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O raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar (RS) é uma das doenças mais importantes desta cultura, ocorrendo, se não em todas, na maioria das áreas de produção comercial do mundo. A falta de sintomas característicos tem dificultado uma avaliação rápida da intensidade do RS em campos comerciais e durante o melhoramento genético das variedades. Muitos métodos de diagnóstico são citados na literatura, porém não foram devidamente estudados quanto a sua eficiência e praticidade. Sendo assim, este trabalho se propôs a elucidar alguns pontos a fim de determinar um método que possua características desejáveis como praticidade na execução, economia de tempo, baixo custo e precisão. Concomitante a esta comparação de métodos, avaliou-se a resistência ao RS de algumas variedades comerciais de cana-de-açúcar para verificar a validade dos métodos na seleção de variedades resistentes. Três métodos foram avaliados: coloração do xilema através do fluxo transpiratório (CL) , observação da bactéria do RS em suco extraído do xilema (CT) e autofluorescência do metaxilema (FL). Verificou-se que os métodos (CL e CT) são equivalentes no diagnóstico do RS quando aplicados em plantas cujo processo de transporte de seiva bruta já sofreu interferência da bactéria. Nas condições testadas esta interferência ocorreu em torno de dez meses após a brotação. O método CT mostrou maior sensibilidade por detectar o patógeno em colmos na fase inicial do processo patológico. A simplicidade de execução e o baixo custo do método CL permitem a sua utilização para avaliação de campos comerciais, viveiros de mudas e seleção de variedades resistentes nos programas de melhoramento genético. / The ratoon stunting disease of sugarcane (RSD ) is one of the most important diseases of this crop, occurring, if not in alI, in most of the commercial production areas of the world. The lack of characteristic symptoms has made more difficult a quick evaluation of the intensity of RSD in commercial fields and during the breeding of the varieties. Many diagnostic methods are mentioned in the literature. However, they were not properly studied regarding their efficiency and practicability. Therefore, this work was proposed to illustrate some points, in order to determine a method that has desirable characteristics such as, practicability in execution, economy of time, low cost and accuracy. Simultaneously with this comparison of methods, the resistance to RSD was evaluated in some commercial varieties of sugarcane in order to verify the validity of the screening method of resistant varieties. Three methods were evaluated: staining of the xylem by means of the transpiratory flow (CL), observation of the RSD bacterium in juice extracted from the xylem (CT) and alkaline-induced metaxylem autofluorescence (FL). It was verified that the methods (CL and CT) are equivalent in diagnosis of RSD when applied in plants where the bacterium had already interferred in the transport of xylem sap. Under the conditions tested, this interference occurred in approximately ten months after sprouting. The CT method showed greater sensivity for detecting the disease in stalks in the initial phase of the pathological process. The simplicity of execution and the low cost of the CL method permit its utilization for evaluation of commercial fields and nurseries and screening of resistant varieties in the breeding programs

Ratoon stunting disease (RSD) is a serious disease that affects all sugarcane producing countries. The major symptom of RSD is plant growth reduction, which is only seen in ratoon plants, causing up to 80% biomass reduction depending on environmental conditions. The disease is due to Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), a gram-positive and nutritionally fastidious bacterium that so far has been found to specifically colonize the xylem vessels of sugarcane. However, the successful early detection of this pathogen is currently the main challenge for RSD prevention. Breeding for resistance to RSD, although not in practice, is a viable control measure. Since sugarcane varieties differ in relation to their degree of colonization by Lxx and losses are directly related to population densities of the pathogen in the plant, a promising breeding strategy would be to select for genotypes that are resistant to bacterial multiplication. Thus, knowledge on the responses of sugarcane to RSD at the \"omics\" level is an essential starting step to identify key metabolic targets for breeding resistant varieties. The overall goal of this study is to determine the metabolic profiles of a susceptible (CB49-260) and resistant (SP80-3280) variety inoculated or not with Lxx and to compare the results with existing proteomic and transcriptomic data to define a core of targets (proteins, genes, and metabolites) that can be tested as markers of resistance in a collection of sugarcane varieties. Bacterial titers were quantified by Real-Time PCR (qPCR). The metabolites were profiled from the leaves and from the xylem saps collected at 30 and 120 days after inoculation (DAI). Untargeted analysis were performed with Gas Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS) and were