An important cause of pulmonary arterial hypertension (PAH) in children with congenital heart disease (CHD) is increased pulmonary blood flow (PBF). To gain a better understanding of the disease process, the changes in biochemical pathways and metabolism of pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) were studied using a unique surgical ovine model of increased pulmonary blood flow. PASMCs isolated from 4-week-old lambs with increased PBF (shunt) showed lower oxygen consumption rates and lower extracellular acidification rates linked to glutamine metabolism when compared to controls. Shunt and control PASMCs both exhibited a switch into the reverse tricarboxylic acid (TCA) cycle, while only shunt cells showed a decrease of glucose being transformed into Acetyl CoA to enter the forward TCA cycle. Shunt PASMCs also demonstrated increased levels of yes-associated protein 1 (YAP1) expression in the nucleus. These results indicate changes in glutamine metabolism, glucose metabolism, and protein signaling cascades associated with increased mechanical forces in the setting of increased PBF, as seen in PAH in children with CHD.

The overall objective of the research presented in this dissertation was to investigate molecular risk factors of susceptibility to estrogenic chemicals, polychlorinated biphenyls (PCBs), hormone replacement therapy, and oral contraceptives and how that leads to the development of pulmonary arterial hypertension (PAH). Environmental and molecular risk factors for PAH are not clearly understood. This is a major hurdle for the development of new therapy against PAH as well as understanding individual susceptibility to this disease. Gender has been shown to impact the prevalence of PAH. Although controversial, estrogens have been implicated to be a risk factor for PAH. Thus, we hypothesize that women exposed to estrogenic chemicals are at increased risk of developing PAH when endocrine disrupting chemicals interact with unopposed estrogen to worsen pulmonary arterial disease. In support of this hypothesis, we have accomplished the following: Microarray data on PAH were collected and subsequent meta-analysis was conducted using genome-wide association and environment-wide association approaches on published studies as well as GEO and NHANES data. All PCB geometric mean concentrations found higher levels in people at risk of PAH than people not at risk of PAH. The sum of non-dioxin-like PCBs and the sum of dioxin-like PCBs were significantly higher in people at risk of PAH than people not at risk of PAH. Also, different levels of LOD (including PCBs concentration >LOD, > 50th percentile, 50th-75th percentile, and ≥75th percentile) were significantly higher in people at risk of PAH than people not at risk of PAH. We reported that females used estrogen pills and oral contraceptive were associated with risk of PAH. However, females used progestin and estrogen/progestin pills were not at risk of PAH. Molecular risk factor analysis using machine learning approaches revealed that VAMP2, LAMA5, POLR2C, VEGFB, and PRKCH genes are causal genes of PAH pathogenesis. Gene ontology and pathway analysis of PAH showed that genes involved in the apoptosis pathway, p53 pathway, Ras Pathway, T-cell activation, TGF-beta pathway, VEGF pathway, and Wnt pathway appear to be significantly associated with PAH. Documenting the exposure to estrogenic chemicals among the general U.S. population, and identifying agents and molecular risk factors associated with PAH have the potential to fill research gaps and facilitate our understanding of the complex role environmental chemicals play in producing toxicity in the lungs.

