Orientador: Luis Guillermo Bahamondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-11-07T17:25:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_JosianeAparecidaAndradedo_D.pdf: 304920 bytes, checksum: a33fb24706f276ef7a6353ee4def52fe (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Os objetivos foram avaliar a reação acrossomal (RA) de espermatozóides recuperados depois de lavado uterino, medir o levonorgestrel (LNG) no soro e no lavado uterino e avaliar a expressão da glicodelina-A endometrial após a administração do LNG para anticoncepção de emergência (AE). MATERIAIS E MÉTODOS: Quarenta e oito experimentos foram realizados em 14 mulheres menstruando regularmente. Quatro grupos foram formados diferindo entre eles os intervalos coito?tratamento e tratamento?recuperação dos espermatozóides e obtenção da biópsia. RESULTADOS: A concentração dos espermatozóides recuperados a partir da cavidade uterina 24 ou 48 horas após o tratamento foi de 14,5 ± 3,9 x 106 e 17,3 ± 6,8 x 106 células/ml, respectivamente. Não houve diferenças entre a taxa de RA e a intensidade da expressão da glicodelina-A endometrial nos ciclos tratados com LNG ou placebo. Após 24 horas da administração do LNG o valor no fluido de lavagem da cavidade uterina representou 1,38% dos valores observados no soro. CONCLUSÕES: A RA ou a expressão da glicodelina-A endometrial não foram influenciadas pelo LNG após 24 ou 48 horas da sua administração para AE. O LNG não prejudicou o muco Resumo x cervical uma vez que espermatozóides viáveis foram encontrados no trato genital feminino 36-60 horas após o coito e 24-48 horas após a ingestão do LNG. O mecanismo de ação do LNG para AE permanece enigmático / Abstract: The objectives were to assess acrosomal reaction (AR) of spermatozoa following flushing the uterus, to measure levonorgestrel (LNG) in serum and in the flushing fluid of the uterus and the endometrial glycodelin-A expression after administration of LNG as emergency contraception (EC). MATERIALS AND METHODS: Forty-eight experiments were conducted on 14 regularly menstruating women. Four groups were formed based on different intercourse - treatment interval and treatment ? recovery of spermatozoa and the biopsies. RESULTS: Spermatozoa recovered from uterus 24 or 48 hours after treatment were 14,5 ± 3,9 x 106 and 17,3 ± 6,8 x 106 cells/ml, respectively. There were no differences between the AR rate and the endometrial glycodelin-A staining intensity on LNG or placebo treated cycles. LNG at uterine flushing medium represents 1.38% of the values observed in serum at 24 hours after LNG intake. CONCLUSIONS: AR status or glycodelin-A were not influenced after 24 or 48 hours of administration of 1.5 mg of LNG as EC indicating no significant effect. LNG did not impair the cervical mucus either because viable spermatozoa were found in the genital tract 36-60 hours after coitus and 24-48 hours after LNG intake. The mechanism of action of LNG as EC remains enigmatic / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Tocoginecologia

O presente estudo visou investigar o efeito da refrigeração do sêmen da jaguatirica sobre o Índice de Motilidade Espermática [IME=(%M+MPx5)/2; %M = proporção de espermatozóides móveis; MP = motilidade progressiva], integridade acrossomal (IA) e capacitação espermática; assim como avaliar a eficácia da técnica FITC-PNA/IP na avaliação simultânea da viabilidade espermática (VE) e IA. Sete jaguatiricas foram eletroejaculadas, sendo utilizados apenas ejaculados (n=16) apresentando %M>=60% e MP>=3. Avaliou-se a IA por meio da Coloração Simples. Os ejaculados foram diluídos 1:1 na Variante do Diluente de PLatz e submetidos aos Protocolos de Transporte: Temperatura Ambiente e Refrigeração, - 0,23ºC/min, (Experimento 1); ou apenas Temperatura Ambiente (Experimentos 2 e 3). Após 2h, as alíquotas foram reaquecidas, reavaliando-se os parâmetros observados antes do transporte. Os espermatozóides foram lavados por centrifugação em meio F10 de Ham, ressuspensos nesse meio e processados