Yes / Dickeya sp. strain 2B12 was isolated from a freshwater lake in Malaysia. Here, we report the draft genome sequence of Dickeya sp. 2B12 sequenced by the Illumina MiSeq platform. With the genome sequence available, this genome sequence will be useful for the study of quorum-sensing activity in this isolate. / University of Malaya High-Impact Research( HIR)grants(UMC/625/1/HIR/MOHE/CHAN/01[no.A-000001- 50001] and UM-MOHE HIR UM C/625/1/HIR/MOHE/CHAN/14/1 [no. H-50001-A000027])

Yes / Burkholderia spp. rely on N-acyl homoserine lactone as quorum-sensing signal molecules which coordinate their phenotype at the population level. In this work, we present the whole genome of Burkholderia sp. strain A9, which enables the discovery of its N-acyl homoserine lactone synthase gene. / UM High Impact Research Grants (UM-MOHE HIR grant UM C/625/1/HIR/MOHE/CHAN/01, H-50001-A000001 and UMMOHE HIR Grant UM C/625/1/HIR/MOHE/CHAN/14/1, H-50001- A000027)

Yes / Aeromonas hydrophila has emerged worldwide as a human pathogen. Here, we report the draft whole-genome sequence of a freshwater isolate from Malaysia, A. hydrophila strain M062, and its N-acylhomoserine lactone genes are also reported here. / University of Malaya via High-Impact Research Grants (UM C/625/1/HIR/MOHE/CHAN/01, no. A-000001- 50001), and aUM-MOHEHIR grant (UM C/625/1/HIR/MOHE/CHAN/ 14/1, no. H-50001-A000027)

Yes / We report the draft genome sequence of Pandoraea sp. strain E26 isolated from a former landfill site, sequenced by the Illumina MiSeq platform. This genome sequence will be useful to further understand the quorum-sensing system of this isolate. / University of Malaya High-Impact Research (HIR) grants (UM C/625/1/HIR/MOHE/CHAN/01, grant A-000001- 50001 and UM-MOHE HIR UM C/625/1/HIR/MOHE/CHAN/14/1, grant H-50001-A000027)

Genomas bacterianos são extremamente dinâmicos e boa parte dessa dinâmica ocorre devido a transferência horizontal e aquisição de DNA exógeno, um processo natural e fundamental para a evolução, adaptação e diversificação dos microrganismos. Ilhas genômicas são grandes regiões do cromossomo bacteriano adquiridas por transferência horizontal e estão presentes em apenas algumas linhagens, podendo conferir alguma vantagem adaptativa. Em Pseudomonas aeruginosa, até o momento foram caracterizadas pelo menos dezesseis ilhas genômicas e cada uma delas confere características diferentes a seus hospedeiros. Em P. aeruginosa UCBPP-PA14 (ou simplesmente PA14), encontram-se duas ilhas de patogenicidade denominadas PAPI-1 e PAPI-2, sendo a primeira a maior e a mais estudada, contendo 115 ORFs (“Open Reading Frame”, ou quadros abertos de leitura). Dentre estes, o gene int codifica uma integrase essencial para a excisão e integração de PAPI-1, e o gene soj é necessário para a manutenção da ilha na célula e é expresso apenas quando esta se encontra na forma epissomal. PAPI-1 codifica um provável sistema de secreção tipo IV (T4SS), similar ao do elemento móvel ICEHin1056, responsável pela transferência deste para outras bactérias. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores genéticos e ambientais que contribuem para a transferência de PAPI-1 entre linhagens de P. aeruginosa. Foi observado que os mutantes por transposon nos genes PAPI-1 PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 e PA14_59940 têm a frequência de transferência de PAPI-1 diminuída, mas os genes interrompidos nesses mutantes não são essenciais para a excisão da ilha. Também foi mostrado que os reguladores percepção de quorum RhlR e MvfR têm influência na expressão do gene int, mas não de soj. O terceiro regulador de percepção de quorum, LasR, assim como a proteína H-NS MvaT, não tem influência na expressão de int e de soj. Ensaios de RT-PCR quantitativos mostraram que o choque térmico aumentou os níveis do mRNA de soj, mas não de int, corroborando dados previamente sugeridos pela literatura, que mostram uma maior freqüência de transferência de PAPI-1 nessas condições. Também foi analisado se o segundo mensageiro celular em bactérias, c-di-GMP, poderia contribuir para a excisão/manutenção de PAPI-1. Alterações nas concentrações deste segundo mensageiro pela superexpressão de proteínas responsáveis por sua síntese ou degradação não foram capazes de afetar a excisão/manutenção de PAPI-1. Houve diminuição na frequência de transferência de PAPI-1 a partir de linhagens doadoras superexpressando uma diguanilato ciclase ou uma fosfodiesterase de c-di-GMP, mas provavelmente este efeito não se deve aos níveis alterados desse segundo mensageiro. Em Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), uma região de 86 kb possui uma grande semelhança com PAPI-1 na organização dos genes. Além disso, possui