Rôle du Système de calpaïne/calpastatine dans l'hypertension pulmonaire induite par l'hypoxie chez la souris. Les souris calpaïnes knockout ont montré des effets protecteurs dans l'hypertension pulmonaire (HP) induite par l'hypoxie. Cependant, le modèle animal avec une surexpression de calpastatine (cast) n'a jamais été étudié. Notre objectif est d'utiliser des souris transgéniques CMV-cast qui surexpriment constitutivement la calpastatine intracellulaire sous le contrôle du promoteur CMV dans tous les types cellulaires pour étudier les effects de la calpaïne intracellulaire. Nous utilisons aussi des souris transgéniques CRP-cast qui surexpriment la calpastatine extracellulaire sous le contrôle du promoteur CRP (protéine C-réactive) pour étudier les effets de la calpaïne extracellulaire. Finalement, nous examinons les effets d'un traitement avec le PD150606, inhibiteur de calpaïne, chez des souris C57BL/6j (WT) hypoxiques et SM22-5HTT+ qui dévélopent l'HP spontanément. Nous avons constaté que les protéines calpaïne et calpastatine sont augmentées immédiatement dans un état hypoxique. Les calpaïnes ont ensuite culminé le jour 8 et sont restées élevées jusqu'au jour 18 chez les souris WT hypoxiques, alors que la calpastatine a augmenté du jour 1 au jour 3, retournant au niveau basal jusqu'au jour 18. Les activités des calpaïnes intra- et extra-cellulaires ont augmenté progressivement pour atteindre un sommet au jour 8, restant aux niveaux élevés jusqu'au jour 18 chez les souris WT hypoxiques. En utilisant l'immunofluorescence, nous avons constaté que l'augmentation des calpaïnes sont principalement colocalisés avec les CML vasculaires pulmonaires (α-SMA+). Cependant, chez la souris CMV-cast, la surexpression de la calpastatine a atténué le développement d'HP. Chez les souris CMV-cast hypoxiques les niveaux de calpastatine sont restés plus élevés que ceux des souris WT à tous les moments de l'hypoxie. Les niveaux de calpastatine plus élevés chez les souris CMV-cast ont empêché de manière significative une augmentation des niveaux de protéines calpaïnes et des activités intra- et extra-cellulaires de la calpaïne au cours de l'hypoxie. Les résultats d'immunofluorescence également ont confirmé que moins de calpaïnes colocalisent avec les CML vasculaires pulmonaires (α-SMA+) chez la souris CMV-cast. Après 18 jours hypoxie, CRP-cast mice ont attenué le développement d'HP. En outre, cette surexpression a montré des effets similaires par rapport à celle intracellulaire. Cependant, le PD150606 a eu que des effets supplémentaires chez les souris WT hypoxiques par rapport aux souris CMV-cast et CRP-cast hypoxiques. Chez les souris SM22-5HTT+, les niveaux de calpastatine, de calpaïnes ainsi que des activités intra- et extra-cellulaires de la calpaïne ont été significativement augmentés dans les poumons. Le PD150606 n'a pas modifié les niveaux de calpastatine, mais il a diminué de manière significative des calpaïnes ainsi que des activités intra- et extra-cellulaire de calpaïne. Les niveaux de calpastatine et des calpaïnes ont également paru augmentées dans les vessaux pulmonaires remodelés chez les patients atteints de maladie pulmonaire chronique par rapport à ceux nonremodelés. En résumé, nos résultats indiquent un nouveau rôle des calpaïnes extracellulaires dans la prolifération des CML-AP dans l'HP. Les stratégies d'inhibition des calpaïnes extracellulaires sembleraient être une stratégie thérapeutique dans le traitement de la progression de l'HP. / Targeting the Calpain/Calpastatin System to Protect against Hypoxia-induced Pulmonary Hypertension in Mice. Calpain knockout mice exhibited protective effects against hypoxia-induced PH. Our aim was to study the role of the calpain/calpastatin system on PH development in mice. To this end, we used mice ubiquitously overexpressing intracellular calpastatin (cast) under the control of a CMV promoter (CMV-cast) to explore the effects of intracellular calpains. We also used mice overexpressing extracellular calpastatin under the control of a CRP (C-reactive protein) promoter (CRP-cast) to explore the effect of extracellular calpains. Finally, we examined the effects of treatment with PD150606, an inhibitor of calpain, in WT mice exposed to hypoxia