carried out on leaves and sap from 120 DAI. Targeted analysis was executed with Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) on both tissues at both timepoints. To validate metabolomics results, a set of metabolites was chosen to be tested in vitro, in order to detect growth alterations caused to Lxx. qPCR confirmed the susceptibility of CB49-260 as it had higher titers than SP80-3280. Global analysis revealed that both varieties and tissues have different metabolic profiles but that those differences are more quantitative than qualitative. The targeted approach identified more amino acids, sugars, organic acids and phosphorylated compounds in the non-inoculated susceptible genotype, while the resistant one had higher abundance of phenolics. It was also shown that inoculation with Lxx results in more relative abundance of amino acids, organic acids, phosphorylated compounds and phenolics. Furthermore, a key amino acid for Lxx survival was related to inoculation on both varieties, as well as a known phenolic compound related to plant defense. Distinguished phenolics resulting from the targeted analysis were selected to evaluate their effect on Lxx growth in vitro. Although some compounds caused inhibition, further optimization of the methodology is needed to confirm these results. / O Raquitismo-da-soqueira (RSD) é uma grave doença que afeta todos os paises produtores de cana-de-açúcar. O principal sintoma do RSD é tamanho reduzido das plantas, observado apenas nas plantas-soca, o que pode resultar em perdas de biomassa em até 80%, dependendo das condições climáticas. A doença é causada por Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), uma bactéria gram-positiva e fastidiosa, descrita até o presente momento como hospedeira natural apenas da cana-de-açúcar, colonizando principalmente os vasos do xilema. Todavia, a detecção precoce deste patógeno é o principal desafio para prevenção do RSD. O melhoramento genético para resistência ao RSD, apesar de viável, não é uma medida de controle adotada na prática. Como existe diferenças entre as variedades de cana em relação ao grau de colonização por Lxx e as perdas estão diretamente relacionadas ao título bacteriano, uma estratégia de melhoramento promissora é a seleção de genótipos que apresentam resistência à multiplicação bacteriana. Portanto, o conhecimento das respostas da cana-de-açúcar ao RSD em termos \"ômicos\" é um passo inicial primordial para a identificação de alvos-chave para melhorar variedades resistentes. O objetivo geral deste estudo foi determinar os perfis metabólicos de duas variedade, uma suscetível (CB49-260) e uma resistente (SP80-3280) inoculada ou não com Lxx e comparar os resultados com dados já existentes de proteômica e transcriptômica para definir um núcleo de alvos (proteínas, genes e metabólitos) que possam ser testados como marcadores de resistência em uma coleção de cana-de-açúcar. Os títulos bacterianos foram quantificados por PCR em tempo real (qPCR). Os perfis metabólicos foram elaborados a partir de folhas e fluído xilemático coletados aos 30 e 120 dias após inoculação (DAI). A análise não-direcionada foi realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS), usando folhas e extratos coletados aos 120 DAI. Já a análise direcionada foi efetivada via cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS), em ambos tecidos e tempos de coleta. Para validar os resultados de metabolômica, um grupo de metabólitos destacado nas análises de metabolômica foi escolhido para testes in vitro e por fim detectar alterações no crescimento de Lxx. O resultado do qPCR confirmou a suscetibilidade da CB49-260, pois esta continha títulos superiores à SP80-3280. A análise global revelou que ambos variedades e tecidos possuem perfis metabólicos distintos, porém essas diferenças foram mais quantitativas que qualitativas. A análise direcionada identificou mais aminoácidos, açúcares, ácidos organicos e compostos fosforilados no genótipo suscetível não-inoculado, enquanto que o resistente apresentou maior abundância de compostos fenólicos. Também foi demonstrado que a inoculação com Lxx resultou em maior quantidade de aminoácidos, ácidos orgânicos, compostos fosforilados e fenólicos. Ademais, um aminoácido essencial à sobrevivência de Lxx foi relacionado à inoculação de ambas variedades, assim como um composto fenólico relacionado a defesa de plantas. O teste in vitro mostrou que, apesar de alguns compostos causarem inibição, é necessário aprimorar a metodologia utilizada para confirmar os resultados obtidos.