uma série de ORFs relacionados aos genes “core” que definem uma família de ilhas genômicas sintênicas das quais PAPI-1 faz parte. Entretanto, os genes acessórios encontrados entre os blocos de genes conservados varia muito entre PAPI-1 e a região de XAC. Foi determinado que esta região de XAC não pode se excisar do cromossomo nas condições analisadas. Por fim, com o intuito de verificar as possíveis interações entre os produtos dos genes conservados em PAPI-1 e XAC, ensaios de duplo-híbrido foram realizados, porém não foi possível determiná-las, visto que apenas resultados falsos positivos foram obtidos. Este trabalho mostrou pela primeira vez que a percepção de quorum está envolvida com a expressão de soj e determinou uma extensa similaridade entre essa ilha e uma região do genoma de XAC / Bacterial genomes are extremely dynamic mostly because of horizontal gene transfer, a natural and fundamental process for evolution, adaptation and diversification of microorganisms. Genomic islands are large DNA segments acquired by horizontal gene transfer which are present only in a few strains and may confer some adaptative advantage. At least sixteen genomic islands have been characterized in Pseudomonas aeruginosa to date and each confers different characteristics to its host strain. P. aeruginosa UCBPP-PA14 (PA14) harbors two pathogenicity islands named PAPI-1 and PAPI-2. PAPI-1 is the largest one, carrying 115 open reading frames (ORFs). Among these, int codes for an integrase essential for PAPI-1 excision and integration, and soj is required for maintaining PAPI-1 in the cells, being expressed only when this island is in an episomal, circular form. PAPI-1 also harbors genes coding for a type four secretion system (T4SS) similar to the mobile element ICEHin1056, which is responsible for transferring this element to other bacteria. In this work, we show that transposon insertion in PAPI-1 genes PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 and PA14_59940 lowered the frequency of conjugation of PAPI-1 from PA14 to other bacteria, but those genes were not essential for PAPI-1 excision. Quorum sensing regulators RhlR and MvfR had a role in int expression, but did not alter soj transcription. The third quorum sensing regulator LasR, as well as the H-NS protein MvaT, did not alter both int and soj expression. Quantitative RT-PCR assays showed that cells incubated at heat shock conditions present higher levels of soj, mRNA, confirming published data that showed an increase in PAPI-1 transfer in these conditions. It was also analyzed whether the second messenger c-di-GMP would contribute to PAPI-1 excision/maintenance. Changes in the levels of this second messenger in cells overexpressing proteins responsible for its synthesis or degradation did not affect PAPI-1 excision and maintenance. A decrease in PAPI-1 transfer frequency was detected when those cells were used as donors in conjugation, but this effect cannot be attributed to the altered c-di-GMP levels. In Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), an 86 kb genome region shares similarity with PAPI-1 regarding gene homology and organization. It also carries ORFs related to the core genes that define a syntenic family of genomic islands that includes PAPI-1. Nevertheless, the accessory genes dispersed among the clusters of conserved genes are not related, when comparing PAPI-1 and this region in XAC. An epissomal form of this putative XAC island could not be detected in the conditions tested in this work. Finally, in order to verify interactions involving the conserved proteins in PAPI-1 and XAC, two hybrid assays were carried out, but only false positives results were obtained

O Cancro Cítrico, um dos mais graves problemas fitossanitários da citricultura atual, é uma doença causada pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Um estudo funcional do genoma de Xac foi iniciado com o intuito de identificar interações proteína-proteína envolvidas em processos de patogenicidade de Xac. Através da utilização do sistema duplo-híbrido de levedura, baseado nos domínios de ligação ao DNA e ativação da transcrição do GAL4, nós analisamos os principais componentes dos mecanismos de patogenicidade de Xac, incluindo o Sistema de Secreção do Tipo III (TTSS), Sistema de Secreção do Tipo IV (TFSS) e Sistema de \"Quorum Sensing\" composto pelas proteínas Rpf. Componentes desses sistemas foram utilizados como iscas na triagem de uma biblioteca genômica de Xac. O TTSS é codificado pelos genes denominados hrp (\"hypersensitive response and pathogenicity\"), hrc (\"hrp conserved\") e hpa (\"hrp associated\") localizados no locus hrp do cromossomo de Xac. Esse sistema de secreção