Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle. Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires. / Cardiac remodelling is the process by which cardiac structure and/or function change in response to pathophysiological imbalances such as hypertension, cardiac disease, prolonged arrhythmia or altered hormonal balance. The renin-angiotensin system (RAS) is an extensively studied hormonal system involved in numerous processes associated with cardiovascular remodelling. Classically viewed as a circulating and a local tissue system, emerging evidence suggests an independent and functionally active RAS within individual cells. Understanding intracellular RAS actions might lead to new therapeutic avenues that could prevent adverse cardiac remodelling. The purpose of this thesis was to elucidate the role of intracellular RAS in cardiac cells. Recently, G protein-coupled receptors (GPCRs), G proteins, and their downstream effectors have been detected on intracellular membranes, including the nuclear membrane, and the concept of functional intracellular GPCRs is slowly being accepted as a reality. We therefore hypothesized that nuclear-delimited angiotensin II (Ang-II) signalling is involved in controlling cardiac gene expression. We demonstrated the presence of nuclear angiotensin-type 1 (AT1R) and angiotensin-type 2 (AT2R) receptors in adult ventricular cardiomyocytes and in a purified nuclear preparation from cardiac tissue. Ang-II was detected in cardiomyocyte lysate and microinjected Ang-II-FITC preferentially bound to nuclear sites. Transcriptional analysis demonstrated that Ang-II enhanced de novo RNA synthesis in isolated nuclei and NF-κB mRNA expression was much greater when nuclei were exposed to Ang-II. Nuclear AT1R-stimulation produced Ca2+ mobilization via nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R) Ca2+-channels, and IP3R-blockade attenuated the AT1R-mediated transcriptional responses in isolated nuclei. Current methods available to study intracrine RAS signalling are limited to indirect methodologies because of a lack of selective intracellularly-acting probes. An aim of this thesis was to synthesize and characterize cell-permeant Ang-II analogues to probe intracellular RAS action with spatial and temporal precision. Using solid-phase peptide technology we synthesized and pharmacologically characterized light-sensitive caged Ang-II analogues. This was achieved by incorporating a photocleavable 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) moiety on sites of Ang-II responsible for receptor recognition and activation. All of the three synthesized and purified caged-Ang-II analogues: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB and [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB, showed two-to-three orders of magnitude reduced binding affinity towards the AT1R and AT2R in competition binding assays and reduced potency in contraction assays using thoracic aorta. Photolysis of [Tyr(DMNB)4]Ang-II in HEK cells increased ERK1/2 phosphorylation (via AT1R) and cGMP production (via AT2R) whereas in isolated cardiomyocytes it induced an increase in nucleoplasmic Ca2+ and increased the abundance of 18S rRNA and NF-κB mRNA. Fibroblasts are the main drivers of cardiac structural remodelling. Atrial fibroblasts are more responsive to pro-fibrotic stimuli than ventricular fibroblasts. We hypothesized that intracellular Ang-II and associated nuclear AT1R and AT2R activation control fibroblast gene-expression patterns via discrete signalling systems and thereby play a key role in cardiac fibrosis. Atrial fibroblasts were found to express Ang-II, and nuclear AT1R and AT2R. The nuclear localisation of AT1R was increased in fibroblasts isolated from failing hearts whereas nuclear AT2R showed alterations in glycosylation. Heterotrimeric G protein subunits including Gαq/11, Gαi/3, and Gβ were observed in isolated fibroblast nuclei. AT1R and AT2R increased fibroblast transcription initiation via IP3R and NO signal transduction pathways, respectively. Photolysis of [Tyr(DMNB)4]Ang-II in cultured atrial fibroblasts induced an increase in nucleoplasmic Ca2+, proliferation, collagen synthesis and secretion that was not prevented by extracellular AT1R and/or AT2R blockers.