Atualmente, o Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar (Saccharum ssp.), no qual o estado de São Paulo é responsável por mais de 50% da produção. Esta cultura é hospedeira de diversos patógenos que podem limitar sua produção, dentre os quais se destaca a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), agente causal do raquitismo da soqueira (ratoon stunting disease - RSD). Pouco se sabe sobre a fisiologia deste organismo e quais as estratégias utilizadas por este para colonizar seu hospedeiro. No entanto, sabemos que para infectar e colonizar seus hospedeiros, é necessário que bactérias parasíticas superem estresses de diversas naturezas impostas durante estes processos, como os estresses oxidativo e o osmótico. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram identificar in silico e analisar a expressão in vitro, por qPCR, de genes relacionados a estes dois estresses. Uma análise da sequência do genoma de Lxx identificou 35 genes, sendo 8 relacionados ao estresse oxidativo, 9 relacionados ao estresse osmótico e 11 relacionados a estresse gerais, incluindo um cluster de 6 genes envolvidos na síntese de carotenoides. A expressão destes foi avaliada 60 minutos após exposição a 30mM de H2O2 ou 7% (p/v) de polietilenoglicol 6000 (PEG 6000). Sete genes foram avaliados como normalizadores das reações de qPCR. A quantificação do grau de peroxidação lipídica indicou que ambos os tratamentos resultaram em sensível peroxidação, muito embora o efeito do tratamento com PEG 6000 tenha sido maior do que o tratamento com H2O2. A exposição ao H2O2 aumentou a expressão dos genes katA (catalase), sodA (superóxido dismutase), msrA (Sulfóxido de metionina redutase) e msrB (Sulfóxido de metionina redutase) bem como de todos os genes responsáveis pela síntese de carotenoides. Por outro lado, todos os genes relacionados ao estresse osmótico foram menos expressos na presença deste composto. Já quando a bactéria foi exposta a PEG 6000, o oposto ocorreu, ou seja, os genes relacionados ao estresse osmótico, que são otsA (Trealose-6-fosfato sintase), otsB (Trealose fosfatase), treY (Malto-oligosil trealose sintase), treZ (Malto-oligosil trealose trealoidrolase), treS (Trealose sintase), proX (Proteína de ligamento em substrato, tipo ABC glicina betaína transportadora), proW (Proteína permease, tipo ABC glicina betaína transportadora), proZ (Proteína permease, tipo ABC glicina betaína transportadora) e Naggn (Amidotransferase), além dos genes do cluster carotenoide, foram mais expressos, ao passo que alguns dos genes ligados à resposta ao estresse oxidativo foram menos expressos. Verificou-se também, através de PCR convencional utilizando primers para amplificar as regiões entre os genes carotenoides, que estes são expressos como um RNA policistrônico, constituindo assim um operon. Estes resultados validam predições anteriores baseadas na análise in silico da sequência do genoma de Lxx, confirmando que Lxx possui mecanismos responsivos aos estresses osmótico e oxidativo aos quais é submetida durante o processo de infecção de seu hospedeiro. / Currently, Brazil is the largest producer of sugarcane (Saccharum spp.) and the state of São Paulo accounts for over 50% of the national production. This crop is host to many pathogens that may limit its production, among which the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), causal agent of ratoon stunting disease (RSD), is one of the most important. Little is known about the physiology of this organism and the strategies it uses to colonize its host. However, it is known that to infect and colonize their hosts, parasitic bacteria have to overcome stresses of various natures imposed during these processes, such as oxidative and osmotic stresses. In such context, the objectives of this study were to identify in silico and to analyze in vitro, by qPCR, the expression of Lxx genes related to these two stresses. The analysis of the genome sequence of Lxx identified 35 genes, of which 8 were related to oxidative stress, 9 to osmotic stress and 11 to general stress, including a cluster of 6 genes involved in the synthesis of carotenoids. The expression of these genes was assessed 60 minutes after exposure to either 30 mM of hydrogen peroxide (H2O2) or 7% (w/v) of polyethylene glycol 6000 (PEG6000). Seven genes were tested as normalizers of the qPCR reactions. The quantification of the level of lipid peroxidation in cells of Lxx indicated that both treatments induced substantial peroxidation, even though the effect of PEG6000 was greater than that of H2O2. The exposure to H2O2 resulted in higher expression of the genes katA (catalase), sodA (superoxide dismutase), msrA (sulfoxide methionine reductase) and msrB (sulfoxide methionine reductase), as well as all genes involved in the synthesis of carotenoids. On the other hand, the expression of all genes related to osmotic stress was reduced in the presence of this compound. When Lxx was exposed to PEG6000, the opposite was detected: the expression of the genes related to osmotic stress, otsA (Trehalose-6- phosphate synthase), otsB (trehalose phosphatase), treY (Malto-oligosil trehalose synthase) treZ (Malto-oligosil trehalose trehaloidrolase), treS (trehalose synthase), proX (ligament protein substrate, type ABC glycine betaine carrier), proW (permease protein, ABC type glycine betaine carrier), proZ (protein permease, type ABC glycine betaine carrier) and naggn (amidotransferase), along with the carotenoid genes was increased, while some of the genes linked to oxidative stress response were less expressed. It was also concluded through conventional PCR that the genes of the carotenoid cluster are expressed as a polycistronic RNA and, therefore, this arrangement constitutes an operon. These results validate previous in silico predictions that Lxx has mechanisms responsive to osmotic and oxidative stresses to which it is subjected during the process of infection of its host.

