Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-02-17T17:10:52Z No. of bitstreams: 1 NathaliaKellyDeAraujo_TESE.pdf: 3179382 bytes, checksum: 1d9cd507dd602cf235e6a9d53983b99a (MD5) / Approved for entry into archive by Monica Paiva (monicalpaiva@hotmail.com) on 2017-02-17T17:24:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 NathaliaKellyDeAraujo_TESE.pdf: 3179382 bytes, checksum: 1d9cd507dd602cf235e6a9d53983b99a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-17T17:24:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NathaliaKellyDeAraujo_TESE.pdf: 3179382 bytes, checksum: 1d9cd507dd602cf235e6a9d53983b99a (MD5) Previous issue date: 2015-03-23 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Uma cepa produtora de quitosanase foi isolada e identificada como Bacillus cereus C-01. A partir disso a purifica??o da enzima e sua caracteriza??o bioqu?mica foram estudadas. Para purifica??o foi utilizado a resina da linha streamline Dietilaminoetil (DEAE) e coluna de vidro (2,6 cm x 30,0 cm) em sistema de Adsor??o em Leito Expandido (ALE). As condi??es para a purifica??o da quitosanase foram otimizadas estatisticamente atrav?s de um Planejamento Composto Central. As vari?veis que influenciaram significativamente os par?metros fator de purifica??o (P) e rendimento da enzima (Y) foram determinadas. As an?lises estat?sticas mostraram que as melhores condi??es para o m?ximo P foram 150 cm.h-1 (velocidade de aplica??o da amostra/carga), 6,0 cm de altura do leito fixo e 7,36 cm de altura do distribuidor. Em condi??es otimizadas, a enzima mostrou ligar-se a resina na mesma medida usando caldo clarificado e n?o clarificado (0,32 e 0,3 U/g adsorvente, respectivamente). A fra??o recuperada ap?s a elui??o exibiu 31% de rendimento com um aumento de 1,35 vezes na atividade espec?fica em rela??o ao inicial. Se analisada apenas fra??o elu?da com NaCl 0,3 M ? poss?vel encontrar um fator de purifica??o de 1,75. A enzima purificada apresentou estabilidade entre as temperaturas de 30-55?C durante 60 minutos, pH de 5-8 por 24 horas, e apresentou m?xima atividade em pH 5,5 e temperatura de 55?C. Os ?ons de Cu2+, Fe2+ e Zn2+ foram inibit?rios para a quitosanase. Em contraste, a enzima foi significativamente ativada por Mn2+. Os resultados demonstraram que ? poss?vel purificar m?ltiplas prote?nas, a partir de um extrato bruto sem qualquer pr?-tratamento, com um processo de purifica??o econ?mico e de um ?nico passo. / Uma cepa produtora de quitosanase foi isolada e identificada como Bacillus cereus C-01. A partir disso a purifica??o da enzima e sua caracteriza??o bioqu?mica foram estudadas. Para purifica??o foi utilizado a resina da linha streamline Dietilaminoetil (DEAE) e coluna de vidro (2,6 cm x 30,0 cm) em sistema de Adsor??o em Leito Expandido (ALE). As condi??es para a purifica??o da quitosanase foram otimizadas estatisticamente atrav?s de um Planejamento Composto Central. As vari?veis que influenciaram significativamente os par?metros fator de purifica??o (P) e rendimento da enzima (Y) foram determinadas. As an?lises estat?sticas mostraram que as melhores condi??es para o m?ximo P foram 150 cm.h-1 (velocidade de aplica??o da amostra/carga), 6,0 cm de altura do leito fixo e 7,36 cm de altura do distribuidor. Em condi??es otimizadas, a enzima mostrou ligar-se a resina na mesma medida usando caldo clarificado e n?o clarificado (0,32 e 0,3 U/g adsorvente, respectivamente). A fra??o recuperada ap?s a elui??o exibiu 31% de rendimento com um aumento de 1,35 vezes na atividade espec?fica em rela??o ao inicial. Se analisada apenas fra??o elu?da com NaCl 0,3 M ? poss?vel encontrar um fator de purifica??o de 1,75. A enzima purificada apresentou estabilidade entre as temperaturas de 30-55?C durante 60 minutos, pH de 5-8 por 24 horas, e apresentou m?xima atividade em pH 5,5 e temperatura de 55?C. Os ?ons de Cu2+, Fe2+ e Zn2+ foram inibit?rios para a quitosanase. Em contraste, a enzima foi significativamente ativada por Mn2+. Os resultados demonstraram que ? poss?vel purificar m?ltiplas prote?nas, a partir de um extrato bruto sem qualquer pr?