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Systemic sclerosis (SSc) is a rare connective tissue disease affecting skin and internal organs. The pathogenesis of SSc is multifactorial and includes autoimmunity, inflammation and vasculopathy. Pulmonary arterial hypertension (PAH) is among the most serious of SSc complications and is characterized by augmented vasoconstriction, neointimal remodeling and occlusion of small arteries in lung. Elevated pulmonary arterial blood pressure and volume overload in the right heart eventually lead to death from heart failure. Pre-existing elevated pro-fibrotic signaling, systemic vasculopathy and chronic inflammation are additional factors that likely contribute to the more severe PAH manifestation in SSc patients, whose response to existing therapies is suboptimal. The aim of my thesis research was to investigate the pathological role of altered transcriptional regulation of endothelium in pulmonary vasculature, as well as testing potential novel therapies for SSc-PAH in vivo. I found that endothelial downregulation of GATA6 promotes increased production of reactive oxygen species (ROS) by suppressing enzymatic machinery responsible for ROS clearance. Increased ROS production triggered ER stress and inflammation, exacerbating endothelial dysfunction and vascular injury both in vitro and in vivo. Another discovery is that simultaneous depletion of two ETS-family factors, ERG and FLI1 synergistically activates interferon signaling in pulmonary endothelial cells and promotes inflammation in lung in vivo. Based on observed pathological contribution of oxidative stress and inflammation to vasculopathy and fibrosis I tested an anti-oxidative and anti-inflammatory agent- dimethyl fumarate (DMF) in mouse models of PAH, as well as lung and skin fibrosis. DMF efficiently ameliorated increased pulmonary artery pressure and vascular remodeling, as well as fibrotic changes in lung and skin. Mechanistically, I found that DMF promotes a proteasomal, βTRCP-dependent degradation of pro-fibrotic mediators TAZ/YAP, β-catenin and Sp1. In conclusion, I characterized new elements of pathological mechanism that promote vasculopathy and fibrosis, as well as provided an insight into anti-inflammatory and anti-fibrotic DMF therapy. Importantly, elucidating the novel mechanism of DMF action and recognizing the pathological role of Hippo and Wnt signaling in fibrosis might help to design more specific and effective pharmacological intervention in SSc-PAH patients.

Introdução: A redução da capacidade inspiratória (CI) induzida pelo exercício observada em alguns pacientes com hipertensão arterial pulmonar (HAP) poderia potencialmente ser influenciada por disfunção muscular respiratória. Objetivos: Investigar se há alguma relação entre CI e força muscular respiratória antes e após o exercício máximo e estudar o papel da pressão muscular respiratória e da CI na dispneia e na capacidade de exercício em pacientes com HAP. Métodos: 27 pacientes com HAP e 12 controles saudáveis pareados foram comparados. Todos os participantes foram submetidos a teste de exercício cardiopulmonar (TECP) com determinação seriada da CI. As pressões inspiratória e expiratória máximas (PImáx e PEmáx, respectivamente) foram medidas antes, no pico e após o exercício. Resultados: Os pacientes tiveram menor volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1), capacidade vital forçada (CVF) (com relação VEF1/CVF semelhante) e capacidade aeróbia máxima e maior dispneia no exercício. A PImáx e a PEmáx foram significativamente menores nos pacientes com HAP que nos controles. Entretanto, a variação pós exercício em relação ao repouso não foi significativamente diferente nos dois grupos. Os pacientes apresentaram redução significativa da CI do repouso ao pico do exercício em comparação aos controles. 17/27 pacientes (63%) apresentaram redução da CI durante o exercício. Considerando-se apenas os pacientes, não houve associação entre CI e PImáx ou PEmáx (pré, pós exercício ou mudança do repouso). Comparando-se os pacientes com e sem redução da CI, não houve diferença na proporção de pacientes que apresentaram redução da PImáx (41 vs 44%) ou da PEmáx (76 vs 89%) após o exercício. Da mesma forma, nenhuma diferença na PImáx ou PEmáx foi observada no exercício comparando estes subgrupos. Conclusões: Em resumo, a força muscular respiratória foi significativamente menor em pacientes com HAP em comparação com controles e uma proporção significativa de pacientes com HAP apresentaram redução da CI durante o exercício. No entanto, não foram observadas associações entre CI e alterações de força muscular respiratória com o exercício, sugerindo que ocorra verdadeira hiperinsuflação dinâmica. Além disso, o único parâmetro relacionado com a dispneia induzida pelo exercício foi a CI no repouso e com capacidade aeróbia no pico foi a magnitude da redução da PEmáx após o exercício. / Rationale: The exercise induced inspiratory capacity (IC) reduction observed in some patients with pulmonary arterial hypertension (PAH) could potentially be influenced by respiratory muscle dysfunction. Aims: To investigate if there is any relationship between IC and respiratory muscle strength before and after maximal exercise and to