Thyciana Rodrigues Ribeiro. Raquitismo hipofosfatêmico familiar : estudo sobre peptídeos salivares e estrutura mineral dentária. 2013. 112 f. Tese (Doutorado em Odontologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-02T13:17:03Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_trribeiro.pdf: 1978406 bytes, checksum: f8d95926d92697c8b6b152595d185cb3 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-04T16:15:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_trribeiro.pdf: 1978406 bytes, checksum: f8d95926d92697c8b6b152595d185cb3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-04T16:15:28Z (GMT). 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In this context, this thesis, constituted by 4 articles aimed to: (1) describe the main systemic manifestations, oral findings and dental management in 3 generations of an affected family; (2) analyze the mineralization pattern of enamel and dentin in patients affected by XLHR using micro-CT, and to associate enamel and dentin mineralization in primary and permanent teeth with tooth position, gender and presence/absence of this disease; (3) evaluate the peptide profile in the saliva of patients with X-linked hypophosphatemic rickets using high performance liquid chromatography; and (4) characterize salivary proteins in this condition using unidimensional electrophoresis. On study 1, oral exams, laboratorial and histologic evaluations, cone-beam computed tomographies, panoramic and periapical radiographs were performed to properly institute the most adequate treatment strategy. On study 2, teeth were collected from 5 individuals from the same family. Gender, age, tooth position (anterior/posterior) and tooth type (deciduous/permanent) were recorded for each patient. Following collection, teeth were placed in 0.1% thymol solution until Micro-CT scan. Projection images were reconstructed and analyzed. On study 3, unstimulated whole and stimulated parotid saliva were obtained from 8 individuals with (AFF) and 8 healthy individuals, both genders, without (CON) x-linked hypophosphatemic rickets aged from 8 to 66 years. Supernatants were analyzed by high performance liquid chromatography, and the salivary flow rate (ml/min) was calculated. Each major peak in the HPLC chromatogram of each sample was characterized. On study 4, unstimulated whole and stimulated parotid saliva were also obtained, being total protein concentration determined by the Bicinchoninic Acid Protein (BCA) method. Proteins were characterized according to their molecular weights within the unidimensional electrophoresis. The study 1 showed the importance of the knowledge of clinical signs and symptoms of XLHR for the correct diagnosis of this disease, and for the establishment of preventive and comprehensive dental care. On article 2, teeth of all affected patients presented dentin with a different mineralization pattern compared to the teeth of the healthy individual with dentin defects observed next to the pulp chambers. On the third article, whole and parotid salivary flows were significantly different (p = 0.001), being flow of whole saliva higher (0.518 ± 0.282 mL/min) than parotid saliva (0.124 ± 0.086 mL/min). Whole salivary flow rate was higher in the AFF group (0.698 ± 0.229) than in the CON group (0.339 ± 0.210 mL/min) (p = 0.006). Twenty-eight peaks were found in whole and 21 peaks in parotid saliva. Whole saliva of the CON group presented lower number of peaks than AFF group. In parotid saliva, peaks 17 and 28 (retention times: 24 and 39 min) were found exclusively in the AFF group, and peak 13 (retention time: 19 min) exclusively in the CON. Article 4 showed difference concerning to total protein concentration between whole and parotid saliva (p < 0.001), being higher concentration found in whole saliva (102.603 ± 42.336 µg/mL) than in parotid saliva (0.699 ± 0.438 µg/mL). Bands with 102 kDa, 48 kDa and 24 kDa presented higher intensity in whole saliva of CON group (p = 0.015, p = 0.043 and p = 0.022). In conclusion, XLHR patients presented specific characteristics in dentin mineralization and salivary proteins and peptides, which can lead to differentiate these patients from healthy individuals, improving the diagnostic field. / Raquitismo hipofosfatêmico ligado ao cromossomo X (XLHR) é a maior causa de raquitismo hereditário, com uma incidência de 1:20.000 nascidos vivos, representando mais de 80% das formas de raquitismo hipofosfatêmico familiar. A saliva é o fluido humano mais disponível e de fácil acesso, o que faz dela uma das ferramentas mais pesquisadas no diagnóstico de patologias. Nesse contexto, essa tese, constituída de 4 artigos objetivou: (1) descrever as principais manifestações sistêmicas, achados orais e tratamentos dentários em 3 gerações de uma família afetada; (2) analisar o padrão de mineralização do esmalte e da dentina nos pacientes afetados por XLHR, utilizando microtomografia computadorizada (Micro CT), e associar a mineralização do esmalte e da dentina em dentes decíduos e permanentes, segundo gênero e presença/ausência da doença; (3) avaliar o perfil de peptídeos na saliva de pacientes com XLHR, utilizando cromatografia líquida de alta performance (HPLC); e (4) caracterizar proteínas salivares nessa condição, utilizando eletroforese unidimensional. No estudo 1, exames orais, laboratoriais e avaliações histológicas, tomografias computadorizadas cone-beam e radiografias periapicais foram realizadas para a apropriada instituição da estratégia de tratamento mais adequada. No estudo 2, dentes foram coletados de 5 indivíduos de uma mesma família. Gênero, idade, posição dentária (anterior/posterior) e tipo dentário (decíduo/permanente) foram registrados para cada paciente. Após a coleta, os dentes foram colocados em solução de timol a 0,1% até a análise através do Micro CT. As imagens projetadas foram reconstruídas e analisadas. No estudo 