conforme o experimento: (1) após pré-incubação (38ºC; 5%CO2) durante 0, 1, 2 e 4 horas, foram retiradas alíquotas a cada intervalo para serem incubadas (30 min) na ausência e na presença do cálcio ionóforo A23187 (Ca2+Ion) (1mM), avaliando-se IA e IME; (2) após pré-incubação por 0, 1 e 2h, foram incubadas alíquotas na ausência e presença de 1 e 2mM de Ca2+Ion, avaliado-se IA e IME; (3) pré-incubados por 9h, sendo retiradas alíquotas a cada hora, para as avaliações da IA e VE, (a) separadamente através da Coloração Simples e do IME, ou (b) simultaneamente através da técnica FITC-PNA/IP. A refrigeração causou declínio (p<0,02) da IA (71,0%) e IME (67,1), em comparação aos valores observados antes do transporte (88,5%; 85,4), enquanto a manutenção das amostras à temperatura ambiente não afetou (p>0,1) essas variáveis (84,8%; 76,4). Dentre as amostras refrigeradas, aquelas expostas ao Ca2+Ion sofreram redução (p<0,01) na IA (52,4%) frente ao controle (55,56%). Já nas amostras transportadas à temperatura ambiente, não foi observada diferença (p>0,1) entre os grupos com e sem ionóforo (64,41% vs. 63,87%). Quando analisados os tempos separadamente, o único tratamento em que houve efeito (p<0,05) do Ca2+Ion sobre a IA foi aquele refrigerado e pré-incubado por 2h. Foi verificada redução (p<0,05) nos valores de IME e IA devida à simples incubação, mesmo na ausência do Ca2+Ion. A concentração de 2µM dessa substância foi mais efetiva na indução da reação acrossômica que 1µM. Apesar dos fluorocromos FITC-PNA/IP terem se ligado aos espermatozóides, nas regiões esperadas, a proporção de células marcadas variou aleatoriamente durante pré-incubação, sem correlação (p>0,1) com IME. A IA avaliada pela Coloração Simples apresentou correlação positiva (r=0,77; p<0,0001) com IME, decrescendo (p<0,0001) durante pré-incubação. A refrigeração mostrou-se desvantajosa frente à manutenção do sêmen à temperatura ambiente, pois foi deletéria à função e às membranas dos espermatozóides. A refrigeração tornou-os capazes de responder ao estímulo do Ca2+Ion, característica observada nos espermatozóides capacitados. O ensaio de reação acrossômica induzida pelo Ca2+Ion deve ser aperfeiçoado para permitir avaliação acurada da capacitação espermática na jaguatirica. A Coloração Simples associada à avaliação do IME foi mais eficiente e menos laboriosa, frente á técnica FITC-PNA/IP, na avaliação da IA e VE. / This study aimed to investigate the effect of ocelot semen refrigeration on Sperm Motility Index [SMI=(%M+PMx5)/2; %M = proportion of motile spermatozoa ; PM = Progressive Motility], acrossomal integrity (AI) and sperm capacitation. Another objective was to evaluate the FITC-PNA/IP technique efficacy on evaluating simultaneously sperm viability (SV) and AI. Five ocelots, were electroejaculated, the semen was evaluated and only ejaculates (n=16) presenting %M>=60% and PM>=3 were used. Sperm AI was evaluated using Fast Green / Rose Bengal staining (FGRB). The ejaculates were diluted 1:1 in Platz Diluent Variant and subjected to the transportation protocols: Room Temperature and Cooling, -0.23ºC/min, (experiment 1); or only Room Temperature (experiments 2 and 3). After 2 hours, the aliquots were rewarmed and samples were taken to re-evaluate the parameters observed before the transport. The spermatozoa were washed in Ham’s F10 medium, ressuspended in fresh medium and processed differently, according the experiment: (1) after pre-incubation (38ºC; 5%CO2) during 0, 1, 2 and 4 hours, samples were taken at each time point to be incubated in the absence and presence of 1mM calcium ionophore A23187 (Ca2+Ion), SMI and AI were evaluated; (2) after pre-incubation during 0, 1 and 2h, aliquots were incubated in the absence and presence of 1 and 2 mM Ca2+Ion; SMI and AI were evaluated; (3) after pre-incubation during 9h, aliquots were taken every hour to compare the evaluation of SV and AI (a) separately by the FGRB staining and SMI or (b) simultaneously by the FITC-PNA / IP technique. Cooling caused