Two fungal pathogen species, Helminthosporium solani and Pythium ultimum, cause significant economic loss to potato (Solanum tuberosum) growers throughout the world. These pathogens have substantial differences in cellular makeup, pathogenicity, and modes of infection. We studied the efficacy of 82 isolates within the bacterial genus Streptomyces in inhibiting these pathogens under laboratory and greenhouse conditions. Derivatives of Streptomyces have significant implications in medicinal use because of their antibiotic and antifungal properties. Under in-vitro conditions, 25% of Streptomyces isolates inhibited growth of P. ultimum, up to 81%. Ninety-five percent of the Streptomyces isolates inhibited growth of H. solani, with a maximum of 70%. In storage, these findings lead us to believe substantial differences between Streptomyces isolates will allow for some isolates to be effective biological controls at controlling diseases on common pathogens of potatoes.

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Pythium insidiosum, classificado no Reino Stramenipila e Classe Oomycetes, é o agente etiológico da pitiose, uma doença diagnosticada principalmente em equinos, caninos e humanos. A secreção de enzimas por micro-organismos é considerada um fator importante na invasão tecidual. O presente estudo teve como objetivo analisar a atividade enzimática de isolados de P. insidiosum obtidos de lesões equinas (n=13), coelhos infectados experimentalmente (n=2) e uma amostra padrão (ATCC). Para isso, utilizou-se o kit comercial API ZYM. Zoósporos foram cultivados em caldo RPMI 1640 por 24h a 37 oC. Após esse período, a presença de hifas foi observada, as quais foram separadas e 65μl do líquido restante foram inoculados em cada um dos 20 poços (um controle e 19 com substratos específicos para cada enzima) do kit. As galerias foram então incubadas por 4 h a 37 oC. Os resultados foram obtidos através da leitura visual das reações. As análises foram feitas em triplicata e submetidas à análise de variância utilizando um nível de significância de 5%. Houve uma variação intraespecífica na atividade enzimática entre os isolados, sendo que enzimas dos grupos fosfohidrolases e éster hidrolases foram as mais prevalentes. Esses dados demonstram a capacidade de P. insidiosum em secretar enzimas que degradam substratos presentes em animais e em plantas, bem como a variabilidade enzimática entre os isolados. / Pythium insidiosum is classified in the kingdom Stramenipila, class Oomycetes. It causes pythiosis, a disease mainly diagnosed in horses, dogs, and humans. This study aimed at analyzing the enzymatic activity of P. insidiosum isolates obtained from equine lesions (n=13), experimentally infected rabbits (n=2) and a standard strain (ATCC 58637). To address this issue, the API ZYM commercial kit was used. Zoospores were cultivated in RPMI 1640 broth for 24 h at 37oC. After this period, the presence of hyphae was observed and they were carefully separated from the liquid phase. Then, 65 μl of this liquid were inoculated in each of the 20 microwells (one control, 19 containing specific substrates for each enzyme) of the API ZYM kit. The strips were incubated for 4h at 37oC. Results were obtained by visual observation of the reactions. The tests were carried out in triplicate and submitted to an analysis of variance using a significance level of 5%. An intraspecific variation among the enzymatic activities was observed among the isolates, where the group of phosphohydrolases and ester hydrolases were conspicuous among most of the isolates. Data here obtained highlighted the capacity of P. insidiosum in secreting enzymes capable of degrading substrates present in animals and plants, besides the enzymatic variability among the isolates.