and in SM22-5HTT+ mice with spontaneous PH. During time-course of hypoxia, we found that calpain and calpastatin protein levels increased immediately after hypoxic exposure. Calpain protein levels then peaked on day 8 and remained elevated until day 18 in hypoxic WT mice; however, calpastatin protein levels increased from day 1 to day 3, and returned to basal level until day 18. Both intra- and extra-cellular calpain activities were upregulated gradually and peaked on days 8, and still markedly remained in high levels until day 18 in hypoxic WT mice. By using immunofluorescence, we found that increased calpains were predominantly colocalized with α-SMA positive pulmonary vascular SMCs. In CMV-cast mice, intracellular calpastatin overexpression successfully attenuated PH development. In CMV-cast mice, calpastatin protein levels remained higher than those in WT mice at all time points of hypoxia. The higher calpastatin protein levels in CMV-cast mice did significantly prevent an increase in calpain protein levels and calpain intra- and extra-cellular activities during hypoxia. After 18 days hypoxia, CRP-cast mice exhibited less PH severity. Moreover, extracellular calpastatin overexpression showed similar effects as intracellular calpastatin overexpression. Treatment with PD150606 induced an additional protective effect in hypoxic WT mice but not CMV-cast and CRP-cast mice. In SM22-5HTT+ mice, lung calpastatin and calpain proteins as well as calpain intra- and extra-cellular activities were significantly increased. PD150606 did not alter lung tissue calpastatin. However, it significantly decreased calpain protein levels as well as calpain intra- and extra-cellular activities. In summary, our present results demonstrate that calpain inhibition prevents PH development. Either increasing extracellular calpastatin or increasing both extra- and intra-cellular calpastatin is efficient to attenuate PH. Treatment with PD150606 which inhibits both extra- and intra-cellular calpain activities may be useful in teh setting of PH.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le vieillissement cardiaque est fortement associé à l’apparition d’une fibrose pouvant entrainer une dysfonction progressive du remplissage et de l’éjection ventriculaire. Le dépistage du remodelage et du vieillissement cardiovasculaire sont primordiaux afin de proposer des stratégies de prévention et de prises en charge spécifiques visant à retarder l’apparition ou ralentir la progression d’une insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Les outils cliniques, biologiques ou d’imagerie sont insuffisamment performants à l’heure actuelle pour dépister ces modifications précoces ou prédire l’apparition de remodelage ultérieur de façon efficace. La réalisation d’une méta-analyse avec revue de la littérature, nous a permis de montrer la valeur de la déformation myocardique comme marqueur du remodelage cardiovasculaire dans le post-infarctus, mais nous a aussi éclairé sur la complexité du phénomène et le manque de preuves sur sa potentielle valeur additionnelle en pratique clinique. Après avoir validé les différents outils de quantification du remodelage dans nos cohortes, nous avons montré l’importance d’une expertise précise de la morphologie et de la fonction cardiaque lors d’un évènement aigu pour prédire un remodelage ultérieur. Nous avons précisé le rôle de la déformation myocardique dans la quantification de la taille de l’infarctus, sa sévérité et son éventuelle extension au ventricule droit. Enfin, nous avons mis en relation les paramètres de contractilité et de fonction vasculaire en montrant la valeur du couplage ventriculo artériel mesuré en IRM. Ces travaux ouvrent la voie pour une stratégie d’évaluation d’imagerie précoce en post-infarctus pouvant orienter les thérapeutiques de revascularisation et/ou de réhabilitation / Cardiovascular aging is strongly associated with myocardial fibrosis and progressive LV systolic/diastolic dysfunction including vascular stiffening. Cardiac remodeling with left ventricular parietal stress and hypertrophy take place over several years and can ultimately lead to the occurrence of heart failure. Clinical, biological or imaging tools are currently insufficient