decline (p<0.02) on AI (71.0%) and SMI (67.1), when compared to values observed before transportation (88.5%; 85.4). Maintenance at room temperature didn’t affect (p>0.1) these variables (84.8%; 76.4). Among cooled samples, spermatozoa exposed to Ca2+Ion showed smaller (P<0.01) AI value (52.4%) compared to the group incubated without that substance (55.56%). For samples transported at room temperature, it wasn’t observed difference (P>0.05) between the groups with and without ionophore (64.41% vs. 63.87%). When time intervals were analysed separately, the only treatment in which there was effect (p<0,05) of Ca2+Ion on AI was the group refrigerated and pre-incubated for 2h. There was a reduction (p<0,05) on SMI and AI due simply to incubation, even in the absence of Ca2+Ion. The 2µM concentration of this substance was more effective to induce acrosome reaction than 1µM. FITC-PNA and IP fluorocromes bound spermatozoa at the expected sites. However, proportion of marked cells varied randomly during pre-incubation, and didn’t correlate (p>0,1) with SMI. IA evaluated by FGRB staining showed positive correlation (r=0,77; p<0,0001) with SMI, decreasing (p<0,0001) during incubation. Cooling was disadvantageous compared to maintaining semen at room temperature, since it was deleterious to spermatozoa membranes and function, and made those cells capable to answer the Ca2+Ion challenge, a characteristic observed in capacitated spermatozoa. Ca2+Ion induced acrosome reaction assay must be improved to allow accurate evaluation of sperm capacitation on ocelots. FGRB staining associated to SMI evaluation was more efficient and easier to perform, than FITC-PNA/IP technique, for AI and SV investigation.

O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações morfo-funcionais do sêmen bovino submetido à sexagem através da técnica de citometria de fluxo e comparar com o sêmen convencional e a diferença entre as subespécies. O sêmen foi obtido de seis touros, sendo três taurinos (Holandês preto e branco) e três zebuínos (Gir leiteiro), com quatro ejaculados de cada animal (n = 24). Cinco tratamentos foram realizados: sêmen convencional com diluidor L (Lagoa); sêmen convencional com diluidor S (Sexing) e sêmen sexado (nos tempos de zero, três e seis horas após a ejaculação para avaliar se existem alterações de membranas ao longo do tempo). Foram avaliados pela citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e reação acrossomal (PI/FITC-PSA); peroxidação lipídica (C11-BODIPY581/591) e capacitação espermática através de análises da fosforilação da tirosina e aumento da fluidez e desorganização da membrana plasmática (Merocianina 540 e Yo-Pro1). Os efeitos de tratamentos foram avaliados por análises de variância (ANOVA), empregando-se o programa estatístico Stat-View&reg; (SAS Institute, Inc. 1998, Cary, NC, USA). Foram considerados significativos os valores com P<0,05 e com tendência a significância (P<0,10). O sêmen proveniente da subespécie taurina teve um efeito negativo mais significante do que a zebuína na qualidade do sêmen. O sêmen sexado apresentou maior peroxidação lipídica nos espermatozóides com membrana íntegra e a presença de proteínas fosforiladas na superfície da membrana plasmática, fatores que são indicativos de capacitação espermática. Porém, ao contrário do esperado, este aumento não foi acompanhado pela quantidade de células classificadas como capacitadas pela análise de associação de sondas Yo-Pro-1 e Merocianina 540, pois o sêmen convencional apresentou maior população espermática com membrana plasmática íntegra desorganizada (P<0,05). Não houve piora na qualidade do sêmen sexado devido ao tempo de espera do ejaculado (P<0,05). / The objective of this study was to evaluate the morpho-functions alterations in bovine semen submitted on sorting through flow cytometry technology and compare with conventional semen and the difference between the subspecies. Semen was obtained from six bulls, that three were taurine (Holstein Black and White) and three were