Pythium insidiosum, classificado no Reino Stramenopila e Classe Oomycetes, é o agente etiológico da pitiose, uma doença diagnosticada principalmente em eqüinos, caninos e humanos. As atividades in vitro do voriconazol, itraconazol e terbinafina, sozinhos ou em combinação, foram estudadas empregando uma metodologia de macrodiluição baseada na técnica M 38-A (CLSI, 2002) contra 30 isolados clínicos de Pythium insidiosum, com o objetivo de avaliar novas medidas para tratar infecções causadas por este agente utilizando quimioterapia. As combinações (terbinafina e voriconazol; terbinafina e itraconazol) tiveram suas interações avaliadas utilizando a técnica de checkerboard seguindo o modelo da macrodiluição em caldo. Terbinafina foi ativa quando testada sozinha, mostrando uma concentração inibitória mínima (CIM) e concentração fungicida mínima ≤ 8,0 mg/L para todos os isolados. Voriconazol e itraconazol foram inativos contra os isolados testados quando usados sozinhos. A combinação de voriconazol com terbinafina foi sinérgica contra 17% das amostras e indiferente em 25 (83%) amostras. O uso concomitante de terbinafina e itraconazol foi sinérgico contra 17% e indiferente contra 83% das amostras. As interpretações de ambas as interações foram equivalentes para 26 isolados (87%): vinte e três foram indiferentes e três mostraram efeito sinérgico. Antagonismo não foi observado. A terapia combinada é uma alternativa à monoterapia, especialmente para pacientes com infecções invasivas que são difíceis de tratar. Estes resultados precisam ser correlacionados com relatos clínicos; e ensaios in vivo, usando modelos animais, podem preencher a lacuna entre avaliações clínicas e avaliações in vitro das drogas. / Pythium insidiosum is classified in the kingdom Stramenopila, class Oomycetes. It causes pythiosis, a disease mainly diagnosed in horses, dogs, and humans. In order to evaluate new approaches to treat infections caused by Pythium insidiosum using chemotherapy, the in vitro activities of voriconazole, itraconazole and terbinafine, alone or in combination, against 30 clinical isolates were studied employing a macrodilution methodology based on the M 38-A technique (CLSI, 2002). The combinations (terbinafine plus voriconazole and terbinafine plus itraconazole) had their interactions evaluated using the checkerboard technique following the broth macrodilution design. Terbinafine was active when used as a single drug, showing minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal fungicidal concentration ≤ 8,0 mg/L for all the isolates. Voriconazole and itraconazole were inactive against the isolates tested when used alone. The combination of voriconazole with terbinafine was synergic against 17% of the strains and indifferent on 25 (83%) strains. The concomitant use of terbinafine and itraconazole was synergic against 17% and indifferent against 83% of the strains. The interpretations of both interactions were equivalent for 26 isolates (87%): twenty three were indifferent and three showed synergistic effect. Antagonism was not observed. Combination therapy provides an alternative to monotherapy, especially for patients with invasive infections that are difficult to treat. These results need to be correlated with clinical outcomes, and in vivo assays using experimental animal models could bridge the gap between in vitro and clinical evaluation of drugs.

Pythium insidiosum, classificado no Reino Stramenipila e Classe Oomycetes, é o agente etiológico da pitiose, uma doença diagnosticada principalmente em equinos, caninos e humanos. A secreção de enzimas por micro-organismos é considerada um fator importante na invasão tecidual. O presente estudo teve como objetivo analisar a atividade enzimática de isolados de P. insidiosum obtidos de lesões equinas (n=13), coelhos infectados experimentalmente (n=2) e uma amostra padrão (ATCC). Para isso, utilizou-se o kit comercial API ZYM. Zoósporos foram cultivados em caldo RPMI 1640 por 24h a 37 oC. Após esse período, a presença de hifas foi observada, as quais foram separadas e 65μl do líquido restante foram inoculados em cada um dos 20 poços (um controle e 19 com substratos específicos para cada enzima) do kit. As galerias foram