study the contribution of respiratory muscle pressure and IC in exercise dyspnea and capacity in PAH patients. Methods: 27 patients with PAH and 12 healthy matched controls were compared. All participants underwent cardiopulmonary exercise test (CPET) with serial IC measurements. Inspiratory and expiratory maximal mouth pressure (PImax and PEmax, respectively) were measured before and at peak/post exercise. Results: Patients had lower forced expiratory volume in 1 s (FEV1), forced vital capacity (FVC) (with similar FEV1/FVC ratio) and peak aerobic capacity and higher exercise dyspnea. PImax and PEmax were significantly lower in PAH patients compared to controls. However, post exercise variations from rest were not significant different in either group. Patients presented significant rest-to-peak reduction in IC compared to controls. 17/27 patients (63%) exhibited IC reduction during exercise. Considering only patients, there was no association between IC and PImax or PEmax (pre, post exercise or change from rest). Comparing patients with and without IC reduction, there was no difference in the proportion of patients presenting inspiratory (41 vs 44%) or expiratory (76 vs 89%) pressure reduction after exercise, respectively. In the same way, no difference in both inspiratory and expiratory respiratory pressure change with exercise was observed comparing these subgroups. Conclusions: In summary, respiratory muscle strength was significantly lower in PAH patients compared to controls and a significant proportion of PAH presented IC reduction during exercise. Nonetheless, no associations between IC and respiratory muscle strength changes with exercise were observed, suggesting a true dynamic lung hyperinflation. Additionally, the only parameter associated with exercise induced dyspnea was resting IC and with peak aerobic capacity was the magnitude of PEmax reduction after exercise.

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença grave, caracterizada pelo aumento na resistência vascular pulmonar, elevando a pós-carga imposta ao ventrículo direito. Na tentativa de compensar o aumento da pós-carga, o ventrículo direito desenvolve hipertrofia, que pode evoluir para dilatação e insuficiência, síndrome conhecida como Cor pulmonale. Alterações no estado redox estão presentes na HAP e estão relacionadas ao remodelamento e insuficiência do ventrículo direito. Desta forma, as espécies reativas de oxigênio podem ser alvos terapêuticos interessantes na HAP. O sulforafano é um fitoquímico que vem sido largamente estudado pelo seu potencial de indução de enzimas antioxidantes. Dessa forma, este estudo analisou a influência do tratamento com sulforafano sobre o remodelamento do ventrículo direito e estado redox em um modelo experimental de HAP induzido por monocrotalina. O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e aprovado sob o número 26270. Foram utilizados ratos Wistar machos, separados em quatro grupos (n=10-12 animais/grupo): controle (C); Controle + Sulforafano (CS); Monocrotalina (M); Monocrotalina + Sulforafano (MS). A indução da HAP foi realizada por meio de uma dose única de monocrotalina (60 mg/kg – i.p.). O tratamento com sulforafano (2,5 mg/kg i.p.) foi iniciado no 7º dia após a injeção de monocrotalina até 20º dia. Após 21 dias da indução da HAP, os ratos foram anestesiados e foi realizada ecocardiografia, cateterismo e eutanásia dos animais. Os resultados foram analisados através de ANOVA de duas vias e pós-teste de Student Newman Keuls (nível de significância P <0,05). Os resultados serão apresentados na versão completa desta dissertação. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a serious disease characterized by an increase in pulmonary vascular resistance, increasing afterload imposed on the right ventricle. In an attempt to offset the increased afterload, right ventricular hypertrophy develops, which may progress to dilatation and failure, syndrome known as Cor pulmonale. Alterations in redox state are present in PAH and are related to remodeling and right ventricular failure. Thus, reactive oxygen species may be interesting drug targets in PAH. Sulforaphane is a phytochemical that has been widely studied for its potential induction of antioxidant enzymes. Thus, this study examined the influence of treatment with sulforaphane on the remodeling of the right ventricle and redox state in an experimental model of PAH-induced monocrotaline. The project was submitted to the Comitê de Ética em Pesquisa com Animais of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul and approved under number 26270. Male Wistar rats were divided into four groups (n = 10-12 animals/group): Control (C); Control + Sulforaphane (CS); Monocrotaline (M); Sulforaphane + Monocrotaline (MS). Induction of PAH was performed by a single dose of monocrotaline (60 mg/kg - i.p.). The treatment with sulforaphane (2.5 mg/kg i.p.) was initiated on day 7 after injection of monocrotaline to 20 days. After 21 days of induction of PAH, rats were anesthetized and was performed echocardiography, catheterization and euthanasia of the animals. Results were analyzed by two-way ANOVA and Student Newman Keuls post-test (significance level P <0.05). Results will be presented in the full version.

