmonary infection with P. aeruginosa in mice deficient for the cftr gene. Because previous results suggested that female mice are more susceptible to infection than male mice, the benefits of this diet were analyzed according to the mice gender. The second objective was to study the effect of acidic oligosaccharides derived from citrus pectin (pAOS) during a chronic lung infection with P. aeruginosa. The hypothesis was that pAOS by promoting the balancing of the Th2 response towards a Th1 response could improve the prognosis of the infection. Their immunomodulatory effect was evaluated in two different murine genetic backgrounds: BALB/c and C57BL/6, known to develop respectively a Th2 and a Th1 immune response. These three studies are based on the endotracheal administration of a suspension of P. aeruginosa for the acute infection or P. aeruginosa embedded in agar beads for the chronic infection in mice fed a control diet or a specific diet for 6 weeks (cftr-/- mice) or 5 weeks (BALB/c and C57BL/6). The clinical parameters measured were survival and pulmonary bacterial clearance. Biological parameters for the inflammatory response were the polymorphonuclear cells and macrophages counting and pro- and anti-inflammatory cytokines assay in the bronchoalveolar lavage, and for the immune response the Th1 and Th2 cytokines assay, the expression of differentiation markers of Th1 and Th2 cells and M1 and M2 macrophages. BALB/c and C57BL/6 surviving at the first infection were reinfected and the pulmonary bacterial load was measured.

Publicación a texto completo no autorizado por el autor. / Los ramnolípidos son biosurfactantes producidos por una gran cantidad de microorganismos, estos presentan gran diversidad de aplicaciones, siendo una de sus más importantes aplicaciones es en procesos de biorremediación en áreas contaminadas con hidrocarburos y metales pesados. El presente estudio está enfocado en investigar algunos de los parámetros fermentativos críticos para la producción de ramnolípidos por Pseudomonas aeruginosa 6k-11 usando dos fuentes de nitrógeno orgánica e inorgánica y dos diseños experimentales. El proceso para la producción de ramnolípidos fue optimizado usando un diseño central compuesto y Box Behnken como diseños experimentales y metodología de superficie de respuesta. Los factores tomados en cuenta para su estudio fueron el pH, temperatura, velocidad de agitación y porcentaje de inóculo. La máxima producción para la fuente de nitrógeno orgánica (triptona y urea) fue 23,2 g/L de ramnolípidos después de 168 horas de fermentación con las variables: 170 rpm de velocidad de agitación, 31,9°C de temperatura, 6,8 de pH, 6,8 (v/v) % de inóculo. La máxima producción teniendo como fuente de nitrógeno inorgánico (nitrato de sodio) fue 25,7 g/L de ramnolípidos luego de 168 horas de fermentación con las variables de fermentación: 185,8 rpm de velocidad de agitación, 31,3 °C de temperatura, 6,8 de pH, 7,3% de inóculo. Experimentalmente se confirmó 24,01 ±1,5 g/L y 28,01 ± 2,5 g/L de ramnolípidos para el medio I y II respectivamente. Los resultados de la presente investigación sugieren que la aplicación de la modelización matemática es muy eficaz para determinar las condiciones óptimas de reacción y mejorar el rendimiento de bioprocesos microbianos. / Tesis