é capaz de translocar proteínas efetoras do citoplasma bacteriano para o interior da célula hospedeira. Nossos resultados mostraram novas interações proteínaproteína entre componentes do próprio TTSS além de associações específicas com uma proteína hipotética: 1) HrpG, um regulador de resposta de um sistema de dois componentes responsável pela expressão dos genes hrp, e XAC0095, uma proteína hipotética encontrada apenas em Xanthomonas spp; 2) HpaA, uma proteína secretada pelo TTSS, HpaB e o domínio C-terminal da HrcV; 3) HrpB1, HrpD6 e HrpW, 4) HrpB2 e HrcU e 5) interações homotrópicas envolvendo a ATPase HrcN. Em Xac, foram encontrados dois loci vir que codificam proteínas que possuem similaridade com componentes do TFSS envolvido em processos de conjugação/secreção bacteriana: TFSS-plasmídeo localizado no plasmídeo pXAC64 e TFSS-cromossomo localizado no cromossomo de Xac. O TFSS-plasmídeo, o qual possui maior similaridade com sistemas de conjugação, mostrou interações envolvendo proteínas cujos genes estão localizados na mesma região do plasmídeo pXAC64: 1) interação homotrópica da TrwA; 2) XACb0032 e XACb0033; 3) interações homotrópicas da proteína XACb0035; 4) VirB1 e VirB9; 5) XACb0042 e VirB6; 6) XACb0043 e XACb0021b. O TFSS-cromossomo apresentou interações envolvendo as proteínas: 1) VirD4 e um grupo de 12 proteínas que contém similaridade entre si, incluindo XAC2609 cujo gene encontra-se no locus vir, 2) XAC2609 e XAC2610; 3) Interações homotrópicas da VirB11; 4) XAC2622 e VirB9. A análise do sistema de \"Quorum-Sensing\" composto pelas proteínas Rpf mostrou interações envolvendo componentes do próprio sistema: 1) RpfC e RpfF; 2) RpfC e RpfG; 3) interações homotrópicas da RpfF; 4) RpfC e CmfA, uma proteína similar a Cmf de Dictyostelium discoideum que, neste organismo, é fundamental para processos de \"quorum-sensing\". As interações proteína-proteína encontradas permitiram-nos entender melhor a composição, organização e regulação dos fatores envolvidos na patogenicidade de Xac. / Citrus Canker, caused by the bacterial plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) presents one of the most serious problems to Brazilian citriculture. We have initiated a project to identify protein-protein interactions involved in pathogenicity of Xac. Using a yeast two-hybrid system based on GAL4 DNA-binding and activation domains, we have focused on identifying interactions involving subunits, regulators and substrates of: Type Three Secretion System (TTSS), Type Four Secretion System (TFSS) and Quorum Sensing/Rpf System. Components of these systems were used as baits to screening a random Xac genomic library. The TTSS is coded by the hrp (hypersensitive response and pathogenicity), hrc (hrp conserved) and hpa (hrp associated) genes in the chromosomal hrp locus. This secretion system can translocate efector proteins from the bacterial cytoplasm into the host cells. We have identified several previously uncharacterized interactions involving: 1) HrpG, a two-component system response regulator responsible for the expression of Xac hrp operons, and XAC0095, a previously uncharacterized protein encountered only in Xanthomonas spp; 2) HpaA, a protein secreted by the TTSS, HpaB and the C-terminal domain HrcV; 3) HrpB1, HrpD6 and HrpW; 4) HrpB2 and HrcU; 5) Homotropic interactions were also identified for the ATPase HrcN. Xac contains two virB gene clusters, one on the chromosome and one on the pXAC64 plasmid, each of which codes for a unique and previously uncharacterized TFSS. Components of the TFSS of pXAC64, which is most similar to conjugation systems, showed interactions involving proteins coded by the same locus: 1) Homotropic interactions of TrwA; 2) XACb0032 and XACb0033; 3) XAC0035 homotropic interactions; 4) VirB1 and VirB9; 5) XACb0042 and VirB6; 6) XACb0043 and XACb0021 b. Components of the chromosomal TFSS exhibited interactions involving: 1) VirD4 and a group of 12 uncharacterized proteins with a common C-terminal domain motif, include XAC2609 whose gene resides within the vir locus; 2) XAC2609 and XAC261 O; 3) Homotropic interactions of VirB11; 4) XAC2622 and VirB9. Analysis of Quorum Sensing/Rpf System components revealed interactions between the principal Rpf proteins which control Xanthomonas quorum sensing: 1) RpfC and RpfF; 2) RpfC and RpfG; 3) RpfF homotropic interactions; 4) RpfC and CmfA, a protein that presents similarity with Cmf (conditioned medium factor) of Dictyostelium discoideum, which contrais quorum sensing in this organism. The protein-protein interactions that we have detected reveal insights into the composition, organization and regulation of these important mechanisms involved in Xanthomonas pathogenicity.

