Kiel, Univ., Diss., 2004. / Computerdatei im Fernzugriff.

La conversion des résidus U en pseudouridine (Y) est la modification la plus fréquente dans les ARN. Cette réaction est catalysée par des ARN:Y-synthases qui fonctionnent soit seules, soit au sein de particules snoRNP H/ACA composées de 4 protéines et d’un snoRNA. Celui-ci assure la reconnaissance de l’ARN cible par appariement de bases. Les pseudouridylations des ARNr eucaryotes sont catalysées par des snoRNP alors que les modifications des ARNt sont catalysées par des enzymes dépourvues de guide. Aucun snoRNA H/ACA n’est décrit chez les Bactéries. Trois équivalents des snoRNA H/ACA (sRNA H/ACA) avaient été découverts chez les Archaea lorsque j’ai débuté ma thèse, mais leur contribution aux modifications des ARNr n’avait pas été démontrée. Nous avons développé une approche bioinformatique permettant l’identification exhaustive de gènes de sRNA H/ACA et de leurs cibles. Nous avons ainsi identifié 7 sRNA H/ACA chez Pyrococcus abyssi et détecté 14 Y dans les ARNr. Nous avons réussi la reconstitution de particules H/ACA actives in vitro, ce qui nous a permis d’étudier leur mode d’assemblage et d’assigner 12 des Y détectées aux 7 sRNA. L’application à d’autres espèces d’archaea de l’approche bioinformatique développée nous a permis d’identifier environ 90 sRNA, nous avons ainsi pu étudier leur évolution. De plus, nous avons expérimentalement démontré pour la première fois qu’un sRNA H/ACA est impliqué dans la modification d’un ARNt. Enfin, nous avons montré que l’enzyme aCBF5 des sRNP H/ACA peut catalyser la pseudouridylation en position 55 des ARNt sans utilisation de sRNA et nous avons identifié des résidus de aCBF5 impliqués dans les activités guidée et/ou non guidée. / The conversion of U into Pseudouridine (Y) residue is the most prevalent RNA modification. This reaction is catalysed either by stand-alone RNA:Y-synthases or by H/ACA snoRNPs composed of 4 proteins and a snoRNA. In snoRNPs the recognition of the U residue is carried out by base-pair interactions between the snoRNA and the RNA target. SnoRNPs are involved in eukaryal rRNA modifications whereas stand-alone RNA:Y-synthase are involved in tRNA and bacterial rRNA modifications. Three counterparts of the H/ACA snoRNAs had been discovered in Archaea when I started my PhD work, but their contribution to rRNA modification was not demonstrated. We developed a computational approach to identify the H/ACA sRNA genes and their rRNA targets. Its application to the Pyrococcus abyssi genome revealed 7 candidate genes. We verified their expression and experimentally identified 14 Y in the P. abyssi rRNAs. We succeeded in the in vitro reconstitution of active H/ACA sRNPs and thereby studied the sRNP assembly mechanism, identified important H/ACA sRNA structural features and assigned 12 of the identified Y residues to the 7 sRNAs. The application of the computational approach to the other archaeal genomes revealed 90 sRNA genes. This repertoire shed new light on the function and the evolution of this ncRNA class. In addition, we experimentally demonstrated for the first time that a few H/ACA sRNAs are involved in tRNA modification. We also showed that the enzyme of the H/ACA sRNP (aCBF5) is involved in Y55 formation in all archaeal tRNAs without the use of an H/ACA sRNA. We compared the guided and non-guided CBF5 activities and identified aminoacids which are important for these activities.