-tratamento, com um processo de purifica??o econ?mico e de um ?nico passo.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MariaGBP.pdf: 1032728 bytes, checksum: 535260d4afcd2c2deeacab5b5006e73c (MD5) Previous issue date: 2008-10-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The obtaining of the oligosaccharides from chitosanase, has showed interest of the pharmaceutical area in the last years due their countless functional properties. Although, the great challenge founded out is how to keep a constant and efficient production. The alternative proposed by this present work was to study the viability to develop an integrated technology, with reduced costs. The strategy used was the obtaining of the oligomers through enzymatic hydrolysis using chitosanolitic enzymes obtained straight from the fermented broth, eliminating this way the phases involved in the enzymes purification. The two chitosanases producing strains chosen for the work, Paenibacillus chitinolyticus and Paenibacillus ehimensis, were evaluated according to the behavior in the culture medium with simple sugar and in relation to the pH medium variations. The culture medium for the chitosanases induction and production was developed through addition of soluble chitosan as carbon source. The soluble chitosan was obtained using hydrochloric acid solution 0.1 M and afterwards neutralization with NaOH 10 M. The enzymatic complexes were obtained from induction process in culture medium with 0.2% of soluble chitosan. The enzymes production was verified soon after the consumption of the simple sugars by the microorganisms and the maximum chitosanolitic activity obtained in the fermented broth by Paenibacillus chitinolyticus was 249 U.L-1 and by Paenibacillus ehimensis was 495U.L-1. These two enzymatic complexes showed stability when stored at 20?C for about 91 days. The enzymes in the fermented broth by Paenibacillus chitinolyticus, when exposed at temperature of 55?C and pH 6.0, where the activity is maximum, showed 50% lost of activity after 3 hours Meanwhile, for the complex produced by Paenibacillus ehimensis, after 6 days of exposure, it was detected 100% of the activity. The chito-oligosaccharides obtained by the hydrolysis of a 1% chitosan solution, using the enzymatic complex produced by Paenibacillus chitinolyticus showed larger quantity after 9 hours hydrolysis and using the complex produced by Paenibacillus ehimensis after 20 minutes was observed the chito-ligosacharides with polymerization degree between 3 and 6 units. Evaluating these results, it was verified that the production of chitosan-oligosaccharides is possible, using a simultaneous process / A obten??o de oligossacar?deos, a partir da quitosana, tem despertado interesse da ?rea farmac?utica nos ?ltimos anos devido as suas in?meras propriedades funcionais. Por?m, o grande desafio encontrado ? manter uma produ??o constante e eficiente. A alternativa proposta por este trabalho foi estudar a viabilidade de desenvolver uma tecnologia integrada e de baixo custo. A estrat?gia utilizada foi a obten??o dos olig?meros por meio de hidr?lise enzim?tica utilizando enzimas quitosanol?ticas obtidas diretamente do caldo fermentado, eliminando dessa forma as etapas envolvidas na purifica??o de enzimas. As duas cepas produtoras de quitosanases selecionadas para o trabalho, Paenibacillus chitinolyticus e Paenibacillus ehimensis, foram avaliadas quanto ao