Reductive dechlorination of chlorinated ethenes is dependent upon suitable substrates promoting microbial activity and creating anaerobic conditions. At the periphery of active reductive dechlorinating zones combinations of lesser chlorinated ethenes should exist along with end products of the anaerobic metabolism that is driving reductive dechlorination. Potential end-products of anaerobic metabolism were investigated for their ability to stimulate oxidative cometabolism of dichloro ethenes (DCEs) by the butane-degrading bacterium, Pseudomonas butanovora. Organic acids that supported butane-monooxygenase (BMO) activity were acetate, propionate, lactate, and butyrate. Lactate consistently supported and sustained greater rates of cooxidation than did the other organic acids. When propane replaced butane as the growth substrate, lactate remained the superior electron donor, while the ability of butyrate and acetate to support BMO activity decreased. In contrast, propionate-supported cooxidation was only observed in propane-grown cells. Lactate supported the degradation of 1,2-trans dichloroethylene (1,2-trans DCE), 1,2-cis dichloroethylene (1,2-cis DCE) and 1,1-dichloroethylene (1,1-DCE) in butane-grown P. butanovora. 78 nmoles (25 μM) of 1,2-cis DCE were completely degraded by butane-grown P. butanovora. In contrast, smaller amounts of 1,1-DCE and 1,2-trans DCE were degraded over the twenty minute time course. Decreasing rates of cooxidation over time were observed for of all three DCEs, and 50% of BMO activity was irreversibly lost after 15 min, 6 min, and 0.5 min exposures to 1,2-cis DCE, 1,2 trans-DCE, and 1,1-DCE respectively. Cell viability decreased by over 90, 95, and 99.95% during the transformation of 25 nmoles/mg protein of 1,2-cis DCE, 1,2-trans DCE and 1,1-DCE. These results indicate that cellular viability was more sensitive to cooxidation of 1,2-cis DCE and 1,2-trans DCE than was BMO. 1,2-cis DCE and 1,2-trans DCE induced BMO activity to 25 and 45% of the butane control, respectively. Induction by 1,2-trans DCE was observed at a threshold of about 20 μM and higher concentrations did not increase BMO activity. Fusion of lacZ to the BMO catabolic promoter, with consequent knock out of BMO activity, provided the opportunity to assess substrate induction without the confounding effects of enzyme inactivation and product induction. While BMO substrates, butane, 1,2-cis DCE, and ethylene, were unable to induce lacZ activity the BMO products, 1-butanol, and ethylene oxide, effectively induced lacZ activity. 1,2-trans DCE was unique among the BMO substrates tested in it's ability to induce expression of lacZ, 2-fold above background, in the reporter strain. A wide range of concentrations induced lacZ activities (10 to 100 μM), and low levels of 1,2-trans DCE achieved high levels of induction after 4 hrs. However, lacZ activities were limited to an induction of about four-fold above background and this limit allowed lower concentrations of 1,2-trans DCE to eventually produce equal levels of beta-galactosidease. These data provide proof-of- concept that BMO-dependent cometabolism can occur independently of butane as an inducer and electron donor for BMO gene expression and activity. / Graduation date: 2004

Thesis (M.S.)--Montana State University--Bozeman, 2006. / Typescript. Chairperson, Graduate Committee: Thomas S. Livinghouse. Includes bibliographical references (leaves 76-82).

Thesis (M. Phil.)--University of Hong Kong, 2006. / Title proper from title frame. Also available in printed format.

