<p>Inledning</p><p>Vid Unitech Biopharma, Matfors (Sverige) sker tillverkning av rekombinant Kolera Toxin</p><p>subenhet B (rCTB-213), vilket är en av de aktiva substanserna i vaccinet Dukoral®.</p><p>Unitech Biopharma AB är ett bioteknikföretag fokuserade på legotillverkning av</p><p>rekombinanta proteiner och tillverkar rCTB för SBL Vaccin AB Solna, (Sverige).</p><p>Anläggningen där tillverkningen av denna produkt sker har alla nödvändiga tillstånd</p><p>(Läkemedelsverket, Länsstyrelsen, Arbetsmiljöverket) och uppfyller gällande cGMP-krav</p><p>samt är godkänd av läkemedelsmyndigheterna i EU och Kanada, WHO samt i ytterligare ca</p><p>35 andra länder.</p><p>Dukoral® är ett drickbart vaccin som stimulerar immunförsvaret i tarmen och skapar ett bra</p><p>skydd mot sjukdomen kolera. Vaccinet ger även skydd mot enterotoxinbildande stammar av</p><p>Escherichia coli (ETEC) vars värmekänsliga toxin (LT) delvis liknar koleratoxinet både</p><p>strukturellt, funktionellt och immunologiskt[34]. Vaccinet består förutom rCTB av tre olika</p><p>stammar inaktiverade Vibrio Cholerae bakterier, vilka produceras vid SBL-vaccin AB, där</p><p>även slutformulering av vaccinet sker.</p><p>Tillverkningsprocessen av Monovalent bulk rCTB-213 sker genom mikrobiell fermentering</p><p>av en genetiskt modifierad produktionsstam av Vibrio Cholerae, där huvudodlingssteget sker i</p><p>500 liters skala där hela tillvekningsprocessen sker under Good Manifacturing Practise (GMP)</p><p>förhållanden för att garantera en säker, effektiv och kvalitetsmässigt bra produkt.</p><p>Målet med detta examensarbete är att upprätta en processbeskrivning för</p><p>tillverkningsprocessen av Monovalent bulk rCTB-213. Beskrivningen skall baseras på den</p><p>process som görs idag och innefatta respektive processtegs mål, teori och kritiska parametrar.</p><p>Den kunskap som skapas genom att definiera och kartlägga (dvs. dokumentera arbetsflödet) i</p><p>en process har ett stort värde i sig, den är dessutom en utomordentlig plattform för</p><p>förbättringsarbete genom att den skapar en gemensam bild av vad som sker i processen i dag.</p><p>I detta examensarbete sker även en sammanställning av produktionen av Monovalent bulk</p><p>rCTB-213 för perioden februari 2004 - juni 2005.</p><p>Fakta om hur processen tidigare har betett sig måste användas som bas för</p><p>förbättringsarbete[1].</p><p>För att se om eventuell förekomst av variation för enskilda variabler kan urskiljas, utvärderas</p><p>processdata för variabler som dokumenterats av företaget för batcher tillverkade under</p><p>perioden februrari 2004 tom. juni 2005.</p><p>Under fermentationssteget regleras parametrarna temperatur, pH och andelen löst syre i</p><p>huvudfermentorn för att upprätthålla optimal fysisk miljö för tillväxt och rCTB produktion.</p><p>För att få en uppfattning om hur dessa parameterar förhållit sig vid odlingar som utförts under</p><p>perioden februari 2004 – juni 2005 utvärderas dessa variabler via</p><p>duglighetsanalys/processkapabilitetsstudie (Cpk). I denna studie beräknas de korrigerade</p><p>duglighetsindexen för de ovan nämda parametrarna, där den naturliga spridningen för</p><p>processen sätts i förhållande till vilka gränser som är angivna i registreringsdokument</p><p>(Process Manifacturing Description) för att få en uppfattning om det som är angivet i</p><p>registrerings- dokument efterlevs.</p>

Inledning Vid Unitech Biopharma, Matfors (Sverige) sker tillverkning av rekombinant Kolera Toxin subenhet B (rCTB-213), vilket är en av de aktiva substanserna i vaccinet Dukoral®. Unitech Biopharma AB är ett bioteknikföretag fokuserade på legotillverkning av rekombinanta proteiner och tillverkar rCTB för SBL Vaccin AB Solna, (Sverige). Anläggningen där tillverkningen av denna produkt sker har alla nödvändiga tillstånd (Läkemedelsverket, Länsstyrelsen, Arbetsmiljöverket) och uppfyller gällande cGMP-krav samt är godkänd av läkemedelsmyndigheterna i EU och Kanada, WHO samt i ytterligare ca 35 andra länder. Dukoral® är ett drickbart vaccin som stimulerar immunförsvaret i tarmen och skapar ett bra skydd mot sjukdomen kolera. Vaccinet ger även skydd mot enterotoxinbildande stammar av Escherichia coli (ETEC) vars värmekänsliga toxin (LT) delvis liknar koleratoxinet både strukturellt, funktionellt och immunologiskt[34]. Vaccinet består förutom rCTB av tre olika stammar inaktiverade Vibrio Cholerae bakterier, vilka produceras vid SBL-vaccin AB, där även slutformulering av vaccinet sker. Tillverkningsprocessen av Monovalent bulk rCTB-213 sker genom mikrobiell fermentering av en genetiskt modifierad produktionsstam av Vibrio Cholerae, där huvudodlingssteget sker i 500 liters skala där hela tillvekningsprocessen sker under Good Manifacturing Practise (GMP) förhållanden för att garantera en säker, effektiv och kvalitetsmässigt bra produkt. Målet med detta examensarbete är att upprätta en processbeskrivning för tillverkningsprocessen av Monovalent bulk rCTB-213. Beskrivningen skall baseras på den process som görs idag och innefatta respektive processtegs mål, teori och kritiska parametrar. Den kunskap som skapas genom att definiera och kartlägga (dvs. dokumentera arbetsflödet) i en process har ett stort värde i sig, den är dessutom en utomordentlig plattform för förbättringsarbete genom att den skapar en gemensam bild av vad som sker i processen i dag. I detta examensarbete sker även en sammanställning av produktionen av Monovalent bulk rCTB-213 för perioden februari 2004 - juni 2005. Fakta om hur processen tidigare har betett sig måste användas som bas för förbättringsarbete[1]. För att se om eventuell förekomst av variation för enskilda variabler kan urskiljas, utvärderas processdata för variabler som dokumenterats av företaget för batcher tillverkade under perioden februrari 2004 tom. juni 2005. Under fermentationssteget regleras parametrarna temperatur, pH och andelen löst syre i huvudfermentorn för att upprätthålla optimal fysisk miljö för tillväxt och rCTB produktion. För att få en uppfattning om hur dessa parameterar förhållit sig vid odlingar som utförts under perioden februari 2004 – juni 2005 utvärderas dessa variabler via duglighetsanalys/processkapabilitetsstudie (Cpk). I denna studie beräknas de korrigerade duglighetsindexen för de ovan nämda parametrarna, där den naturliga spridningen för processen sätts i förhållande till vilka gränser som är angivna i registreringsdokument (Process Manifacturing Description) för att få en uppfattning om det som är angivet i registrerings- dokument efterlevs.