La motilité cellulaire est fondamentale dans de nombreux processus physiologiques, qu’ils soient normaux ou pathologiques. Cependant, bien que ces derniers impliquent la plupart du temps de nombreuses cellules se mouvant en même temps, les effets des interactions entre cellules sur leur dynamique, à la fois individuelle et collective, restent assez mal connu. Dans cette thèse, j’ai utilisé Dictyostelium discoideum à l’état végétatif pour étudier cette régulation collective de la motilité. Je me suis principalement appuyé sur une analyse minutieuse de nombreuses trajectoires cellulaires dans des situations variées pour (i) caractériser un facteur sécrété qui régule négativement la motilité cellulaire (nature chimique, voie de signalisation, dynamique de sécrétion et de réponse) et (ii) analyser et modéliser quantitativement la dynamique d’étalement de colonie cellulaires de forme, dimension et densité contrôlées. Je décris enfin un phénomène d’agrégation dynamique observé lorsque les cellules sont placées à haute densité dans un milieu nutritif / Cell motility is fundamental in many physiological, either normal or pathological, phenomena. Yet, although these most often involve several cells moving at the same time, how the interactions between cells affect both individual and collective dynamics remains a poorly understood question. In this thesis, I used vegetative Dictyostelium discoideum cells as a model to study this collective regulation of the motility. I relied mainly on the thorough analysis of numerous cell trajectories in various situations to (i) characterise a secreted factor used to down-regulate the cells’ motility (biochemical nature, response pathway, secretion and response dynamics) and (ii) quantitatively analyse and model the dynamics of spreading cell colonies of controlled initial shape, size and density. Last, I describe a dynamic aggregation phenomenon that occurs when the cells are seeded at high density in a nutrient-rich medium

Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit portent sur l'étude de quatre éponges marines issues de la zone Sud-Ouest de l'Océan Indien : Plakortis kenyensis, Theonella swinhoei, Haliclona fascigera et Fascaplysinopsis reticulata. Les travaux entrepris comprenaient l'étude chimique de ces éponges incluant l'extraction, l'isolement et l'identification des métabolites secondaires par différentes techniques chromatographiques (CLMP, CLHP...) et spectroscopiques (UV-visible, HRMS, RMN 1D et 2D...). Douze métabolites secondaires ont été isolés de ces éponges dont six de structures nouvelles, à savoir : l'acide 2,5-époxydocosan-6-én-21-ynoïque (HF1), un acide gras atypique isolé de l'éponge Haliclona fascigera ; la 8-oxo-tryptamine (FR2), la 6,6’-bis-(débromo)- gelliusine F (FR3), la 6-bromo-2’-déméthyl-3’-N-méthyl-1’,8-dihydroaplysinopsine (FR6), la 5,6-dibromo-2’- déméthyl-3’-N-méthyl-1’,8-dihydroaplysinopsine (FR7) et la 5,6-dibromo-3’-déimino-2’-déméthyl-3’-oxo-1’,8- dihydroaplysinopsine (FR8), cinq alcaloïdes indoliques isolés de l'éponge Fascaplysinopsis reticulata. La valorisation des molécules isolées a ensuite été envisagée via l'évaluation de leurs activités biologiques. Parmi les douze molécules isolées, sept ont montré une activité antipaludique, trois une activité inhibitrice du quorum sensing de la bactérie bioluminescente Vibrio harveyi et cinq une activité anti-microfouling par inhibition de l'adhésion et/ou de la croissance de souches microbiennes marines. / The work described in this manuscript concerns four sponges from the South-West Indian Ocean: Plakortis kenyensis, Theonella swinhoei, Haliclona fascigera and Fascaplysinopsis reticulata. The chemical study of the sponges including extraction, isolation and identification of secondary metabolites was undertaken using various chromatographic (MPLC, HPLC ...) and spectroscopic (UV-visible, HRMS, 1D and 2D NMR ...) techniques. Twelve secondary metabolites including six new molecules were isolated from these sponges. The new molecules are: 2,5-époxydocosan-6-en-21-ynoic acid (HF1) an unusual fatty acid isolated from the sponge Haliclona fascigera; 8-oxo-tryptamine (FR2), 6,6'-bis (debromo)-gelliusine F (FR3), 6-bromo-2'-demethyl-3'-N- methyl-1',8-dihydroaplysinopsine (FR6), 5,6-dibromo-2'-demethyl-3'-N-methyl-1',8-dihydroaplysinopsine (FR7) and 5,6-dibromo-3’-deimino-2’-demethyl-3’-oxo-1’,8-dihydroaplysinopsine (FR8), five indole alkaloids isolated from the sponge Fascaplysinopsis reticulata. The biological activities of the isolated molecules were then evaluated. Among the twelve isolated molecules, seven were active against the malaria parasite Plasmodium falciparum, three were identified as inhibitors of the quorum sensing-regulated bioluminescence in Vibrio harveyi and five, showing marine bacterial adhesion and/or growth inhibition, exhibited potential anti- microfouling activity.