La mucoviscidose reste une maladie génétique grave sans traitement curatif. L’amélioration de la prise en charge de la maladie s’est accompagnée d’une augmentation importante de l’espérance de vie qui était de moins de un an dans les années 1950 et dépasse en moyenne 40 ans pour les enfants nés aujourd’hui. La mucoviscidose se caractérise au niveau pulmonaire par un mucus anormalement épais qui est difficilement évacué. Le mucus s’accumule alors dans les voies respiratoires et les bactéries y persistent et s’y multiplient. 80 à 95% des patients décèdent des suites de l’insuffisance respiratoire causée par les infections chroniques bactériennes concomitantes aux inflammations des voies aériennes. Les patients souffrent particulièrement d’infections à P. aeruginosa qui est la bactérie la plus fréquemment rencontrée dans la mucoviscidose. Lors des premières infections à P. aeruginosa les bactéries sont de phénotype non mucoïde et sont relativement sensibles aux antibiotiques. Les bactéries finissent par s’adapter dans les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose et forment des biofilms multiresistants aux antibiotiques. Les patients sont alors colonisés par P. aeruginosa de façon permanente. Les infections chroniques à P. aeruginosa sont responsables du déclin de la fonction respiratoire, d’exacerbations pulmonaires nécessitant une hospitalisation et de la mortalité des patients atteints de mucoviscidose. Il est donc urgent d’améliorer les traitements symptomatiques existants dans le but d’augmenter la qualité et l’espérance de vie des patients en attendant de nouveaux traitements curatifs visant à corriger l’anomalie génétique. Ce travail s’est donc orienté vers l’étude de l’efficacité in vitro de différentes combinaisons d’antibiotiques vis-à-vis des biofilms bactériens. Parmi l’ensemble des associations d’antibiotiques testées une synergie d’activité a été observée entre la tobramycine et la clarithromycine sur des biofilms âgés de 24 heures mais aussi de 12 jours. Notamment parmi les 26 souches testées une synergie d’action est observée chez 11 souches après une coadministration pendant 28 jours de tobramycine et clarithromycine en doses répétées sur un biofilm « mûr » âgé de 12 jours. Parmi ces 11 souches, 7 biofilms sont entièrement détruits à la fin du traitement. Sur l’ensemble des souches étudiées le traitement avec l’association est soit supérieur ou équivalent à celui de la tobramycine seule et a permis d’obtenir une action dans 53.8% des cas pour la combinaison versus 30.8% pour la tobramycine. Cependant aucune corrélation n’est trouvée entre le profil génétique, le phénotype mucoïde ou non des souches et la présence de synergie d’action ou la destruction entière du biofilm. Cette dernière étude s’inspire du traitement actuel de référence TOBI® qui s’administre par cycle de 28 jours, 2 fois par jour. Les différents travaux de cette thèse ont permis tout d’abord de développer un modèle in vitro proche des conditions rencontrées in vivo chez les patients atteints de mucoviscidose. Ce modèle pourra également être utilisé pour une série d’autres études et mises au point de nouveaux médicaments sous forme de molécule isolée ou en combinaison. Ce travail a également permis d’envisager le développement d’un nouveau médicament dans le traitement d’infections chroniques à P. aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose. Cependant des études futures in vivo sur souris mais aussi toxicologiques et cliniques seront indispensables pour confirmer le profil d’efficacité et de sécurité de cette association.

Pseudomonas is the most common cause of chronic lung infections leading to death in cystic fibrosis patients. While chronic infection is extremely difficult to eradicate, the initial bacterial-host interactions prior to biofilm formation and establishment of chronic infections represents an attractive therapeutic target. It is clear that interaction between pathogens and the host is a very complex process and successful adaptation requires tight control of virulence factor expression. The aim of this project was to look for early changes in P. aeruginosa global gene expression in response to attachment to epithelial cells. P. aeruginosa PA01 was incubated with polarized HBE cells at a MOI of 100 for 4 hours and bacteria attached to epithelial cells (interacting) were collected separately from those in the supernatant (non-interacting). To minimize media effects observed by others, iron and phosphate were supplemented at appropriate levels to avoid expression changes due to limitation of these nutrients, as confirmed in our microarray experiments. Analysis of 3 independent experiments demonstrated that 766 genes were up or down regulated by more than 1.5 fold during attachment. Among these, 371 genes, including ion, oprC, as well as 3 genes in quorum-sensing systems and 9 genes involved in the pmrAB and phoPQ two-component regulatory systems were found to be induced in the interacting bacteria. On the other hand, 395 genes, including oprG outer membrane porin and pscP involved in type III secretion system were down regulated. To understand the roles of these differentially expressed genes, a cytotoxicity (LDH release) assay was performed and demonstrated that oprG and ion mutants were less capable than the wild type of killing HBE epithelial cells. These findings suggest that, under these interaction assay conditions, regulation of the expression of certain virulence factors provides a potential advantage for successful adaptation. In addition, a mutant lacking a filamentous hemagglutinin like protein was found to be less cytotoxic to HBE cells and also deficient in A549 epithelial cell binding, indicating that this probable non-pilin adhesin has multiple functions in P. aeruginosa.