<p>Polyacryl starch microparticles have been developed as a new mucosal vaccine adjuvant intended for use in oral vaccination. The main objectives of this thesis were to evaluate the efficacy of these polyacryl starch microparticles and to study their uptake through mucosal tissues. Secreted or surface components of <i>Salmonella enterica</i> serovar Enteritidis were used in free form or were conjugated to or mixed with the microparticles in vaccination studies in mice in order to find components suitable for use in a future combination vaccine against enteric bacteria such as enterotoxigenic <i>Escherichia coli</i>.</p><p>The immune response elicited using secreted proteins from <i>S. enterica</i> serovar Enteritidis was shown to be mainly directed against flagella-related antigens and partly by LPS. Flagellin was purified and used in C3H/HeJ mice that do not respond to LPS. Strong immune responses were observed even when the flagellin was given orally alone. Recombinant <i>Salmonella</i> atypical fimbriae (SafB/D) complexes, a conserved structure within <i>Salmonella</i> species, were also studied and shown to be immunogenic after administration both subcutaneously and nasally, but not orally. Oral challenge using live bacteria, showed that mice orally immunised with the secreted antigens, resulted in a lower degree of infection than that seen in non-vaccinated mice. Similarly, mice that had been immunised with purified free flagellin had a lower degree of infection than untreated mice. However, with mice, immunised with SafB/D complexes plus rCTB, only the subcutaneous route resulted in a lower degree of infection than seen in untreated mice. The polyacryl starch microparticles were effective as an adjuvant with secreted proteins, but did not potentiate the immune response in the study using flagellin. </p><p>Confocal laser-scanning and transmission electron microscopy demonstrated that the microparticles were taken up by pig respiratory nasal mucosa mounted in horizontal Ussing chambers. Although anticytokeratin 18 stained mucus-producing cells, M cells were not seen in the studied area. </p><p>Changing the route of administration of the microparticles conjugated with serum albumin can cause differences in the IgG-subclass ratios. The mucosal immune response measured as specific s-IgA levels, was induced by oral but not parenteral immunisation.</p>

Polyacryl starch microparticles have been developed as a new mucosal vaccine adjuvant intended for use in oral vaccination. The main objectives of this thesis were to evaluate the efficacy of these polyacryl starch microparticles and to study their uptake through mucosal tissues. Secreted or surface components of Salmonella enterica serovar Enteritidis were used in free form or were conjugated to or mixed with the microparticles in vaccination studies in mice in order to find components suitable for use in a future combination vaccine against enteric bacteria such as enterotoxigenic Escherichia coli. The immune response elicited using secreted proteins from S. enterica serovar Enteritidis was shown to be mainly directed against flagella-related antigens and partly by LPS. Flagellin was purified and used in C3H/HeJ mice that do not respond to LPS. Strong immune responses were observed even when the flagellin was given orally alone. Recombinant Salmonella atypical fimbriae (SafB/D) complexes, a conserved structure within Salmonella species, were also studied and shown to be immunogenic after administration both subcutaneously and nasally, but not orally. Oral challenge using live bacteria, showed that mice orally immunised with the secreted antigens, resulted in a lower degree of infection than that seen in non-vaccinated mice. Similarly, mice that had been immunised with purified free flagellin had a lower degree of infection than untreated mice. However, with mice, immunised with SafB/D complexes plus rCTB, only the subcutaneous route resulted in a lower degree of infection than seen in untreated mice. The polyacryl starch microparticles were effective as an adjuvant with secreted proteins, but did not potentiate the immune response in the study using flagellin. Confocal laser-scanning and transmission electron microscopy demonstrated that the microparticles were taken up by pig respiratory nasal mucosa mounted in horizontal Ussing chambers. Although anticytokeratin 18 stained mucus-producing cells, M cells were not seen in the studied area. Changing the route of administration of the microparticles conjugated with serum albumin can cause differences in the IgG-subclass ratios. The mucosal immune response measured as specific s-IgA levels, was induced by oral but not parenteral immunisation.