Genomas bacterianos são extremamente dinâmicos e boa parte dessa dinâmica ocorre devido a transferência horizontal e aquisição de DNA exógeno, um processo natural e fundamental para a evolução, adaptação e diversificação dos microrganismos. Ilhas genômicas são grandes regiões do cromossomo bacteriano adquiridas por transferência horizontal e estão presentes em apenas algumas linhagens, podendo conferir alguma vantagem adaptativa. Em Pseudomonas aeruginosa, até o momento foram caracterizadas pelo menos dezesseis ilhas genômicas e cada uma delas confere características diferentes a seus hospedeiros. Em P. aeruginosa UCBPP-PA14 (ou simplesmente PA14), encontram-se duas ilhas de patogenicidade denominadas PAPI-1 e PAPI-2, sendo a primeira a maior e a mais estudada, contendo 115 ORFs (“Open Reading Frame”, ou quadros abertos de leitura). Dentre estes, o gene int codifica uma integrase essencial para a excisão e integração de PAPI-1, e o gene soj é necessário para a manutenção da ilha na célula e é expresso apenas quando esta se encontra na forma epissomal. PAPI-1 codifica um provável sistema de secreção tipo IV (T4SS), similar ao do elemento móvel ICEHin1056, responsável pela transferência deste para outras bactérias. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores genéticos e ambientais que contribuem para a transferência de PAPI-1 entre linhagens de P. aeruginosa. Foi observado que os mutantes por transposon nos genes PAPI-1 PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 e PA14_59940 têm a frequência de transferência de PAPI-1 diminuída, mas os genes interrompidos nesses mutantes não são essenciais para a excisão da ilha. Também foi mostrado que os reguladores percepção de quorum RhlR e MvfR têm influência na expressão do gene int, mas não de soj. O terceiro regulador de percepção de quorum, LasR, assim como a proteína H-NS MvaT, não tem influência na expressão de int e de soj. Ensaios de RT-PCR quantitativos mostraram que o choque térmico aumentou os níveis do mRNA de soj, mas não de int, corroborando dados previamente sugeridos pela literatura, que mostram uma maior freqüência de transferência de PAPI-1 nessas condições. Também foi analisado se o segundo mensageiro celular em bactérias, c-di-GMP, poderia contribuir para a excisão/manutenção de PAPI-1. Alterações nas concentrações deste segundo mensageiro pela superexpressão de proteínas responsáveis por sua síntese ou degradação não foram capazes de afetar a excisão/manutenção de PAPI-1. Houve diminuição na frequência de transferência de PAPI-1 a partir de linhagens doadoras superexpressando uma diguanilato ciclase ou uma fosfodiesterase de c-di-GMP, mas provavelmente este efeito não se deve aos níveis alterados desse segundo mensageiro. Em Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), uma região de 86 kb possui uma grande semelhança com PAPI-1 na organização dos genes. Além disso, possui uma série de ORFs relacionados aos genes “core” que definem uma família de ilhas genômicas sintênicas das quais PAPI-1 faz parte. Entretanto, os genes acessórios encontrados entre os blocos de genes conservados varia muito entre PAPI-1 e a região de XAC. Foi determinado que esta região de XAC não pode se excisar do cromossomo nas condições analisadas. Por fim, com o intuito de verificar as possíveis interações entre os produtos dos genes conservados em PAPI-1 e XAC, ensaios de duplo-híbrido foram realizados, porém não foi possível determiná-las, visto que apenas resultados falsos positivos foram obtidos. Este trabalho mostrou pela primeira vez que a percepção de quorum está envolvida com a expressão de soj e