então incubadas por 4 h a 37 oC. Os resultados foram obtidos através da leitura visual das reações. As análises foram feitas em triplicata e submetidas à análise de variância utilizando um nível de significância de 5%. Houve uma variação intraespecífica na atividade enzimática entre os isolados, sendo que enzimas dos grupos fosfohidrolases e éster hidrolases foram as mais prevalentes. Esses dados demonstram a capacidade de P. insidiosum em secretar enzimas que degradam substratos presentes em animais e em plantas, bem como a variabilidade enzimática entre os isolados. / Pythium insidiosum is classified in the kingdom Stramenipila, class Oomycetes. It causes pythiosis, a disease mainly diagnosed in horses, dogs, and humans. This study aimed at analyzing the enzymatic activity of P. insidiosum isolates obtained from equine lesions (n=13), experimentally infected rabbits (n=2) and a standard strain (ATCC 58637). To address this issue, the API ZYM commercial kit was used. Zoospores were cultivated in RPMI 1640 broth for 24 h at 37oC. After this period, the presence of hyphae was observed and they were carefully separated from the liquid phase. Then, 65 μl of this liquid were inoculated in each of the 20 microwells (one control, 19 containing specific substrates for each enzyme) of the API ZYM kit. The strips were incubated for 4h at 37oC. Results were obtained by visual observation of the reactions. The tests were carried out in triplicate and submitted to an analysis of variance using a significance level of 5%. An intraspecific variation among the enzymatic activities was observed among the isolates, where the group of phosphohydrolases and ester hydrolases were conspicuous among most of the isolates. Data here obtained highlighted the capacity of P. insidiosum in secreting enzymes capable of degrading substrates present in animals and plants, besides the enzymatic variability among the isolates.

Pythium insidiosum é o oomiceto causador da pitiose uma doença de caráter crônico de difícil tratamento que acomete humanos e animais. Este microrganismo aquático semelhante aos fungos possui características distintas de parede celular e ausência de ergosterol na membrana celular, particularidades estas que dificultam o tratamento da doença com antifúngicos tradicionais. O presente estudo teve por objetivos: avaliar as interações sinérgicas das associações de antibacterianos, antifúngicos e compostos fenólicos sobre P. insidiosum; comparar, in vivo e in vitro, a monoterapia e combinação de azitromicina, claritromicina, minociclina e tigeciclina em coelhos com pitiose experimental. Para os testes in vitro de microdiluição em caldo foram utilizados 30 isolados de P. insidiosum, conforme o protocolo de M38-A2 do CLSI. Para os testes in vivo, os animais foram distribuídos nos grupos: Infectados com zoósporos de P. insidiosum, tratados com placebo (Controle positivo, n=6) e não infectados tratados com placebo (controle negativo, n=5), tratados com azitromicina; claritromicina; minociclina; e tigeciclina (n=6); e com as combinações minociclina com azitromicina; minociclina com claritromicina; minociclina com tigeciclina (n=6). Amostras de sangue, medidas da área da lesão, e tecidos foram coletados para análise antes, durante e ao término do tratamento. Índices mais elevados de sinergismo foram obtidos com a associação de claritromicina com micafungina (73,33%); minociclina com claritromicina ou azitromicina (93,33%); itraconazol com os compostos fenólicos timol ou carvacrol (96,60%) e minocilina com claritromicina, azitromicina (93,33%) ou tigeciclina (86,67%). Interações antagônicas das associações de timol ou carvacrol com antibacterianos ou antifúngicos, e antibiótico com antibiótico, não foram observadas. Porém nas associações de antibacterianos com antifúngicos os percentuais mais altos foram vistos em claritromicina ou azitromicina com itraconazol (6,67%) e minociclina com caspofungina (6,67%). A completa regressão da pitiose foi comprovada pela queda nos níveis de anticorpos, regressão das lesões e negatividade nos testes de detecção de hifas em tecido: PCR, histopatologia e isolamento. Nos tratamentos in vivo todos os grupos diferiram do controle positivo. Cura