zebuine (Dairy Gir) with four ejaculates from each animal (n = 24). Five treatments were performed: conventional semen with L (Lagoa) media; conventional semen with S (Sexing) media and sexed semen (zero, three and six hours after ejaculation to evaluate if there were membrane alterations over the time). The treatments were analyzed with flow cytometry as for plasmatic membrane integrity and acrosome reaction (PI/FITC-PSA); lipid peroxidation (C11-BODIPY581/591) and sperm capacitation through protein tyrosine phosphorylation and the increase in plasma membrane fluidity and disorganization (Merocyanine 540 and Yo-Pro-1). The treatments effects were evaluated by analysis of variance (ANOVA) (Stat-View&reg; SAS Institute, Inc. 1998, Cary, NC, USA). Effects were considered significant if the values were P<0.05 and with significant tendency (P<0.10). Semen from the taurine subspecie had a more significant negative effect than zebuine on semen quality. Sexed semen showed more lipid peroxidation in sperm with membrane integrity and the presence of phosphorylated proteins in plasma membrane surface that seemed to be sperm capacitation. However, in the contrary of expected, this increase did not accompany with quantity of cells classified as capacitated by the association probes Yo-Pro-1 e Merocyanine 540 analyse because the conventional semen showed more sperm population with plasma membrane integrity disorganized (P<0.05). There was not worsening in sexed semen quality over the time ejaculate waiting (P<0.05).

O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações morfo-funcionais do sêmen bovino submetido à sexagem através da técnica de citometria de fluxo e comparar com o sêmen convencional e a diferença entre as subespécies. O sêmen foi obtido de seis touros, sendo três taurinos (Holandês preto e branco) e três zebuínos (Gir leiteiro), com quatro ejaculados de cada animal (n = 24). Cinco tratamentos foram realizados: sêmen convencional com diluidor L (Lagoa); sêmen convencional com diluidor S (Sexing) e sêmen sexado (nos tempos de zero, três e seis horas após a ejaculação para avaliar se existem alterações de membranas ao longo do tempo). Foram avaliados pela citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e reação acrossomal (PI/FITC-PSA); peroxidação lipídica (C11-BODIPY581/591) e capacitação espermática através de análises da fosforilação da tirosina e aumento da fluidez e desorganização da membrana plasmática (Merocianina 540 e Yo-Pro1). Os efeitos de tratamentos foram avaliados por análises de variância (ANOVA), empregando-se o programa estatístico Stat-View&reg; (SAS Institute, Inc. 1998, Cary, NC, USA). Foram considerados significativos os valores com P<0,05 e com tendência a significância (P<0,10). O sêmen proveniente da subespécie taurina teve um efeito negativo mais significante do que a zebuína na qualidade do sêmen. O sêmen sexado apresentou maior peroxidação lipídica nos espermatozóides com membrana íntegra e a presença de proteínas fosforiladas na superfície da membrana plasmática, fatores que são indicativos de capacitação espermática. Porém, ao contrário do esperado, este aumento não foi acompanhado pela quantidade de células classificadas como capacitadas pela análise de associação de sondas Yo-Pro-1 e Merocianina 540, pois o sêmen convencional apresentou maior população espermática com membrana plasmática íntegra desorganizada (P<0,05). Não houve piora na qualidade do sêmen sexado devido ao tempo de espera do ejaculado (P<0,05). / The objective of this study was to evaluate the morpho-functions alterations in bovine semen submitted on sorting through flow cytometry technology and compare with conventional semen and the difference between the subspecies. Semen was obtained from six bulls, that three were taurine (Holstein Black and White) and three were zebuine (Dairy Gir) with four ejaculates from each animal (n = 24). Five treatments were performed: conventional semen with L (Lagoa) media; conventional semen with S (Sexing) media and