comportamento em meio de cultivo contendo a??cares simples e em rela??o as varia??es de pH do meio. O meio de cultivo para a indu??o e produ??o das quitosanases foi desenvolvido atrav?s da adi??o de quitosana sol?vel como fonte de carbono. A quitosana sol?vel foi obtida utilizando solu??o de ?cido clor?drico 0,1 M e posterior neutraliza??o com NaOH 10 M. Os complexos enzim?ticos foram obtidos a partir de processos de indu??o em meio de cultivo contendo 0,2% de quitosana sol?vel. A produ??o das enzimas foi observado logo ap?s o t?rmino do consumo dos a??cares simples pelos microrganismos e a m?xima atividade quitosanol?tica obtida no caldo fermentado pelo Paenibacillus chitinolyticus foi de 249 U.L-1 e pelo Paenibacillus ehimensis foi de 495 U.L-1. Esses dois complexos enzim?ticos apresentaram estabilidade quando armazenadas a -20?C por at? 91 dias. As enzimas presentes no caldo fermentado pelo Paenibacillus chitinolyticus, quando expostas ? temperatura de 55?C e pH 6,0, onde a atividade ? m?xima, apresentaram perda de 50% da atividade ap?s 3 horas. Enquanto que, para o complexo produzido pelo Paenibacillus ehimensis, ap?s 6 dias de exposi??o, 100% da atividade foi detectada. Os quito-oligossacar?deos obtidos a partir da hidr?lise de uma solu??o de 1% de quitosana, utilizando o complexo enzim?tico produzido pelo Paenibacillus chitinolyticus, apresentaram-se em maior quantidade ap?s 9 horas de hidr?lise e utilizando o complexo produzido pelo Paenibacillus ehimensis, ap?s 20 minutos pode-se observar os quito-oligossacar?deos com grau de polimeriza??o entre 3 e 6 unidades. Avaliando esses resultados, foi verificado que ? poss?vel a produ??o de quito-oligossacar?deos utilizando um processo simult?neo

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RaimundoCSF.pdf: 2059810 bytes, checksum: 4d1a84d062e046ae8304a415fa8bdd6b (MD5) Previous issue date: 2005-12-13 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / In this work a 24 factorial design with triplicate at central point was used in order to investigate the influence of chitosan concentration (substrate) (Cs), culture media temperature (CMT), aeration ratio (AR) as well as agitation (A) on chitosanase production by Aspergillus ochraceus. Experiments were carried out using the following levels to the factors: (Cs) (-1) 0.1%; (0) 0.15%; (+1) 0.2%; (TMC) (-1) 25 minutes; (0) 30 minutes; (+1) 35 minutes; (RA) (-1) 0.4; (0) 0.6; (+1) 0.8; (A) (-1) 90 rpm, (0) 120 rpm, (+1) 150 rpm. One chitosanolytic activity (U.mL-1) was defined as the enzyme necessary to produce 1.0 mmol.min-1 of glicosamine by mL of extract. Chitosanolytic assays were carried out using two extract volumes, 0.05 and 0.1 mL, respectively. Results showed that was possible to produce chitosanase of order aproximatelly 5,9 U.mL-1 by Aspergillus ochraceus and chitosanolytic activity was increased by increment on substrate concentration, aeration ratio as well as agitation while media culture temperature increment decreased activity / No presente trabalho utilizou-se um planejamento fatorial 24 com repeti??o em triplicata no ponto central, para se investigar a influ?ncia dos fatores: concentra??o de quitosana (substrato) (Cs), temperatura de cultivo (TMC), raz?o de aera??o (RA) e agita??o (A) na produ??o da enzima quitosanase por Aspergillus ochraceus. Os ensaios foram realizados aleatoriamente utilizando-se os seguintes n?veis para os fatores: (Cs) (-1) 0,1%; (0) 0,15%; (+1) 0,2%; (TMC) (-1) 25 minutos; (0) 30 minutos; (+1) 35 minutos; (RA) (-1) 0,4; (0) 0,6; (+1) 0,8; (A) (-1) 90 rpm, (0) 120rpm, (+1) 150 rpm. Uma unidade de atividade quitosanol?tica (U.mL-1) foi definida como a quantidade de enzima necess?ria para produzir (1,0 mmol.min-1) de glicosamina por mL de extrato enzim?tico. Para o teste de atividade quitosanol?tica foram utilizados dois volumes diferentes de caldo enzim?tico 0,05 mL e 0,1 mL, respectivamente. Os resultados mostraram que foi poss?vel produzir quitosanase em concentra??o aproximada de 5,9 U.mL-1 utilizando Aspergillus ochraceus e que a atividade foi favorecida pelo aumento da agita??o (A), da raz?o de aera??o (RA) e da concentra??o de substrato (Cs), enquanto que o aumento da temperatura de cultivo (TMC) n?o favoreceu a resposta (atividade quitosanol?tica)