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença grave, caracterizada pelo aumento na resistência vascular pulmonar, elevando a pós-carga imposta ao ventrículo direito. Na tentativa de compensar o aumento da pós-carga, o ventrículo direito desenvolve hipertrofia, que pode evoluir para dilatação e insuficiência, síndrome conhecida como Cor pulmonale. Alterações no estado redox estão presentes na HAP e estão relacionadas ao remodelamento e insuficiência do ventrículo direito. Desta forma, as espécies reativas de oxigênio podem ser alvos terapêuticos interessantes na HAP. O sulforafano é um fitoquímico que vem sido largamente estudado pelo seu potencial de indução de enzimas antioxidantes. Dessa forma, este estudo analisou a influência do tratamento com sulforafano sobre o remodelamento do ventrículo direito e estado redox em um modelo experimental de HAP induzido por monocrotalina. O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e aprovado sob o número 26270. Foram utilizados ratos Wistar machos, separados em quatro grupos (n=10-12 animais/grupo): controle (C); Controle + Sulforafano (CS); Monocrotalina (M); Monocrotalina + Sulforafano (MS). A indução da HAP foi realizada por meio de uma dose única de monocrotalina (60 mg/kg – i.p.). O tratamento com sulforafano (2,5 mg/kg i.p.) foi iniciado no 7º dia após a injeção de monocrotalina até 20º dia. Após 21 dias da indução da HAP, os ratos foram anestesiados e foi realizada ecocardiografia, cateterismo e eutanásia dos animais. Os resultados foram analisados através de ANOVA de duas vias e pós-teste de Student Newman Keuls (nível de significância P <0,05). Os resultados serão apresentados na versão completa desta dissertação. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a serious disease characterized by an increase in pulmonary vascular resistance, increasing afterload imposed on the right ventricle. In an attempt to offset the increased afterload, right ventricular hypertrophy develops, which may progress to dilatation and failure, syndrome known as Cor pulmonale. Alterations in redox state are present in PAH and are related to remodeling and right ventricular failure. Thus, reactive oxygen species may be interesting drug targets in PAH. Sulforaphane is a phytochemical that has been widely studied for its potential induction of antioxidant enzymes. Thus, this study examined the influence of treatment with sulforaphane on the remodeling of the right ventricle and redox state in an experimental model of PAH-induced monocrotaline. The project was submitted to the Comitê de Ética em Pesquisa com Animais of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul and approved under number 26270. Male Wistar rats were divided into four groups (n = 10-12 animals/group): Control (C); Control + Sulforaphane (CS); Monocrotaline (M); Sulforaphane + Monocrotaline (MS). Induction of PAH was performed by a single dose of monocrotaline (60 mg/kg - i.p.). The treatment with sulforaphane (2.5 mg/kg i.p.) was initiated on day 7 after injection of monocrotaline to 20 days. After 21 days of induction of PAH, rats were anesthetized and was performed echocardiography, catheterization and euthanasia of the animals. Results were analyzed by two-way ANOVA and Student Newman Keuls post-test (significance level P <0.05). Results will be presented in the full version.