3, saliva total não estimulada e saliva de parótida estimulada foram obtidas de 8 indivíduos afetados com (AFF) e 8 indivíduos sem (CON) XLHR, de ambos os gêneros e idades entre 8 e 66 anos. Sobrenadantes foram analisados por meio de HPLC e o fluxo salivar (mL/min) foi calculado. Os picos que se apresentaram maiores nos cromatogramas do HPLC foram caracterizados. No estudo 4, saliva total não estimulada e saliva de parótida estimulada também foram obtidas, sendo a concentração de proteínas totais determinada pelo Método do Ácido Bicinconínico (BCA). Proteínas foram caracterizadas de acordo com o peso molecular através de eletroforese unidimensional. O estudo 1 mostrou a importância do conhecimento dos sinais e sintomas clínicos do XLHR para o correto diagnóstico dessa doença, e para o estabelecimento de atendimento odontológico preventivo e abrangente. No artigo 2, os dentes de todos os pacientes afetados apresentaram dentina com padrão de mineralização diferente comparado aos dentes de indivíduos saudáveis, sendo os defeitos na dentina observados próximo às câmaras pulpares. No artigo 3, os fluxos salivares da saliva total e de parótida foram significativamente diferentes (p=0,001), sendo o fluxo de saliva total maior (0,518 ± 0,282 mL/min) do que o de saliva de parótida (0,124 ± 0,086 mL/min). O fluxo salivar da saliva total foi maior no grupo AFF (0,698 ± 0,229) que no grupo CON (0,339 ± 0,210 mL/min) (p = 0,006). Vinte e oito picos foram encontrados em saliva total e 21 em saliva de parótida. A saliva total do grupo CON apresentou menor número de picos que a do grupo AFF. Na saliva de parótida, os picos 17 e 28 (tempos de retenção: 24 e 39 min) foram encontrados exclusivamente no grupo AFF e o pico 13 (tempo de retenção: 19 min) no CON. Artigo 4 demonstrou diferença relacionada à concentração de proteínas totais entre saliva total e de parótida (p < 0,001), sendo a maior concentração encontrada na saliva total (102,603 ± 42,336 µg/mL) que na saliva de parótida (0,699 ± 0,438 µg/mL). Bandas com 102 kDa, 48 kDa e 24 kDa apresentaram maior intensidade na saliva total do grupo CON (p = 0,015, p = 0,043 e p = 0,022). Em conclusão, pacientes com XLHR apresentaram características específicas relacionadas à mineralização dentinária e proteínas e peptídeos salivares que podem levar à diferenciação desses pacientes de indivíduos saudáveis, avançando no campo diagnóstico.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3653.pdf: 2793009 bytes, checksum: 247e499e66ebb17e3eb07a818050fc9a (MD5) Previous issue date: 2010-09-30 / The sugar cane is a semiperennial plant currently considered one of the most important crops in the world due to its ability to produce renewable energy (ethanol) and sugar. The soil quality, water availability and temperature are the main effects that made Brazil the largest producer. However some factors influence the sugarcane productivity, mainly diseases. Among them we can cite the ratoon stunting disease caused by the bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli worldwide known to cause up-to-30% losses in the productivity. The spread of infected seedlings and the absence of external symptoms make it difficult to diagnose and require the use of laboratory techniques. Thermotherapy, cutting-material cleaning with detergent solutions and the use of resistant varieties are the key measures to contain the disease. Due to its easy spread and high rates of reduction in the productivity the objective of this study was to evaluate how the effect of four different concentrations of Lxx for four cuts, would affect the interaction varieties x cuts x bacterial concentration. Therefore it evaluates possible losses on the technological variants and the reliability of Dot blot test for the PCR from DNA extraction according to the protocol of CTAB. The analyzed data showed no significant reduction in varieties productivity in none of the four different bacterial concentrations including the control plants, as well as in technological variables on study. According to data the Dot blot technique was more sensitive than the PCR conditions utilized in this study. / A cana-de-açúcar é uma planta semi perene considerada atualmente uma das mais importantes culturas agrícolas no mundo devido a sua capacidade de produzir energia renovável (álcool) e açúcar. A qualidade do solo, a disponibilidade de água e principalmente a temperatura são os principais efeitos que tornaram o Brasil o maior produtor mundial. Entretanto alguns fatores interferem na produtividade dos canaviais principalmente as doenças. Dentre elas podemos citar o raquitismo-das-soqueiras causado pela bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli mundialmente conhecido por causar perdas que podem chegar a 30% na produtividade. A disseminação de mudas contaminadas e a ausência de sintomas externos tornam difícil sua diagnose sendo necessário o uso de técnicas laboratoriais. Termoterapia, limpeza de material de corte com soluções detergentes e uso de variedades resistentes são as principais medidas para conter a doença. Devido a sua fácil disseminação e as altas taxas de redução na produtividade o objetivo deste trabalho foi avaliar como o efeito de quatro diferentes concentrações de Lxx, durante quatro cortes, afetaria as interações variedades x cortes x concentração bacteriana. Além de avaliar possíveis perdas nas variáveis tecnológicas e a confiabilidade do teste de Dot blot em relação ao PCR a partir da extração de DNA de acordo com o protocolo de CTAB. Os dados analisados mostraram que não houve redução significativa na produtividade das variedades em nenhuma das quatro diferentes concentrações bacterianas inclusive nas plantas testemunhas, assim como nas variáveis tecnológicas em estudo. De acordo com os dados a técnica de Dot blot mostrou-se mais sensível que a do PCR nas condições empregadas neste trabalho.