sexed semen (zero, three and six hours after ejaculation to evaluate if there were membrane alterations over the time). The treatments were analyzed with flow cytometry as for plasmatic membrane integrity and acrosome reaction (PI/FITC-PSA); lipid peroxidation (C11-BODIPY581/591) and sperm capacitation through protein tyrosine phosphorylation and the increase in plasma membrane fluidity and disorganization (Merocyanine 540 and Yo-Pro-1). The treatments effects were evaluated by analysis of variance (ANOVA) (Stat-View&reg; SAS Institute, Inc. 1998, Cary, NC, USA). Effects were considered significant if the values were P<0.05 and with significant tendency (P<0.10). Semen from the taurine subspecie had a more significant negative effect than zebuine on semen quality. Sexed semen showed more lipid peroxidation in sperm with membrane integrity and the presence of phosphorylated proteins in plasma membrane surface that seemed to be sperm capacitation. However, in the contrary of expected, this increase did not accompany with quantity of cells classified as capacitated by the association probes Yo-Pro-1 e Merocyanine 540 analyse because the conventional semen showed more sperm population with plasma membrane integrity disorganized (P<0.05). There was not worsening in sexed semen quality over the time ejaculate waiting (P<0.05).

O presente estudo visou investigar o efeito da refrigeração do sêmen da jaguatirica sobre o Índice de Motilidade Espermática [IME=(%M+MPx5)/2; %M = proporção de espermatozóides móveis; MP = motilidade progressiva], integridade acrossomal (IA) e capacitação espermática; assim como avaliar a eficácia da técnica FITC-PNA/IP na avaliação simultânea da viabilidade espermática (VE) e IA. Sete jaguatiricas foram eletroejaculadas, sendo utilizados apenas ejaculados (n=16) apresentando %M>=60% e MP>=3. Avaliou-se a IA por meio da Coloração Simples. Os ejaculados foram diluídos 1:1 na Variante do Diluente de PLatz e submetidos aos Protocolos de Transporte: Temperatura Ambiente e Refrigeração, - 0,23ºC/min, (Experimento 1); ou apenas Temperatura Ambiente (Experimentos 2 e 3). Após 2h, as alíquotas foram reaquecidas, reavaliando-se os parâmetros observados antes do transporte. Os espermatozóides foram lavados por centrifugação em meio F10 de Ham, ressuspensos nesse meio e processados conforme o experimento: (1) após pré-incubação (38ºC; 5%CO2) durante 0, 1, 2 e 4 horas, foram retiradas alíquotas a cada intervalo para serem incubadas (30 min) na ausência e na presença do cálcio ionóforo A23187 (Ca2+Ion) (1mM), avaliando-se IA e IME; (2) após pré-incubação por 0, 1 e 2h, foram incubadas alíquotas na ausência e presença de 1 e 2mM de Ca2+Ion, avaliado-se IA e IME; (3) pré-incubados por 9h, sendo retiradas alíquotas a cada hora, para as avaliações da IA e VE, (a) separadamente através da Coloração Simples e do IME, ou (b) simultaneamente através da técnica FITC-PNA/IP. A refrigeração causou declínio (p<0,02) da IA (71,0%) e IME (67,1), em comparação aos valores observados antes do transporte (88,5%; 85,4), enquanto a manutenção das amostras à temperatura ambiente não afetou (p>0,1) essas variáveis (84,8%; 76,4). Dentre as amostras refrigeradas, aquelas expostas ao Ca2+Ion sofreram redução (p<0,01) na IA (52,4%) frente ao controle (55,56%). Já nas amostras transportadas à temperatura ambiente, não foi observada diferença (p>0,1) entre os grupos com e sem ionóforo (64,41% vs. 63,87%). Quando analisados os tempos separadamente, o único tratamento em que houve efeito (p<0,05) do Ca2+Ion sobre a IA foi aquele refrigerado e pré-incubado por 2h. Foi verificada redução (p<0,05) nos valores de IME e IA devida à simples incubação, mesmo na ausência do Ca2+Ion. A concentração de 2µM dessa substância foi mais efetiva na indução da reação acrossômica que 1µM. Apesar dos fluorocromos FITC-PNA/IP terem se ligado aos espermatozóides, nas regiões esperadas, a proporção de células marcadas variou aleatoriamente durante pré-incubação, sem correlação (p>0,1) com IME. A IA avaliada