La conversion des résidus U en pseudouridine (?) est la modification la plus fréquente dans les ARN. Cette réaction est catalysée par des ARN:?-synthases qui fonctionnent soit seules, soit au sein de particules snoRNP H/ACA composées de 4 protéines et d’un snoRNA. Nous avons démontré que l’ARN:?-synthase Pus7p de S. cerevisiae est capable d’agir sur les ARNt cytoplasmiques (position 13 dans 10 ARNt et position 35 dans le pré-ARNtTyr contenant un intron) (Behm-Ansmant et al., 2003). En parallèle, j’ai recherché les requis en séquence et en structure pour qu’un ARN soit substrat de Pus7p. J’ai également réalisé une étude préliminaire de l’importance des domaines additionnels de Pus7p par rapport à l’enzyme TruD d’E. coli. Comme les systèmes enzymatiques responsables de la formation de trois résidus ? du snRNA U2 de S. cerevisiae avaient été identifiés, nous avons pu débuter une étude de l’importance fonctionnelle de ces résidus pour la réaction d’épissage en utilisant l’approche globale par puces à ADN que l’équipe de J. Beggs (Edinburgh University) avait mise au point pour S. cerevisiae. Nous avons ainsi observé une baisse de l’efficacité d’épissage de certains ARN pré-messagers lorsque plusieurs gènes codant des U2 snRNA:?-synthases sont inactivés simultanément. L’ARN:?-synthase Pus7p est présente dans les 3 domaines du vivant et en particulier chez les archaea où l’activité de cette enzyme n’avait jamais été étudiée. Nous avons découvert l’existence de 2 systèmes enzymatiques différents pour la modification d’une même position d’un ARNt chez 2 espèces d’archaea thermophiles : une enzyme seule chez Pyrococcus abyssi contre un système de guide sRNP H/ACA chez Sulfolobus solfataricus dans lequel la protéine Pus7 est mutée au niveau d’acides aminés requis pour l’activité. Finalement, nous avons produit chacune de ces enzymes en grandes quantités et nous avons réalisé des tests de cristallisation. Des cristaux de Pus7 de P. abyssi ont été obtenus et une mesure complète de données de diffraction de rayons X a été réalisée au laboratoire à 2,5 Å de résolution. / thesis

München, Techn. Univ., Diss., 2003. / Computerdatei im Fernzugriff.

Les Archaea hyperthermophiles sont des micro-organismes particulièrement adaptés à la vie à très haute température. Les températures élevées sont responsables de la création de diverses lésions à l’ADN. Pourtant, le taux de mutations spontanées chez l’Archaea Sulfolobus solfataricus est proche de celui mesuré chez des organismes mésophiles. Ceci laisse suggérer que les Archaea doivent être équipées de mécanismes spécialisés efficaces dans la reconnaissance et réparation des dommages à l’ADN. La réplication de l’ADN est un mécanisme fonctionnellement conservé dans les trois domaines du Vivant assuré par des enzymes clefs, les ADN polymérases. A ce jour, chez Pyrococcus abyssi (Pab), Euryarchaea hyperthermophile, deux familles de pol ont été identifiées, une pol réplicative de la famille B, présente dans les trois règnes du Vivant et une pol réplicative la famille D, spécifique de l’embranchement des Euryarchaea. Tous les membres de la famille B des pols archéennes possèdent une signature structurale unique impliquée dans la reconnaissance spécifique des bases endommagées (uracile et hypoxanthine). Ce doctorat a permis de démontrer que cette poche pouvait également accommoder les bases canoniques (A, T, C, G) contribuant ainsi à la haute fidélité de ces enzymes. Des structures cristallographiques à très haute résolution de l’ADN polymérase B (PabPolB) ont permis d’identifier la présence d’un ion métallique divalent situé à proximité de cette poche de reconnaissance. Il a été suggéré que cet ion modulerait la reconnaissance des bases désaminées et le glissement de l’ADN polymérase au cours de la synthèse d’ADN. De plus, nous avons montré que les ions catalytiques divalents ont un rôle central dans la modulation des propriétés intrinsèques de PabPolB. L’ion calcium est utilisé par PabPolB pour mener à bien la synthèse d’ADN mais engendre des caractéristiques cinétiques différentes de celles conférées par l’ion magnésium universel. D’autre part, nous avons déterminé pour la première fois chez un organisme archéen la concentration intracellulaire de dNTPs et NTPs. Leurs concentrations sont relativement plus élevées que celles mesurées par exemple chez l’eucaryote Saccharomyces cerevisiae, suggérant un mécanisme constitutif de réaction de protection à des agressions de l’ADN. L’ensemble de ces résultats participe à la compréhension des mécanismes moléculaires qui régissent la maintenance de l’intégrité du génome et, donc, de la vie des organismes hyperthermophiles. / Hyperthermophilic Archaea that thrive under harsh environments (elevated temperature, pH shifts, andionizing radiations) are supposed to be exposed to massive DNA damages. However, the mutations frequencies in hyperthermophilic Archaea are comparable with those of other microorganisms (1) indicating they are equipped with unique and efficient molecular mechanisms to ensure their genome integrity. DNA replication is an essential and conserved process among the three domains of life. DNA polymerases are central enzymes involved in the joining of deoxyribonucleoside 5′-triphosphates (dNTPs) to form the growing DNA chain. In Pyrococcus abyssi (Pab), two familiesDNA polymerases have been described as replicases, one family B (PabPol B) with structural diversity and common mechanisms among all organisms in the three domains of life, and one family D found exclusively in Euryarchaea. All members of archaeal family B DNA polymerases possess a unique structural feature involved in the recognition of deaminated bases (uracil and hypoxanthine) called uracil-pocket. During my PhD, it has been shown that not only deaminated but also canonical bases (A, T, C, G) could enter this pocket in PabPolB. We therefore renamed it as the base-checking pocket and proposed a role in the high fidelity of PabPolB. High-resolution crystal structures of PabPolBhig hlighted the presence of divalent metal ion to the proximity of the base-checking pocket. It has been suggested that thismetal ion may modulate the recognition of deaminated bases and the translocation of PabPolB on DNA during DNAsynthesis. Moreover, the crucial role of metal ion on DNA synthesis and exonuclease activity by PabPolB has beenevaluated. DNA polymerisation in the presence of calcium was as effective as the universal magnesium ion while showing different time-course kinetics. For the first time, intracellular concentrations of nucleotides (dNTPs and NTPs) have been determined in an archaeal microorganism. dNTPs and NTPs concentrations seem rather elevated for Pab than in the eukaryotic Saccharomyces cerevisiae cells, suggesting a constitutive mechanism for protecting the genome from DNAdamage. Overall, these results contributed to unravel specific molecular mechanisms involved in the maintenance of the genome integrity with a particular emphasis on molecules (DNA polymerases, dNTPs and NTPs) crucial for cellular life.