Orientador: Lilia F. R. de Souza Li / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T11:10:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macedo_LuciaCosentinode_M.pdf: 2481805 bytes, checksum: 85ab094926dbe8ad65a47ec2c1c6fcf5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A 1,25-dihidroxivitamina D é de fundamental importância na homeostase do cálcio. A vitamina D exerce suas ações através da interação com o seu receptor. O receptor da vitamina D (VDR) é membro da superfamília de receptores nucleares. O raquitismo é uma doença causada por mineralização deficiente na matriz óssea ou osteóide, afetando o desenvolvimento e a formação do osso na fase de crescimento. Mutações no receptor da vitamina D causam raquitismo dependente de vitamina D tipo II. Neste tipo de raquitismo ocorre hipocalcemia e as concentrações séricas de 1,25-dihidroxivitamina D3 são elevadas e, na maioria das vezes não há resposta ao tratamento com doses altas de 1,25-dihidroxivitamina D. Pacientes apresentam raquitismo grave de inicio precoce, nos primeiros meses de vida e a maior parte dos indivíduos apresenta pouco ou nenhum pêlo corporal (alopecia). O objetivo principal deste projeto foi a análise molecular do receptor de vitamina D (VDR) em quatro pacientes com raquitismo dependente de vitamina D tipo n que manifestaram raquitismo e alopecia. Amostras de DNA destes pacientes foram usadas para sequenciar o gene do VDR. Os cromatogramas gerados foram analisados em programas específicos, visando a busca de mutações. A análise mostrou 2 novas mutações pontuais que resultam em mudança de aminoácido (Q259E e G319V) e uma mutação que introduz um codon terminal (R73X). A cultura primária de fibroblasto proveniente de biópsia de pele dos pacientes foi usada para análise funcional do receptor. Extrato proteico nuclear mostrou redução de expressão de todos os receptores mutados. O receptor truncado contendo apenas parte do domínio de ligação com o DNA perdeu o epítopo de interação com o anticorpo usado, não sendo identificado no Western blot pelo anticorpo utilizado, impossibilitando a avaliação de sua expressão. Tratamento da cultura primária de fibroblasto com doses crescentes de l,25(OH)2 vitamina D demonstrou que os VDRs mutados foram incapazes de ser ativado e aumentar a expressão de 24-hidroxilase. Este trabalho identificou mutações em quatro pacientes com raquitismo dependente de vitamina D tipo II e estas mutações resultaram em comprometimento funcional do VDR / Abstract: The 1,25-dihydroxyvitamin D plays a fundamental role in the calcium homeostasis. The vitamin D exerts its actions through the interaction with its receptor. The vitamin D receptor (VDR) is a member of the superfamily of nuclear receptors. Rickets is a disease caused by deficient mineralization in the bone matrix or osteoids, affecting the development and formation of the bone during the growth stage. Mutations in the vitamin D receptor are associated to the vitamin D-dependent rickets type II. The biochemical characteristics is hypocalcemia and increase levels of 1,25-dihydroxyvitamin D3, and most of time there is no answer to the treatment with high doses of 1,25-dihydroxyvitamin D. Patients present rickets and or osteomalacia of varying severity beginning in the first months of life and most of the individuals presents little or any body hair (alopecia). The main objective of this project was the molecular analysis of the vitamin D receptor (VDR) in four patients with vitamin D-dependent rickets type II that manifested with rickets and alopecia. DNA samples of these patients were used to sequence the VDR gene. The generated chromatograms were analyzed in specific programs, aiming the search of mutations. The analysis showed two novel missense mutation that result in amino acid change (Q259E e G319V) and one nonsense mutations (R73X). Fibroblast primary culture derived from the patients' skin biopsy was carried out for functional analysis of the receptor. Nuclear protein extract showed reduction of expression of all mutant receptors. The truncated VDR receptor containing only part of the DNA binding domain lost the region containing the epitopo which the antibody was raised against and it was not identified by the Western blot analysis. Treatment of the fibroblast primary culture treatment with increasing doses of l,25(OH)2 vitamin D showed that the mutant VDR were unable to be activated and to increase the expression of the 24-hydroxylase. It was found mutations in the four patients with vitamin D-dependent rickets type II studied. Functional analysis confirmed that the mutations impaired the VDR activation / Mestrado / Mestre em Farmacologia

O raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar (RS) é uma das doenças mais importantes desta cultura, ocorrendo, se não em todas, na maioria das áreas de produção comercial do mundo. A falta de sintomas característicos tem dificultado uma avaliação rápida da intensidade do RS em campos comerciais e durante o melhoramento genético das variedades. Muitos métodos de diagnóstico são citados na literatura, porém não foram devidamente estudados quanto a sua eficiência e praticidade. Sendo assim, este trabalho se propôs a elucidar alguns pontos a fim de determinar um método que possua características desejáveis como praticidade na execução, economia de tempo, baixo custo e precisão. Concomitante a esta comparação de métodos, avaliou-se a resistência ao RS de algumas variedades comerciais de cana-de-açúcar para verificar a validade dos métodos na seleção de variedades resistentes. Três métodos foram avaliados: coloração do xilema através do fluxo transpiratório (CL) , observação da bactéria do RS em suco extraído do xilema (CT) e autofluorescência do metaxilema (FL). Verificou-se que os métodos (CL e CT) são equivalentes no diagnóstico do RS quando aplicados em plantas cujo processo de transporte de seiva bruta já sofreu interferência da