clínica e completa regressão da lesão foram obtidos nos tratamentos com azitromicina (n=5∕6), minociclina (n=1∕6), azitromicina com minociclina (n=4∕6), minociclina com claritromicicna (n=1∕6) e minociclina com tigeciclina (n=1∕6). A comparação in vitro das associações de minociclina com azitromicina ou claritromicina (93,33%), e tigeciclina (86,67) revelou percentuais de sinergismo elevados, no entanto a correlação destes dados com o in vivo demonstra o cuidado na escolha da associação, pois claritromicina (93,33%) e tigeciclina (86,67%) mesmo apresentando altos índices de sinergismo com minociclina nos testes in vivo tiveram um baixo percentual de regressão das lesões (16,66%). Além disso, os tecidos coletados submetidos à análise molecular e histopatológica revelaram que a tigeciclina mesmo em associação com minociclina não foi capaz de conter a metástase da pitiose para os pulmões. A azitromicina em monoterapia demonstrou ser a melhor terapia para a regressão completa das lesões causadas pela pitiose. / Pythium insidiosum is the cause of the oomycete pythiosis one chronic nature of the disease is difficult to treat that affects humans and animals. This water organism similar to fungi has distinct characteristics of cell wall and absence of ergosterol in the cell membrane, these peculiarities that make it difficult to treat the disease with traditional antifungal agents. This study aimed to: assess the synergistic interactions of antibiotics associations, antifungal and phenolic compounds on P. insidiosum; comparison, in vivo and in vitro, monotherapy and combination of azithromycin, clarithromycin, tigecycline with minocycline in rabbits with pythiosis experimental. For testing in vitro broth microdilution were used 30 strains of P. insidiosum as the M38-A2 CLSI protocol. For tests in vivo, the animals were divided into groups: Infected with zoospores of P. insidiosum treated with placebo (positive control, n = 6) and uninfected treated with placebo (negative control, n = 5) treated with azithromycin; clarithromycin; minocycline and tigecycline (n = 6); and minocycline + azithromycin combinations; minocycline and clarithromycin; minocycline and tigecycline (n = 6). Blood samples, the lesion area of measures, and tissues were collected for analysis before, during and after treatment. Higher rates of synergism were obtained with the clarithromycin association with micafungin (73.33%); minocycline with clarithromycin or azithromycin (93.33%); itraconazole with phenolic compounds thymol or carvacrol (96.60%) and minocycline with clarithromycin or azithromycin (93.33%) and tigecycline (86.67%). Antagonistic interactions of thymol or carvacrol associations with antibiotics or antifungal and antibiotic and antibiotic, were observed. However, the associations with antifungal antibiotics the highest percentages were seen in clarithromycin or azithromycin with itraconazole (6.67%) and minocycline with caspofungin (6.67%). The regression of lesions caused by pythiosis was confirmed by the fall in antibodies, regression of lesions and negativity in hyphae detection tests in tissue: PCR, histopathology and isolation. In treatments in vivo all groups differed from positive control. Clinical cure and complete regression of the lesion were obtained in the treatments with azithromycin (n = 5/6), minocycline (n = 1/6), azithromycin or minocycline (n = 4/6), clarithromycin and minocycline (n = 1/6) and tigecycline with minocycline (n = 1/6). In vitro comparisons of minocycline associations with azithromycin or clarithromycin (93.33%), and tigecycline (86.67) showed high percentages of synergism, however the correlation of these data with in vivo demonstrates the care in the association of choice, for clarithromycin (93.33%) and TIG (86.67%) even with high rates of synergism with minocycline in vivo tests had a low percentage of cure (16.66%). In addition, the collected tissues subjected to molecular and histological analysis revealed that even in tigecycline and tigecycline with minocycline association was not able to contain the disease metastasis to the lungs.The azithromycin monotherapy was shown to be the best therapy to the regression of lesions caused by pythiosis.