Introdução: A redução da capacidade inspiratória (CI) induzida pelo exercício observada em alguns pacientes com hipertensão arterial pulmonar (HAP) poderia potencialmente ser influenciada por disfunção muscular respiratória. Objetivos: Investigar se há alguma relação entre CI e força muscular respiratória antes e após o exercício máximo e estudar o papel da pressão muscular respiratória e da CI na dispneia e na capacidade de exercício em pacientes com HAP. Métodos: 27 pacientes com HAP e 12 controles saudáveis pareados foram comparados. Todos os participantes foram submetidos a teste de exercício cardiopulmonar (TECP) com determinação seriada da CI. As pressões inspiratória e expiratória máximas (PImáx e PEmáx, respectivamente) foram medidas antes, no pico e após o exercício. Resultados: Os pacientes tiveram menor volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1), capacidade vital forçada (CVF) (com relação VEF1/CVF semelhante) e capacidade aeróbia máxima e maior dispneia no exercício. A PImáx e a PEmáx foram significativamente menores nos pacientes com HAP que nos controles. Entretanto, a variação pós exercício em relação ao repouso não foi significativamente diferente nos dois grupos. Os pacientes apresentaram redução significativa da CI do repouso ao pico do exercício em comparação aos controles. 17/27 pacientes (63%) apresentaram redução da CI durante o exercício. Considerando-se apenas os pacientes, não houve associação entre CI e PImáx ou PEmáx (pré, pós exercício ou mudança do repouso). Comparando-se os pacientes com e sem redução da CI, não houve diferença na proporção de pacientes que apresentaram redução da PImáx (41 vs 44%) ou da PEmáx (76 vs 89%) após o exercício. Da mesma forma, nenhuma diferença na PImáx ou PEmáx foi observada no exercício comparando estes subgrupos. Conclusões: Em resumo, a força muscular respiratória foi significativamente menor em pacientes com HAP em comparação com controles e uma proporção significativa de pacientes com HAP apresentaram redução da CI durante o exercício. No entanto, não foram observadas associações entre CI e alterações de força muscular respiratória com o exercício, sugerindo que ocorra verdadeira hiperinsuflação dinâmica. Além disso, o único parâmetro relacionado com a dispneia induzida pelo exercício foi a CI no repouso e com capacidade aeróbia no pico foi a magnitude da redução da PEmáx após o exercício. / Rationale: The exercise induced inspiratory capacity (IC) reduction observed in some patients with pulmonary arterial hypertension (PAH) could potentially be influenced by respiratory muscle dysfunction. Aims: To investigate if there is any relationship between IC and respiratory muscle strength before and after maximal exercise and to study the contribution of respiratory muscle pressure and IC in exercise dyspnea and capacity in PAH patients. Methods: 27 patients with PAH and 12 healthy matched controls were compared. All participants underwent cardiopulmonary exercise test (CPET) with serial IC measurements. Inspiratory and expiratory maximal mouth pressure (PImax and PEmax, respectively) were measured before and at peak/post exercise. Results: Patients had lower forced expiratory volume in 1 s (FEV1), forced vital capacity (FVC) (with similar FEV1/FVC ratio) and peak aerobic capacity and higher exercise dyspnea. PImax and PEmax were significantly lower in PAH patients compared to controls. However, post exercise variations from rest were not significant different in either group. Patients presented significant rest-to-peak reduction in IC compared to controls. 17/27 patients (63%) exhibited IC reduction during exercise. Considering only patients, there was no association between IC and PImax or PEmax (pre, post exercise or change from rest). Comparing patients with and without IC reduction, there was no difference in the proportion of patients presenting inspiratory (41 vs 44%) or expiratory (76 vs 89%) pressure reduction after exercise, respectively. In the same way, no difference in both inspiratory and expiratory respiratory pressure change with exercise was observed comparing these subgroups. Conclusions: In summary, respiratory muscle strength was significantly lower in PAH patients compared to controls and a significant proportion of PAH presented IC reduction during exercise. Nonetheless, no associations between IC and respiratory muscle strength changes with exercise were observed, suggesting a true dynamic lung hyperinflation. Additionally, the only parameter associated with exercise induced dyspnea was resting IC and with peak aerobic capacity was the magnitude of PEmax reduction after exercise.