pela Coloração Simples apresentou correlação positiva (r=0,77; p<0,0001) com IME, decrescendo (p<0,0001) durante pré-incubação. A refrigeração mostrou-se desvantajosa frente à manutenção do sêmen à temperatura ambiente, pois foi deletéria à função e às membranas dos espermatozóides. A refrigeração tornou-os capazes de responder ao estímulo do Ca2+Ion, característica observada nos espermatozóides capacitados. O ensaio de reação acrossômica induzida pelo Ca2+Ion deve ser aperfeiçoado para permitir avaliação acurada da capacitação espermática na jaguatirica. A Coloração Simples associada à avaliação do IME foi mais eficiente e menos laboriosa, frente á técnica FITC-PNA/IP, na avaliação da IA e VE. / This study aimed to investigate the effect of ocelot semen refrigeration on Sperm Motility Index [SMI=(%M+PMx5)/2; %M = proportion of motile spermatozoa ; PM = Progressive Motility], acrossomal integrity (AI) and sperm capacitation. Another objective was to evaluate the FITC-PNA/IP technique efficacy on evaluating simultaneously sperm viability (SV) and AI. Five ocelots, were electroejaculated, the semen was evaluated and only ejaculates (n=16) presenting %M>=60% and PM>=3 were used. Sperm AI was evaluated using Fast Green / Rose Bengal staining (FGRB). The ejaculates were diluted 1:1 in Platz Diluent Variant and subjected to the transportation protocols: Room Temperature and Cooling, -0.23ºC/min, (experiment 1); or only Room Temperature (experiments 2 and 3). After 2 hours, the aliquots were rewarmed and samples were taken to re-evaluate the parameters observed before the transport. The spermatozoa were washed in Ham’s F10 medium, ressuspended in fresh medium and processed differently, according the experiment: (1) after pre-incubation (38ºC; 5%CO2) during 0, 1, 2 and 4 hours, samples were taken at each time point to be incubated in the absence and presence of 1mM calcium ionophore A23187 (Ca2+Ion), SMI and AI were evaluated; (2) after pre-incubation during 0, 1 and 2h, aliquots were incubated in the absence and presence of 1 and 2 mM Ca2+Ion; SMI and AI were evaluated; (3) after pre-incubation during 9h, aliquots were taken every hour to compare the evaluation of SV and AI (a) separately by the FGRB staining and SMI or (b) simultaneously by the FITC-PNA / IP technique. Cooling caused decline (p<0.02) on AI (71.0%) and SMI (67.1), when compared to values observed before transportation (88.5%; 85.4). Maintenance at room temperature didn’t affect (p>0.1) these variables (84.8%; 76.4). Among cooled samples, spermatozoa exposed to Ca2+Ion showed smaller (P<0.01) AI value (52.4%) compared to the group incubated without that substance (55.56%). For samples transported at room temperature, it wasn’t observed difference (P>0.05) between the groups with and without ionophore (64.41% vs. 63.87%). When time intervals were analysed separately, the only treatment in which there was effect (p<0,05) of Ca2+Ion on AI was the group refrigerated and pre-incubated for 2h. There was a reduction (p<0,05) on SMI and AI due simply to incubation, even in the absence of Ca2+Ion. The 2µM concentration of this substance was more effective to induce acrosome reaction than 1µM. FITC-PNA and IP fluorocromes bound spermatozoa at the expected sites. However, proportion of marked cells varied randomly during pre-incubation, and didn’t correlate (p>0,1) with SMI. IA evaluated by FGRB staining showed positive correlation (r=0,77; p<0,0001) with SMI, decreasing (p<0,0001) during incubation. Cooling was disadvantageous compared to maintaining semen at room temperature, since it was deleterious to spermatozoa membranes and function, and made those cells capable to answer the Ca2+Ion challenge, a characteristic observed in capacitated spermatozoa. Ca2+Ion induced acrosome reaction assay must be improved to allow accurate evaluation of sperm capacitation on ocelots. FGRB staining associated to SMI evaluation was more efficient and easier to perform, than FITC-PNA/IP technique, for AI and SV investigation.