Oomycete Pythium insisiosum is the etiologic agent of pythiosis, chronic and granulomatous disease, which affects humans and animals in tropical and subtropical areas of the world. Due to ergosterol absence in the plasmatic membrane of this microorganism, treatments based on antifungal agents have been ineffective. Immunotherapy has emerged showing promising results. In this context, the improvement of the immunotherapy was the main goal of this study, whose first purpose was to characterize the immunodominant antigens from this species (P. insidosum ATCC 58637 and P. insidiosum 210-LAPEMI) through sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel eletrophoresis (SDS-PAGE). Some proteins showing 15 kDa to 120 kDa were detected, and bands were transferred to nitrocellulose membranes in order to develop the western blot tests. The second purpose was to characterize the humoral response to pythiosis in equine, in bovine and in experimental pythiosis in rabbits, considering the no treated disease, the disease cured by immunotherapy, the disease treated with immunotherapy but not cured, and the disease cured spontaneously. To encompass all these cases we have included sera from: a) horses cured by immunotherapy; b) horses with pythiosis but not responsive to immunotherapy; c) horses with pythiosis but not treated; d) bovines with pythiosis and showing spontaneous cure; e) rabbits with experimental pythiosis but not treated; and f) rabbits with experimental pythiosis treated with immunotherapy. All specimens recognized three immunodominant proteins: 74, 33 and 32 kDa. The sera from horses cured by immunotherapy (a) and bovine sera (d) recognized another immunodominant protein, 55 kDa, which was weakly positive or negative in the other groups. Thus, the 74, 33 and 32 kDa immunodominant proteins suggest a relevant function in the humoral response to pythiosis because they were recognized by horses, rabbits and bovines. In addition, the 55 kDa antigen, which is being reported here for the first time, is likely to be involved in the cure mechanisms stimulated by immunotherapy. / O oomiceto Pythium insidiosum é o agente etiológico da pitiose, doença granulomatosa crônica que afeta animais domésticos (eqüinos, bovinos, etc) e o homem, em regiões tropicais e subtropicais de todo mundo. A ausência de ergosterol na membrana plasmática deste microorganismo torna a antifungicoterapia muito limitada, donde a imunoterapia (a base de hifas rompidas) tem emergido com resultados promissores. A identificação de antígenos imunodominantes é fundamental para a consolidação dos imunoterápicos utilizados no tratamento da pitiose. Objetivando-se o refinamento destes imunoterápicos, o presente estudo teve como proposta inicial, caracterizar os antígenos imunodominantes desta espécie (P. insidosum ATCC 58637 e P. insidiosum 210-LAPEMI) através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Diversas proteínas de 120 a 15 kDa foram detectadas e, a seguir, eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose para realização de western blot. O segundo objetivo foi caracterizar a resposta humoral à doença em eqüinos, bovinos e na infecção experimental em coelhos, considerando-se a doença curada pela imunoterapia, doença tratada pela imunoterapia e não curada, doença não tratada, e na doença evidenciando cura espontânea. Para tanto, utilizou-se o soro de: a) eqüinos doentes e curados pela imunoterapia; b) eqüinos doentes e sem resposta a imunoterapia; c) eqüinos doentes e não tratados; d) bovinos doentes e com cura espontânea; e) coelhos infectados e tratados pela imunoterapia; f) coelhos infectados e não tratados. Todos os soros reconheceram três proteínas imunodominantes: 74, 33 e 32 kDa. O soro dos eqüinos doentes curados pela imunoterapia (a) e o soro dos bovinos (d) reconheceram também outra proteína imunodominante de 55 kDa, a qual, foi fracamente reconhecida ou ausente nos demais grupos. Assim, comprova-se que as proteínas de 74, 33 e 32 kDa desempenham relevante papel na resposta imune à pitiose, pois foram imunogênicas nas três espécies avaliadas. Em adição, sugere-se que a proteína de 55 kDa possa estar envolvida no mecanismo de cura promovido pela imunoterapia; ressalta-se que esta proteína é aqui pela primeira vez relatada.