L’isomère de l’uridine (U), la pseudouridine (?), est le nucléoside le plus fréquemment rencontré dans les ARN. La réaction de pseudouridylation dans les ARN est catalysée par des ARN:?-synthases qui, soit fonctionnent comme des enzymes protéiques, soit sont portées chez les eucaryotes et les archaea par des particules ribonucléoprotéiques (RNP). Chaque RNP est composée d’un RNA guide dit à boîtes H/ACA (sno/sca/sRNA chez les eucaryotes et sRNA chez les archaea) et d’un ensemble invariable de protéines : l’enzyme ARN:?-synthase Dyskérine/aCBF5 et les 3 protéines NOP10/aNOP10, GAR1/aGAR1 et NHP2/L7Ae. L’ARN guide assure la reconnaissance de l’ARN cible à modifier par appariement de bases. Les sRNA H/ACA identifiés chez l’archae Pyrococcus abyssi ont servi de modèles pour des études de structure-fonction basées sur i) la mesure de l’activité de sRNP H/ACA reconstituées avec les composants protéiques et nucléiques purifiés, ii) l’analyse de la structure 2D des ARN au sein des RNP par des sondes chimiques et enzymatiques et par dichroïsme circulaire, iii) les diverses structures 3D disponibles. Les déterminants moléculaires présents sur les ARN guides ont été précisés, ainsi que le rôle fonctionnel des différentes protéines, de leurs domaines structuraux et de résidus conservés. Nous montrons que l’association entre aNOP10 et L7Ae est cruciale pour l’activité des RNP. Nous avons identifié que aCBF5 pouvait catalyser la formation des résidus ?55 dans les ARNt et ?2603 dans l’ARN 23S sans l’intervention de sRNA. Nous avons étudié le rôle de résidus conservés de aNOP10 ainsi que du site actif et de la boucle ß7/ß10 de aCBF5 dans les activités guidée et non guidée de aCBF5. / Pseudouridine (?), uridine’s isomer, is the most abundant modified nucleoside found in structured RNAs. The reaction of pseudouridylation is either catalyzed by a limited number of standalone RNA:?-synthases, or in eukaryotes and archaea by multiple ribonucleoprotein particles (the so-called, box H/ACA sno/sca/sRNPs). Each RNP is composed of a specific box H/ACA RNA used as a guide to define the U residue for modification, and a common set of four proteins– the RNA:?-synthase Dyskerin/aCBF5, and the auxiliary proteins NOP10/aNOP10, GAR1/aGAR1, NHP2/L7Ae (respectively in human and archaea). Initially, 7 guide RNAs were identified in the archaeon P. abyssi, which were used as models for structure-function analyses. Activities of RNPs reconstituted with purified protein and RNA components were measured; RNA 2D structure within RNPs was investigated by chemical and enzymatic probing assays as well as by circular dichroism. By taking into consideration the various 3D structures recently resolved, we were able to pinpoint the RNA molecular determinants and to clarify the role played by each protein, their domains, and some of their conserved residues. Hence, interaction between aNOP10 and L7Ae was found to be crucial for RNP activity. Moreover, we show that the enzyme aCBF5 catalyzes pseudouridylation at the position 55 in tRNAs and the position 2603 in 23S rRNA without the use of any guide sRNA. The role of residues conserved in aNOP10, and in the active site and the ß7/ß10 loop of aCBF5 for the RNA and non-RNA guided activities were analyzed.