to detect early changes or to predict the onset of subsequent remodeling in an effective manner. However, if subclinical structural and functional cardiac abnormalities are not detected by conventional echocardiographic techniques, they may be evaluated by others imaging tools with the measurement of myocardial deformation parameters. We performed a systematic review suggesting that deformation imaging is associated with left ventricular volume and function changes regardless the mechanisms and deformation direction. But added strain predictive value over other clinical, biological and imaging variables remains to prove. After validation of various remodeling indices, we proved the add value of a comprehensive assessment of ventricule geometry and function to evaluate remodeling after an acute event. We confirmed the central role of myocardial deformation for infarct size quantification and detect right ventricle extension. Finally, we used vascular function measured by MRI to demonstrate the relation between ventriculo-arterial coupling and remodeling. Further studies are needed to assess the gain in information provided by strain and these new biomarkers.

L'implication du système rénine-angiotensine aldostérone (SRAA) dans le déterminisme génétique de l'hypertension artérielle (HTA) et de son retentissement cardiovasculaire, chez des hypertendus hospitalisés, a été explorée selon deux approches : i) l'étude d'une forme monogénique d'HTA, l'hyperaldostéronisme sensible à la dexaméthasone (HSD), ii) des études d'association concernant les gènes AGTR1 et CYP11B2, codant pour le récepteur de type 1 à l'angiotensine II, et pour l'aldostérone synthase. Ce travail a permis d'identifier trois patients, apparentés, porteurs du gène de l'HSD, et a confirmé l'intérêt d'un diagnostic précoce de cette maladie. Nos résultats ont par ailleurs montré que l'allèle A du polymorphisme A1166C du gène AGTR1 est associé à une augmentation de la rigidité artérielle, et que le polymorphisme –344 C/T du gène CYP11B2 influence le déterminisme de l'index de masse ventriculaire gauche, soulignant le rôle majeur des gènes du SRAA dans le remodelage cardiovasculaire.

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil est un problème de santé publique affectant plus de 5 % de la population, se caractérisant par des obstructions répétées des voies aériennes durant la nuit. L’hypoxie intermittente (HI) qui en résulte, induit des complications cardiovasculaires (hypertension, athérosclérose, insuffisance cardiaque). Le but de cette thèse est d’explorer le remodelage cardiovasculaire induit par l’HI et de comprendre le rôle de HIF-1 et de l’endothéline (ET-1) dans ces modifications. Pour cela nous avons exposé à 14 jours d’HI des souris HIF1α+/- ou traitées avec un antagoniste des récepteurs à l’ET-1. Chez les souris contrôles, nous avons observé un épaississement de la paroi aortique, une inflammation systémique et locale dans l’aorte ainsi qu’une hypertrophie du ventricule droit qui sont absents chez les souris HIF1α+/- ou traitées au bosentan. La délétion de HIF1a prévient également l’augmentation de contractilité observée dans le ventricule gauche après HI. En conclusion HIF-1 et ET-1 semblent fortement impliqués dans le remodelage vasculaire et myocardique induit par l’HI. / Obstructive sleep apnea is a public health problem affecting more than 5% of the population, characterized by repeated airway obstructions during sleep. The resulting intermittent hypoxia (IH) induces cardiovascular complications (hypertension, atherosclerosis, heart failure). The aim of this thesis is to characterize the cardiovascular remodeling induced IH and understand the role of HIF-1 and endothelin (ET-1) in these alterations. For this, we exposed to IH for 14 days HIF1α+/- mice or mice treated with an ET-1 receptor antagonist. Control mice developed thickening of the aortic wall, systemic and local inflammation in the aorta and right ventricular hypertrophy that were absent in HIF1α+/- or bosentan-treated mice. HIF1a deletion also prevents the increase in left ventricular contractility observed after HI. In conclusion, HIF-1 and ET-1 appear to be strongly involved in the vascular and myocardial remodeling induced by HI.