bactéria. Nas condições testadas esta interferência ocorreu em torno de dez meses após a brotação. O método CT mostrou maior sensibilidade por detectar o patógeno em colmos na fase inicial do processo patológico. A simplicidade de execução e o baixo custo do método CL permitem a sua utilização para avaliação de campos comerciais, viveiros de mudas e seleção de variedades resistentes nos programas de melhoramento genético. / The ratoon stunting disease of sugarcane (RSD ) is one of the most important diseases of this crop, occurring, if not in alI, in most of the commercial production areas of the world. The lack of characteristic symptoms has made more difficult a quick evaluation of the intensity of RSD in commercial fields and during the breeding of the varieties. Many diagnostic methods are mentioned in the literature. However, they were not properly studied regarding their efficiency and practicability. Therefore, this work was proposed to illustrate some points, in order to determine a method that has desirable characteristics such as, practicability in execution, economy of time, low cost and accuracy. Simultaneously with this comparison of methods, the resistance to RSD was evaluated in some commercial varieties of sugarcane in order to verify the validity of the screening method of resistant varieties. Three methods were evaluated: staining of the xylem by means of the transpiratory flow (CL), observation of the RSD bacterium in juice extracted from the xylem (CT) and alkaline-induced metaxylem autofluorescence (FL). It was verified that the methods (CL and CT) are equivalent in diagnosis of RSD when applied in plants where the bacterium had already interferred in the transport of xylem sap. Under the conditions tested, this interference occurred in approximately ten months after sprouting. The CT method showed greater sensivity for detecting the disease in stalks in the initial phase of the pathological process. The simplicity of execution and the low cost of the CL method permit its utilization for evaluation of commercial fields and nurseries and screening of resistant varieties in the breeding programs

Atualmente, o Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar (Saccharum ssp.), no qual o estado de São Paulo é responsável por mais de 50% da produção. Esta cultura é hospedeira de diversos patógenos que podem limitar sua produção, dentre os quais se destaca a bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), agente causal do raquitismo da soqueira (ratoon stunting disease - RSD). Pouco se sabe sobre a fisiologia deste organismo e quais as estratégias utilizadas por este para colonizar seu hospedeiro. No entanto, sabemos que para infectar e colonizar seus hospedeiros, é necessário que bactérias parasíticas superem estresses de diversas naturezas impostas durante estes processos, como os estresses oxidativo e o osmótico. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram identificar in silico e analisar a expressão in vitro, por qPCR, de genes relacionados a estes dois estresses. Uma análise da sequência do genoma de Lxx identificou 35 genes, sendo 8 relacionados ao estresse oxidativo, 9 relacionados ao estresse osmótico e 11 relacionados a estresse gerais, incluindo um cluster de 6 genes envolvidos na síntese de carotenoides. A expressão destes foi avaliada 60 minutos após exposição a 30mM de H2O2 ou 7% (p/v) de polietilenoglicol 6000 (PEG 6000). Sete genes foram avaliados como normalizadores das reações de qPCR. A quantificação do grau de peroxidação lipídica indicou que ambos os tratamentos resultaram em sensível peroxidação, muito embora o efeito do tratamento com PEG 6000 tenha sido maior do que o tratamento com H2O2. A exposição ao H2O2 aumentou a expressão dos genes katA (catalase), sodA (superóxido dismutase), msrA (Sulfóxido de metionina redutase) e msrB (Sulfóxido de metionina redutase) bem como de todos os genes responsáveis pela síntese de carotenoides. Por outro lado, todos os genes relacionados ao estresse osmótico foram menos expressos na presença deste composto. Já quando a bactéria foi exposta a PEG 6000, o oposto ocorreu, ou seja, os genes relacionados ao estresse osmótico, que são otsA (Trealose-6-fosfato sintase), otsB (Trealose fosfatase), treY (Malto-oligosil trealose sintase), treZ (Malto-oligosil trealose trealoidrolase), treS (Trealose sintase), proX (Proteína de ligamento em substrato, tipo ABC glicina betaína transportadora), proW (Proteína permease, tipo ABC glicina betaína transportadora), proZ (Proteína permease, tipo ABC glicina betaína transportadora) e Naggn (Amidotransferase), além dos genes do cluster carotenoide, foram mais expressos, ao passo que alguns dos genes ligados à resposta ao estresse oxidativo foram menos expressos. Verificou-se também, através de PCR convencional utilizando primers para amplificar as regiões entre os genes carotenoides, que estes são expressos como um RNA policistrônico, constituindo assim um operon. Estes resultados validam predições anteriores baseadas na análise in silico da sequência do genoma de Lxx, confirmando que Lxx possui mecanismos responsivos aos estresses osmótico e oxidativo aos quais é submetida durante o processo de infecção de seu hospedeiro. / Currently, Brazil is the largest producer of sugarcane (Saccharum spp.) and the state of São Paulo accounts for over 50% of the national production. This crop is host to many pathogens that may limit its production, among which the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), causal agent of ratoon stunting disease (RSD), is one of the most important. Little is known about the physiology of this organism and the strategies it uses to colonize its host. However, it is known that to infect and colonize their hosts, parasitic bacteria have to overcome stresses of various natures imposed during these processes, such as oxidative and osmotic stresses. In such context, the objectives of this study