Regensburg, Univ., Diss., 2008

A síntese ribossomal é uma das maiores atividades em células eucarióticas. Este processo inicia-se no nucléolo e é finalizado após a exportação das subunidades 40S e 60S para o citoplasma. Três dos RNAs ribossomais de eucariotos (18S, 5.8S e 25S) são sintetizados como um transcrito primário de 35S, o qual é processado através de uma complexa e ordenada série de modificações nucleotídicas e clivagens endo e exonucleolíticas. Estas reações dependem de aproximadamente 170 proteínas, 80 small nucleolar RNAs e de seqüências no pré-rRNA. Os fatores trans-atuantes envolvidos no processamento podem ser agrupados como RNA-helicases, endonucleases, snoRNPs (small nucleolar ribonucleoprotein complexes) e exonucleases, que incluem o complexo exossomo. O exossomo de levedura é formado por 10 proteínas essenciais que atuam na maturação de rRNAs, snRNAs, snoRNAs, além da degradação de mRNAs incorretamente processados. A estrutura do exossomo de archaea foi descrita recentemente, mas ainda não existem muitas informações sobre a regulação deste complexo e sobre a participação de cofatores que interagem de forma transiente com o exossomo. Diante disso, este trabalho visou a caracterização funcional das proteínas que formam o anel de RNases PH em Saccharomyces cerevisiae, assim como a caracterização estrutural e funcional de possíveis cofatores do exossomo de Saccharomyces cerevisiae, Nop17p e Ylr022p, e do exossomo de Pyrococcus, Pab418p, Pab1135p e aNip7p. Os dados obtidos evidenciam que a atividade exonucleolítica do exossomo de levedura, assim como o de archaea, é dependente da formação de heterodímeros; Ylr022p, uma proteína de levedura com função não caracterizada, liga inespecificamente RNA in vitro, mas mais eficientemente alguns RNAs in vivo. Dentre as proteínas de archaea, Pab418p e aNip7p também ligam RNA, e como demonstrado aqui, aNip7p influencia significativamente a atividade do exossomo de archaea. / The synthesis of ribosomes is one of the major metabolic pathways in eukaryotic cells. This process starts in the nucleolus and ends with the export and final maturation of the ribosomal subunits 40S and 60S in the cytoplasm. Three eukaryotic ribosomal RNAs (18S, 5.8S and 25S) are synthesized as a 35S primary transcript (35S pre-rRNA), which is then processed by a complex and ordered series of nucleotide modifications and endo- and exonucleolytic cleavage reactions. These processing reactions depend on 170 proteins, 80 small nucleolar RNAs and specific pre-rRNA sequences. The trans-acting factors, that take part in the processing can be grouped as RNA-helicases, endonucleases, snoRNPs (small nucleolar ribonucleoprotein complexes) and exonucleases, including the exosome. The yeast exosome is composed of 10 essential proteins that function in the processing of rRNAs, snRNAs, snoRNAs and in the degradation of aberrant mRNAs. Recently, the archaeal exosome structure was determined, but no information is yet available on the regulation of the exosome function or on the possible role of the cofactors that transiently interact with it. The main goals of this work were the functional characterization of the protein components of the Saccharomyces cerevisiae exosome RNase PH ring, as well as the structural and functional characterization of the possible cofactors of that complex, Nop17p and Ylr022p. Since the recent characterization of the Pyrococcus exosome, the study of the archaeal exosome cofactors, Pab418p, Pab1135p and aNip7p, was also included in this work, in order to correlate the data on the complex of these different organisms. Our results show that the exonucleolytic activity of the yeast exosome is dependent on the heterodimers formation, as described for archaea. Although it is not clear how Nip7p affects the exosome function in yeast, aNip7p binds RNA and inhibits a-exosome activity in vitro. Yeast Ylr022p binds RNA inespecificaly in vitro, but coprecipitates specific RNAs more efficiently from total cell extracts. Its archaeal orthologue, Pab418p, also binds RNA, but does not affect significantly a-exosome function.