Objectif : L'hypertension est associée à une hyperplasie cardiovasculaire, un taux de renouvellement cellulaire accéléré et une diminution de la longueur des télomères. Nous avons postulé que le renversement de l’hyperplasie par apoptose sélective observé avec les inhibiteurs du système rénine-angiotensine (iSRA) chez le rat spontanément hypertendu (SHR) est associé à une modulation de la longueur des télomères cardiovasculaires. Méthodes : La mesure relative du poids du ventricule gauche (VG) et son contenu en ADN ont été mesurés. Dans l’aorte, l’hypertrophie a été mesurée histologiquement et l’hyperplasie par décompte des cellules de muscle lisse (CML). La longueur des télomères (TRF) a été mesurée par immunobuvardage de type Southern. Ces mesures ont été effectuées chez des rats SHR traités avec un placebo, un iSRA (énalapril ou losartan) ou l'hydralazine pendant 21 jours, ainsi que chez les rats normotendus Wistar-Kyoto (WKY). Résultats : Les iSRA ont partiellement normalisé le contenu en ADN dans le VG et complètement normalisé le décompte cellulaire des CML dans l’aorte. Comparativement aux rats WKY, les SHR placebo ont montré un plus haut pourcentage de TRF courts dans le ventricule gauche (50,2% vs 64,6%; p<0,05) ainsi qu’une longueur moyenne des TRF plus courte (62,6 Kb vs 57,1Kb; p<0,05). Ces différences ont été abolies par l'énalapril et le losartan mais pas par l'hydralazine. Dans l’aorte, les résultats préliminaires n’ont pas révélé de différence significative. Ils suggèrent que les rats SHR-placebo ont des télomères plus longs que les rats WKY et que les inhibiteurs du SRA tendent à normaliser cette différence. Conclusion : Les iSRA ont normalisé la longueur des télomères dans le VG. Nous spéculons que les iSRA agissent comme agents sénolytiques et éliminent préférentiellement les fibroblastes cardiaques avec télomères courts. Dans l’aorte, d’autres études sont requises afin de confirmer une possible régulation différentielle spécifique à ce tissu. / Objective: Hypertension is associated with cardiovascular hyperplasia, an increased cell turnover and a decrease in telomere length. We postulated that the reversal of hyperplasia by selective apoptosis observed with renin-angiotensin inhibitors (RASi) in the spontaneously hypertensive rat (SHR) is associated with a modulation of cardiovascular telomere length. Methods: Relative weight of the left ventricle (LV) and its DNA content were measured. In the aorta, hypertrophy was measured histologically and hyperplasia was measured through smooth muscle cell (SMC) count. Telomere restriction fragment (TRF) length was measured using Southern blot. Those measures were taken on SHR treated with either a placebo, a RAS inhibitor (enalapril or losartan) or hydralazine for 21 days, as well as on Wistar-Kyoto (WKY) normotensive rats. Results: RAS inhibitors partially normalized DNA content in the LV and completely normalized the SMC count in the aorta. Comparatively to the WKY rats, SHR-placebo displayed a higher percentage of short TRF in the LV (50,2% vs 64,6%; p<0,05) as well as a shorter mean TRF length (62,6 Kb vs 57,1Kb; p<0,05). Those differences were eliminated by enalapril and losartan, but not with hydralazine. In the aorta, preliminary results did not yield to significant differences. They suggest that SHR-placebo have longer telomeres than WKY rats and that RAS inhibitors tend to normalize this difference. Conclusion: RAS inhibitors normalized telomere length in the LV. We speculate that RAS inhibitors act as senolytic agents and preferentially eliminate cardiac fibroblasts with short telomeres. In the aorta, more studies are required to confirm the possible differential regulation specific to this tissue.

Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle. Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires. / Cardiac remodelling is the process by which cardiac structure and/or function change in response to pathophysiological imbalances such as hypertension, cardiac disease, prolonged arrhythmia or altered hormonal balance. The renin-angiotensin system (RAS) is an extensively studied hormonal system involved in numerous processes associated with cardiovascular remodelling. Classically viewed as a circulating and a local tissue system, emerging evidence suggests an independent and functionally active RAS within individual cells. Understanding intracellular RAS actions might lead to new therapeutic avenues that could prevent adverse cardiac remodelling. The purpose of this thesis was to elucidate the role of intracellular RAS in cardiac cells. Recently, G protein-coupled receptors (GPCRs), G proteins, and their downstream effectors have been detected on intracellular membranes, including the nuclear membrane, and the concept of functional intracellular GPCRs is slowly being accepted as a reality. We therefore hypothesized that nuclear-delimited angiotensin II (Ang-II) signalling is involved in controlling cardiac gene expression. We demonstrated the presence of nuclear angiotensin-type 1 (AT1R) and angiotensin-type 2 (AT2R) receptors in adult ventricular cardiomyocytes and in a purified nuclear preparation from cardiac tissue. Ang-II was detected in cardiomyocyte lysate and microinjected Ang-II-FITC preferentially bound to nuclear sites. Transcriptional analysis demonstrated that Ang-II enhanced de novo RNA synthesis in isolated nuclei and NF-κB mRNA expression was much greater when nuclei were exposed to Ang-II. Nuclear AT1R-stimulation produced Ca2+ mobilization via nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R) Ca2+-channels, and IP3R-blockade attenuated the AT1R-mediated transcriptional responses in isolated nuclei. Current methods available to study intracrine RAS signalling are limited to indirect methodologies because of a lack of selective intracellularly-acting probes. An aim of this thesis was to synthesize and characterize cell-permeant Ang-II analogues to probe intracellular RAS action with spatial and temporal precision. Using solid-phase peptide technology we synthesized and pharmacologically characterized light-sensitive caged Ang-II analogues. This was achieved by incorporating a photocleavable 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) moiety on sites of Ang-II responsible for receptor recognition and activation. All of the three synthesized and purified caged-Ang-II analogues: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB and [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB, showed two-to-three orders of magnitude reduced binding affinity towards the AT1R and AT2R in competition binding assays and reduced potency in contraction assays using thoracic aorta. Photolysis of [Tyr(DMNB)4]Ang-II in HEK cells increased ERK1/2 phosphorylation (via AT1R) and cGMP production (via AT2R) whereas in isolated cardiomyocytes it induced an increase in nucleoplasmic Ca2+ and increased the abundance of 18S rRNA and NF-κB mRNA. Fibroblasts are the main drivers of cardiac structural remodelling. Atrial fibroblasts are more responsive to pro-fibrotic stimuli than ventricular fibroblasts. We hypothesized that intracellular Ang-II and associated nuclear AT1R and AT2R activation control fibroblast gene-expression patterns via discrete signalling systems and thereby play a key role in cardiac fibrosis. Atrial fibroblasts were found to express Ang-II, and nuclear AT1R and AT2R. The nuclear localisation of AT1R was increased in fibroblasts isolated from failing hearts whereas nuclear AT2R showed alterations in glycosylation. Heterotrimeric G protein subunits including Gαq/11, Gαi/3, and Gβ were observed in isolated fibroblast nuclei. AT1R and AT2R increased fibroblast transcription initiation via IP3R and NO signal transduction pathways, respectively. Photolysis of [Tyr(DMNB)4]Ang-II in cultured atrial fibroblasts induced an increase in nucleoplasmic Ca2+, proliferation, collagen synthesis and secretion that was not prevented by extracellular AT1R and/or AT2R blockers.