were to identify in silico and to analyze in vitro, by qPCR, the expression of Lxx genes related to these two stresses. The analysis of the genome sequence of Lxx identified 35 genes, of which 8 were related to oxidative stress, 9 to osmotic stress and 11 to general stress, including a cluster of 6 genes involved in the synthesis of carotenoids. The expression of these genes was assessed 60 minutes after exposure to either 30 mM of hydrogen peroxide (H2O2) or 7% (w/v) of polyethylene glycol 6000 (PEG6000). Seven genes were tested as normalizers of the qPCR reactions. The quantification of the level of lipid peroxidation in cells of Lxx indicated that both treatments induced substantial peroxidation, even though the effect of PEG6000 was greater than that of H2O2. The exposure to H2O2 resulted in higher expression of the genes katA (catalase), sodA (superoxide dismutase), msrA (sulfoxide methionine reductase) and msrB (sulfoxide methionine reductase), as well as all genes involved in the synthesis of carotenoids. On the other hand, the expression of all genes related to osmotic stress was reduced in the presence of this compound. When Lxx was exposed to PEG6000, the opposite was detected: the expression of the genes related to osmotic stress, otsA (Trehalose-6- phosphate synthase), otsB (trehalose phosphatase), treY (Malto-oligosil trehalose synthase) treZ (Malto-oligosil trehalose trehaloidrolase), treS (trehalose synthase), proX (ligament protein substrate, type ABC glycine betaine carrier), proW (permease protein, ABC type glycine betaine carrier), proZ (protein permease, type ABC glycine betaine carrier) and naggn (amidotransferase), along with the carotenoid genes was increased, while some of the genes linked to oxidative stress response were less expressed. It was also concluded through conventional PCR that the genes of the carotenoid cluster are expressed as a polycistronic RNA and, therefore, this arrangement constitutes an operon. These results validate previous in silico predictions that Lxx has mechanisms responsive to osmotic and oxidative stresses to which it is subjected during the process of infection of its host.

O método sorológico \"tissue blot enzyme immunoassay\" foi utilizado para determinar a taxa de colonização dos vasos do xilema por Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) em colmos de 28 variedades de cana-de-açúcar, incluindo a CB47-355, CB41-76 e CB49-260 como padrão resistente, intermediário e suscetível, respectivamente. Para cada variedade, 16 gemas foram tratadas termicamente a 50,5ºC por 2 horas e, em seguida, submetidas a banho fungicida a base de benomyl na dose de 6,5 g do princípio ativo por 10 litros de água. Oito gemas foram imersas por 10 minutos em caldo da CB49-260 sabidamente colonizada por Lxx diluído em água destilada na proporção 1:5 (\"INOCULADO\") e a outra metade em água (\"SADIO\"). Após a inoculação, foram plantados três vasos (repetições) para o tratamento, sendo as plantas mantidas em casa-de-vegetação até a colheita durante 7 meses, quando então 2 colmos de cada vaso foram amostrados para determinar a taxa de colonização dos vasos. A variedade CB47-355 não apresentou nenhum vaso colonizado, enquanto na CB41-76 e CB49-260 a taxa de colonização foi igual a 17% e 76%, sendo classificadas como resistente, intermediária e suscetível, respectivamente, concordando com literatura prévia. Das variedades em teste, 12 comportaram-se como intermediárias e 13 como suscetíveis. No primeiro caso, a %VC variou de 7 a 25 e, nas suscetíveis, de 25,7 a 76. Portanto, o aumento da taxa de colonização é praticamente linear da mais resistente para a mais suscetível, o que é característico de caráter quantitativo. Considerando que nenhuma variedade comercial mostrou-se resistente e que Lxx causa perdas significativas em todos os países produtores de cana-de-açúcar, sugere-se que os programas de melhoramento devem dirigir programas para a seleção de genitores e progênies para obter variedades resistentes. Enquanto isso não ocorre, atenção dever ser dada para o uso de mudas indexadas. / The tissue blot immunoassay (TBIA) for detecting Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) colonized vascular bundles (CVB) were used in determining the reaction of 28 brazilian sugarcane cultivars to ratoon stunting disease (RSD), including CB47-355, CB41-76 e CB49-260 as resistant, intermediate and susceptible standards. For each cultivar, 16 buds were hot water treated at 50,5 oC for 2 hours and protected against root rots with benomyl. Eight buds of each cultivar were than inoculated with infected sap of the CB49-260 diluted 1:5 in water, and the remaining 8 buds were inoculated with distilled water for planting the control plots. The reps of each cultivar were planted in plastic plots at green house. At harvesting, seven months after planting, two stalks were sampled from each plot. The rate of colonization of vascular bandles by Lxx in stalks of each cultivar was determined. Statistical analysis by the univariate clustering method (Scott-Knott) was reliable for grouping genotypes according to their levels of Lxx resistance by the percentage of CVB. The cultivar CB47-355 did not present any CVB, while CB41-76 and CB49-260 presented 17% and 76%, being classified as resistant, intermediate and susceptible, in agreement with previous literature. Among the varieties in test, 12 were intermediates and 13 susceptibles. The percent of CVB among the intermediate and susceptible cultivars varied from 7% to 25% and 25,7 to 76%, respectively. The knowledge of resistance of each cultivar is essential for advising the use of complementary phytossanitary measures to control the disease. Since all cultivars are intermediate or susceptible, the sugarcane breeding programs need specific works for selection and releasing of resistant cultivars. Before this, schemes of nurseries and the use clean seed cane are recommended.