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RaimundoCSF_TESE.pdf: 5128355 bytes, checksum: 983c8be1a2dbc05edd6e91353e650c3b (MD5) Previous issue date: 2013-04-05 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / In this work a Plackett-Burman Design with 8 factors and 12 trials in 2 levels with 3 repetitions at the center point was used in order to investigate the influence of the concentration of chitosan, peptone, yeast extract, NaNO3, K2HPO4, KCl, MgSO4.7H2O and FeSO4 on chitosanase production by Metarhizium anisopliae. Runs were carried out using submerged discontinuous cultivation for enzyme production. The results of the Plackett & Burman Design showed that only two factors, chitosan concentration as well as FeSO4 had influence on chitosanolytic activity, while the increase in concentration of other factors not contributed significantly to the quitosanol?tica activity. Cultivation medium optimization for enzyme production was carried out using a Composite Central Design, with the most important factors for chitosanolytic activity (chitosan and FeSO4), in accordance with Plackett & Burman Design, and keeping the other nutrients in their minimum values. On this other design, it was taken the highest limit in Plackett & Burman Design as the lowest limit (-1) to FeSO4 factor. The results showed that the enzyme production was favoured by increasing the chitosan concentration and by decreasing FeSO4. Maximum production for chitosanolytic activity was about 70.0 U/L and was reached in only 18 h of fermentation, a result about twenty-eight times greater than a former study using the same microorganism (about 2.5 U/L at 48 h) / No presente trabalho utilizou-se um Planejamento Plackett & Burman, com 8 fatores e 12 ensaios em 2 n?veis e mais 3 repeti??es na condi??o do ponto central, para se investigar a influ?ncia das concentra??es de quitosana, peptona, extrato de levedura, NaNO3, K2HPO4, KCl, MgSO4.7H2O e FeSO4 na produ??o da enzima quitosanase por Metarhizium anisopliae. Os ensaios para produ??o da enzima foram realizados em cultivo descont?nuo submerso. Os resultados para o Planejamento Plackett & Burman mostraram que a atividade quitosanol?tica foi favorecida pelo aumento da concentra??o de substrato (quitosana) e de sulfato ferroso (FeSO4), enquanto que o aumento da concentra??o dos outros fatores n?o contribuiu de forma significativa para a atividade quitosanol?tica. A otimiza??o do meio de cultura para a produ??o da enzima foi realizado por meio de um Planejamento Composto Central, com os dois fatores que mais influenciaram a atividade quitosanol?tica (quitosana e FeSO4), conforme Planejamento Plackett & Burman, mantendo-se os outros nutrientes em seus valores m?nimos. Nesse planejamento, para o fator FeSO4, tomou-se o limite inferior (-1) como sendo o limite superior do Planejamento Plackett & Burman. Os resultados mostraram que a produ??o da enzima foi favorecida pelo aumento da concentra??o quitosana e pela diminui??o da concentra??o de FeSO4. A produ??o m?xima de atividade quitosanol?tica foi da ordem de 70,0 U/L e foi atingida em apenas 18 h de fermenta??o, resultado esse vinte e oito vezes maior aos obtidos anteriormente para o mesmo microrganismo que foi 2,5 U/L em 48h