determinou uma extensa similaridade entre essa ilha e uma região do genoma de XAC / Bacterial genomes are extremely dynamic mostly because of horizontal gene transfer, a natural and fundamental process for evolution, adaptation and diversification of microorganisms. Genomic islands are large DNA segments acquired by horizontal gene transfer which are present only in a few strains and may confer some adaptative advantage. At least sixteen genomic islands have been characterized in Pseudomonas aeruginosa to date and each confers different characteristics to its host strain. P. aeruginosa UCBPP-PA14 (PA14) harbors two pathogenicity islands named PAPI-1 and PAPI-2. PAPI-1 is the largest one, carrying 115 open reading frames (ORFs). Among these, int codes for an integrase essential for PAPI-1 excision and integration, and soj is required for maintaining PAPI-1 in the cells, being expressed only when this island is in an episomal, circular form. PAPI-1 also harbors genes coding for a type four secretion system (T4SS) similar to the mobile element ICEHin1056, which is responsible for transferring this element to other bacteria. In this work, we show that transposon insertion in PAPI-1 genes PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 and PA14_59940 lowered the frequency of conjugation of PAPI-1 from PA14 to other bacteria, but those genes were not essential for PAPI-1 excision. Quorum sensing regulators RhlR and MvfR had a role in int expression, but did not alter soj transcription. The third quorum sensing regulator LasR, as well as the H-NS protein MvaT, did not alter both int and soj expression. Quantitative RT-PCR assays showed that cells incubated at heat shock conditions present higher levels of soj, mRNA, confirming published data that showed an increase in PAPI-1 transfer in these conditions. It was also analyzed whether the second messenger c-di-GMP would contribute to PAPI-1 excision/maintenance. Changes in the levels of this second messenger in cells overexpressing proteins responsible for its synthesis or degradation did not affect PAPI-1 excision and maintenance. A decrease in PAPI-1 transfer frequency was detected when those cells were used as donors in conjugation, but this effect cannot be attributed to the altered c-di-GMP levels. In Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), an 86 kb genome region shares similarity with PAPI-1 regarding gene homology and organization. It also carries ORFs related to the core genes that define a syntenic family of genomic islands that includes PAPI-1. Nevertheless, the accessory genes dispersed among the clusters of conserved genes are not related, when comparing PAPI-1 and this region in XAC. An epissomal form of this putative XAC island could not be detected in the conditions tested in this work. Finally, in order to verify interactions involving the conserved proteins in PAPI-1 and XAC, two hybrid assays were carried out, but only false positives results were obtained

O trabalho aqui desenvolvido teve como objeto o estudo estrutural e funcional de várias proteínas do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), dentre as quais se destacam as proteínas hipotéticas conservadas YaeQ e SufE, as proteínas RpfC, RpfF e RpfG envolvidas em quorum sensing e proteínas PilZ, FimX e PilB envolvidas na biogênese do pilus tipo IV. Para o desenvolvimento deste trabalho foram utilizadas diferentes técnicas incluindo: clonagem, expressão, purificação, desnaturação térmica, cristalografia, difração de raios-X, RMN, ensaios de 2-híbrido, produção de nocautes, mutação sítio dirigida, Western- e Far- Western, entre outras. Dentre os resultados mais importantes obtidos temos a determinação estrutural das proteínas YaeQ e PilZ pela técnica MAD. Em ambos os casos, as estruturas representaram topologias inéditas. Com base nos dados estruturais, mostramos que YaeQ pertence à família PD-(D/E)XK presente em endonucleases dependentes de magnésio, e a partir de ensaios funcionais obtivemos evidências que sugerem que YaeQ está envolvida em alguma via de reparo de DNA em Xac. A estrutura tridimensional de PilZ revelou uma inesperada variedade estrutural dentro da família PilZ e mostrou de forma clara porque ortólogos não interagem com o segundo