L'adaptation à l'environnement est essentielle à la survie cellulaire et des organismes en général. La capacité d'adaptation aux variations en oxygène repose sur des mécanismes de détection de l'hypoxie et une capacité à répondre en amorçant un programme d'angiogenèse. Bien que la contribution du facteur induit par l'hypoxie (HIF) est bien définie dans l'induction d'une telle réponse, d'autres mécanismes sont susceptibles d'être impliqués. Dans cette optique, les études démontrant l'influence du métabolisme énergétique sur le développement vasculaire sont de plus en plus nombreuses. L'un de ces composés, le succinate, a récemment été démontré comme étant le ligand du GPR91, un récepteur couplé aux protéines G. Parmi les différents rôles attribués à ce récepteur, notre laboratoire s'intéressa aux rôles du GPR91 dans la revascularisation observée suite à des situations d'hypoxie dont ceux affectant la rétine. Il existe cependant d'autres conditions pour lesquelles une revascularisation serait bénéfique notamment suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral. Nos travaux ont pour objectifs de mieux comprendre le rôle et le fonctionnement de ce récepteur durant le développement et dans le cadre de pathologies affectant la formation de vaisseaux sanguins. Dans un premier temps, nous avons déterminé le rôle du GPR91 dans la guérison suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral chez le nouveau-né. Nous montrons que ce récepteur est exprimé dans le cerveau et en utilisant des souris n'exprimant pas le GPR91, nous démontrons que dans un modèle d'hypoxie-ischémie cérébrale néonatal l'angiogenèse prenant place au cours de la phase de guérison dépend largement du récepteur. L'injection intracérébrale de succinate induit également l'expression de nombreux facteurs proangiogéniques et les résultats suggèrent que le GPR91 contrôle la production de ces facteurs. De plus, l'injection de ce métabolite avant le modèle d'hypoxie-ischémie réduit substantiellement la taille de l'infarctus. In vitro, des essaies de transcription génique démontrent qu'à la fois les neurones et les astrocytes répondent au succinate en induisant l'expression de facteurs bénéfiques à la revascularisation. En considérant le rôle physiologique important du GPR91, une seconde étude a été entreprise afin de comprendre les déterminants moléculaires régissant son activité. Bien que la localisation subcellulaire des RCPG ait traditionnellement été considérée comme étant la membrane plasmique, un nombre de publications indique la présence de ces récepteurs à l'intérieur de la cellule. En effet, tel qu'observé par microscopie confocale, le récepteur colocalise avec plusieurs marqueurs du réticulum endoplasmique, que celui-ci soit exprimé de façon endogène ou transfecté transitoirement. De plus, l’activation des gènes par stimulation avec le succinate est fortement affectée en présence d'inhibiteur du transport d'acides organiques. Nous montrons que le profil de facteurs angiogéniques est influencé selon la localisation ce qui affecte directement l'organisation du réseau tubulaire ex vivo. Finalement, nous avons identifié une région conservée du GPR91 qui agit de signal de rétention. De plus, nous avons découvert l'effet de l'hypoxie sur la localisation. Ces travaux confirment le rôle de régulateur maître de l'angiogenèse du GPR91 lors d'accumulation de succinate en condition hypoxique et démontrent pour la première fois l'existence, et l'importance, d'un récepteur intracellulaire activé par un intermédiaire du métabolisme. Ces données pavent donc la voie à une nouvelle avenue de traitement ciblant GPR91 dans des pathologies hypoxiques ischémiques cérébrales et soulèvent l'importance de tenir compte de la localisation subcellulaire de la cible dans le processus de découverte du médicament. / The ability to adapt to the changing environment is essential for the survival of cells and organisms in general. The capacity to adjust to variations in oxygen content not only relies on the ability to sense hypoxia but also depends the time required to induce an angiogenic process. Notwithstanding the important contribution of the hypoxia inducible factor (HIF) in this response, other mechanisms are likely to be involved. Studies that have demonstrated the influence of metabolic compounds on vascular development are increasingly abundant. One of those compounds, succinate, has recently been indentified as the ligand of GPR91, a G-protein-coupled receptor. Amongst the roles of this receptor, our group has been interested in determining its contribution in revascularisation observed following hypoxic events in the retina. Other pathological conditions could benefit from the contribution of GPR91 including cerebral hypoxia-ischemia. Our objective is to better understand the role of this receptor during development and in pathological conditions affecting blood vessel formation. We first, determined the role of GPR91 in revascularisation following cerebral hypoxia-ischemia in the newborn. We show the expression of the receptor in the cerebral cortex. Using mice devoid of GPR91, we demonstrate that angiogenesis normally taking place during the recovery phase is largely dependent upon GPR91. Intracerebral injection of succinate induces the expression of several proangiogenic growth factors by activating GPR91. Furthermore, injection of succinate before cerebral H-I model substantially reduces the infarct size. In vitro, gene transcription shows that neurons and astrocytes respond to succinate and produce factors beneficial to revascularisation. Considering the important physiological role of GPR91, a second study was initiated to better determine the molecular determinants controlling the receptor's activity. The plasma membrane has classically been considered the typical GPCR's location of action but several new publications indicate the presence of such receptors within the cell. We observe, by confocal microscopy, the colocalisation of GPR91 (endogenous or transfected) with several marker of the endoplasmic reticulum. In addition, the gene induction observed when stimulated with succinate is severely affected in presence of the compound probenicid, an organic anion transporter inhibitor. We also demonstrate that the profile of genes expressed is largely dependent on the localisation of the receptor and consequently affects the organization of the tubular network ex vivo. Finally, we have identified a conserved region of GPR91 that acts as a retention signal. Lastly, we have uncovered the consequence of hypoxia affecting the post-translational modification of GPR91 and its change in location from the ER to the plasma membrane. This work confirms the role of GPR91 as a master regulator of angiogenesis in situations where succinate accumulates and demonstrated for the first time the existence, and importance, of an intracellular receptor activated by a metabolic intermediate. These results pave the way for future treatment targeting GPR91 in cerebral hypoxic ischemic pathologies and demonstrate the importance of taking into account the subcellular localisation in the drug discovery process.