A síntese ribossomal é uma das maiores atividades em células eucarióticas. Este processo inicia-se no nucléolo e é finalizado após a exportação das subunidades 40S e 60S para o citoplasma. Três dos RNAs ribossomais de eucariotos (18S, 5.8S e 25S) são sintetizados como um transcrito primário de 35S, o qual é processado através de uma complexa e ordenada série de modificações nucleotídicas e clivagens endo e exonucleolíticas. Estas reações dependem de aproximadamente 170 proteínas, 80 small nucleolar RNAs e de seqüências no pré-rRNA. Os fatores trans-atuantes envolvidos no processamento podem ser agrupados como RNA-helicases, endonucleases, snoRNPs (small nucleolar ribonucleoprotein complexes) e exonucleases, que incluem o complexo exossomo. O exossomo de levedura é formado por 10 proteínas essenciais que atuam na maturação de rRNAs, snRNAs, snoRNAs, além da degradação de mRNAs incorretamente processados. A estrutura do exossomo de archaea foi descrita recentemente, mas ainda não existem muitas informações sobre a regulação deste complexo e sobre a participação de cofatores que interagem de forma transiente com o exossomo. Diante disso, este trabalho visou a caracterização funcional das proteínas que formam o anel de RNases PH em Saccharomyces cerevisiae, assim como a caracterização estrutural e funcional de possíveis cofatores do exossomo de Saccharomyces cerevisiae, Nop17p e Ylr022p, e do exossomo de Pyrococcus, Pab418p, Pab1135p e aNip7p. Os dados obtidos evidenciam que a atividade exonucleolítica do exossomo de levedura, assim como o de archaea, é dependente da formação de heterodímeros; Ylr022p, uma proteína de levedura com função não caracterizada, liga inespecificamente RNA in vitro, mas mais eficientemente alguns RNAs in vivo. Dentre as proteínas de archaea, Pab418p e aNip7p também ligam RNA, e como demonstrado aqui, aNip7p influencia significativamente a atividade do exossomo de archaea. / The synthesis of ribosomes is one of the major metabolic pathways in eukaryotic cells. This process starts in the nucleolus and ends with the export and final maturation of the ribosomal subunits 40S and 60S in the cytoplasm. Three eukaryotic ribosomal RNAs (18S, 5.8S and 25S) are synthesized as a 35S primary transcript (35S pre-rRNA), which is then processed by a complex and ordered series of nucleotide modifications and endo- and exonucleolytic cleavage reactions. These processing reactions depend on 170 proteins, 80 small nucleolar RNAs and specific pre-rRNA sequences. The trans-acting factors, that take part in the processing can be grouped as RNA-helicases, endonucleases, snoRNPs (small nucleolar ribonucleoprotein complexes) and exonucleases, including the exosome. The yeast exosome is composed of 10 essential proteins that function in the processing of rRNAs, snRNAs, snoRNAs and in the degradation of aberrant mRNAs. Recently, the archaeal exosome structure was determined, but no information is yet available on the regulation of the exosome function or on the possible role of the cofactors that transiently interact with it. The main goals of this work were the functional characterization of the protein components of the Saccharomyces cerevisiae exosome RNase PH ring, as well as the structural and functional characterization of the possible cofactors of that complex, Nop17p and Ylr022p. Since the recent characterization of the Pyrococcus exosome, the study of the archaeal exosome cofactors, Pab418p, Pab1135p and aNip7p, was also included in this work, in order to correlate the data on the complex of these different organisms. Our results show that the exonucleolytic activity of the yeast exosome is dependent on the heterodimers formation, as described for archaea. Although it is not clear how Nip7p affects the exosome function in yeast, aNip7p binds RNA and inhibits a-exosome activity in vitro. Yeast Ylr022p binds RNA inespecificaly in vitro, but coprecipitates specific RNAs more efficiently from total cell extracts. Its archaeal orthologue, Pab418p, also binds RNA, but does not affect significantly a-exosome function.

München, Techn. Univ., Diss., 2003.