Introdução: A redução da capacidade inspiratória (CI) induzida pelo exercício observada em alguns pacientes com hipertensão arterial pulmonar (HAP) poderia potencialmente ser influenciada por disfunção muscular respiratória. Objetivos: Investigar se há alguma relação entre CI e força muscular respiratória antes e após o exercício máximo e estudar o papel da pressão muscular respiratória e da CI na dispneia e na capacidade de exercício em pacientes com HAP. Métodos: 27 pacientes com HAP e 12 controles saudáveis pareados foram comparados. Todos os participantes foram submetidos a teste de exercício cardiopulmonar (TECP) com determinação seriada da CI. As pressões inspiratória e expiratória máximas (PImáx e PEmáx, respectivamente) foram medidas antes, no pico e após o exercício. Resultados: Os pacientes tiveram menor volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1), capacidade vital forçada (CVF) (com relação VEF1/CVF semelhante) e capacidade aeróbia máxima e maior dispneia no exercício. A PImáx e a PEmáx foram significativamente menores nos pacientes com HAP que nos controles. Entretanto, a variação pós exercício em relação ao repouso não foi significativamente diferente nos dois grupos. Os pacientes apresentaram redução significativa da CI do repouso ao pico do exercício em comparação aos controles. 17/27 pacientes (63%) apresentaram redução da CI durante o exercício. Considerando-se apenas os pacientes, não houve associação entre CI e PImáx ou PEmáx (pré, pós exercício ou mudança do repouso). Comparando-se os pacientes com e sem redução da CI, não houve diferença na proporção de pacientes que apresentaram redução da PImáx (41 vs 44%) ou da PEmáx (76 vs 89%) após o exercício. Da mesma forma, nenhuma diferença na PImáx ou PEmáx foi observada no exercício comparando estes subgrupos. Conclusões: Em resumo, a força muscular respiratória foi significativamente menor em pacientes com HAP em comparação com controles e uma proporção significativa de pacientes com HAP apresentaram redução da CI durante o exercício. No entanto, não foram observadas associações entre CI e alterações de força muscular respiratória com o exercício, sugerindo que ocorra verdadeira hiperinsuflação dinâmica. Além disso, o único parâmetro relacionado com a dispneia induzida pelo exercício foi a CI no repouso e com capacidade aeróbia no pico foi a magnitude da redução da PEmáx após o exercício. / Rationale: The exercise induced inspiratory capacity (IC) reduction observed in some patients with pulmonary arterial hypertension (PAH) could potentially be influenced by respiratory muscle dysfunction. Aims: To investigate if there is any relationship between IC and respiratory muscle strength before and after maximal exercise and to study the contribution of respiratory muscle pressure and IC in exercise dyspnea and capacity in PAH patients. Methods: 27 patients with PAH and 12 healthy matched controls were compared. All participants underwent cardiopulmonary exercise test (CPET) with serial IC measurements. Inspiratory and expiratory maximal mouth pressure (PImax and PEmax, respectively) were measured before and at peak/post exercise. Results: Patients had lower forced expiratory volume in 1 s (FEV1), forced vital capacity (FVC) (with similar FEV1/FVC ratio) and peak aerobic capacity and higher exercise dyspnea. PImax and PEmax were significantly lower in PAH patients compared to controls. However, post exercise variations from rest were not significant different in either group. Patients presented significant rest-to-peak reduction in IC compared to controls. 17/27 patients (63%) exhibited IC reduction during exercise. Considering only patients, there was no association between IC and PImax or PEmax (pre, post exercise or change from rest). Comparing patients with and without IC reduction, there was no difference in the proportion of patients presenting inspiratory (41 vs 44%) or expiratory (76 vs 89%) pressure reduction after exercise, respectively. In the same way, no difference in both inspiratory and expiratory respiratory pressure change with exercise was observed comparing these subgroups. Conclusions: In summary, respiratory muscle strength was significantly lower in PAH patients compared to controls and a significant proportion of PAH presented IC reduction during exercise. Nonetheless, no associations between IC and respiratory muscle strength changes with exercise were observed, suggesting a true dynamic lung hyperinflation. Additionally, the only parameter associated with exercise induced dyspnea was resting IC and with peak aerobic capacity was the magnitude of PEmax reduction after exercise.

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