mensageiro bacteriano, c-diGMP. A cadeia principal de PilZ foi assinalada por RMN e a estrutura secundária de PilZ em solução é consistente com aquela determinada por cristalografia. Duas proteínas que interagem com PilZ foram identificadas: PilB e FimX. Como PilZ, ambos exercem papéis na biogênese do pilus tipo IV (T4P). Mostramos que PilZ interage especificamente com o domínio EAL de FimX e que resíduos conservados na região do C-terminal de PilZ estão envolvidos na interação com PilB, mas não com FimX. Ensaios de mutação sítio dirigida mostraram que a Y22 de PilZ pode estar envolvida na regulação da interação de PilZ com FimX e com PilB. Apesar de PilZ não interagir com c-diGMP seu parceiro, FimX, interage. PilZ consegue interagir com PilB ao mesmo tempo em que interage com FimX, formando um complexo ternário que é independente da interação de FimX com c-diGMP. Com base em todos estes resultados propusemos possíveis mecanismos de ação de PilZ e FimX no controle da biogênese do T4P. Além dos resultados acima descritos, determinamos a estrutura de SufE e mostramos que esta aumenta a atividade cisteína dessulfarase de seu parceiro, SufS, em torno de 10 vezes, como ocorre com SufE-SufS de E.coli. Clonamos, expressamos, purificamos e fizemos ensaios de cristalização de algumas proteínas envolvidas no controle de quorum sensing em Xac. Tivemos êxito na cristalização do domínio HPT (histidina fosfotransferase) da proteína chave deste sistema, RpfC / The aim of the project was to perform structural and functional studies of different Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) proteins including the hypothetical proteins YaeQ and SufE; RpfC, RpfF and RpfG involved in the quorum sensing and PilZ, FimX and PilB that play roles in type IV pilus (T4P) biogenesis. Several experimental techniques were employed including cloning, expression and purification of recombinant proteins, thermal denaturation, protein crystallography, X-ray diffraction, NMR, two-hybrid assays, Western- and Far-Western Blotting assays, site direct mutagenesis, and the production of Xac knockouts strains. The most important results include the determination of the three-dimensional crystal structures of PilZ and YaeQ using the MAD technique. In both cases, the structures reveled new protein topologies. The comparison of the YaeQ structure with others deposited in public databases revealed that YaeQ proteins represent a new variation within the PD-(D/E)XK magnesium dependent endonucleases superfamily. Functional assays suggest that YaeQ may be envolved in DNA repair in Xac. The PilZ three-dimensional structure revealed an unexpected structural variation within the PilZ domain superfamily and showed why PilZ orthologs are not able to bind the important bacterial second messenger, c-diGMP. We assigned the PilZ main chain by NMR and used this information to demonstrate that the PilZ secondary structure in solution is consistent with the PilZ crystal structure. We identified two proteins that interact with PilZ: PilB and FimX. As with PilZ, both PilB and FimX are involved in T4P biogenesis. PilZ binds specifically to the EAL domain of FimX and the conserved residues located in the PilZ unstructured C-terminal region contribute to binding with PilB but not with FimX. Site direct mutagenesis studies showed that PilZ residue Y22 is necessary for its capability to interact with both PilB and FimX. Although PilZ does not bind c-diGMP, her partner, FimX, does. We present evidence that PilZ can bind simultaneously to FimX and PilB, forming a ternary complex that is independent of c-diGMP. These results allow us to propose possible mechanisms by which PilZ and FimX control T4P biogenesis. Other results obtained during this period include the resolution of the crystal structure of the SufE protein from Xac using the molecular replacement technique. We show that SufE induces a 10-fold increase in the cysteine desulfurase activity of SufS, similar to that observed for the SufE-SufS complex from E. coli. Several proteins involved in quorum sensing and c-di-GMP signaling were cloned, expressed and submitted to crystallization trials. Crystals of the HPT (histidine phophotransferase) domain) of the RpfC sensor histidine kinase were obtained