Orientador: Luis Guillermo Bahamondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T05:07:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hermanny_Alexia_D.pdf: 843759 bytes, checksum: 4b2ff42ff4ef1f995e85e5f8b86bf7f2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O mecanismo de ação do levonorgestrel (LNG) na anticoncepção de emergência (AE) ainda não está totalmente esclarecido e seu efeito nas funções espermáticas também não está explicado. Os objetivos deste trabalho foram avaliar se o LNG, em dose igual à observada após a ingestão oral para AE, poderia afetar espermatozoides expostos in vitro à tuba uterina humana e realizar uma revisão bibliográfica sobre o efeito do LNG nas diferentes funções espermáticas. Foram realizados 15 experimentos. As tubas uterinas foram removidas através de mini-laparotomias e foram perfundidas com uma suspensão contendo 1x106 espermatozoides móveis, com e sem LNG. A tuba correspondente ao lado onde o folículo dominante estava presente recebeu a suspensão com LNG em pacientes alternados. Após um período de incubação de 4 horas, o istmo e a ampola de cada tuba foram separados. Cada segmento foi lavado separadamente e o material obtido foi avaliado quanto ao número de espermatozoides móveis recuperados, número de espermatozoides aderidos ao epitélio tubário e taxa de reação acrossômica (RA). A presença do LNG não afetou significativamente o número de espermatozoides móveis recuperados do istmo e da ampola, e não afetou o número de espermatozoides aderidos ao epitélio tubário. O LNG também não influenciou a taxa de RA. Diferenças significativas também não foram observadas quando o lado ovulatório foi considerado. A revisão bibliográfica realizada deixou evidente que existem poucos estudos que analisam a influência do LNG como AE sobre as funções espermáticas, apesar de este ser um possível mecanismo de ação. Além disso, os estudos revisados utilizam diferentes métodos de avaliação e os resultados são, muitas vezes, contraditórios. De acordo com os resultados observados na literatura, quando o LNG é usado na AE, provavelmente não atinge concentração plasmática suficiente para ser reconhecido pelos receptores de progesterona (P). Resultados positivos só foram observados quando a dose de LNG utilizada nos experimentos foi comparável ao sistema intrauterino liberador de LNG (SIU-LNG), ou seja, muito maior que a utilizada na AE. O LNG, em dose similar à observada no plasma após a ingestão oral para AE, não afetou o número, a aderência ao epitélio tubário, a distribuição e a taxa de RA de espermatozoides na tuba uterina humana, in vitro. De acordo com os resultados observados na literatura, se o LNG, na concentração utilizada para AE, afeta ou não a função espermática ainda não está claro, e mais estudos são necessários / Abstract: The mechanism of action of levonorgestrel (LNG) as emergency contraception (EC) is still under debate and the effect upon sperm function is partially explained. The aim of this study was to assess if LNG in a similar dose to those observed in serum after oral intake for EC could affect the spermatozoa when exposed in vitro to human tubes and also to give an overview of the effect of LNG as EC on several sperm functions. Fifteen mini-laparotomies were performed, the ovulatory side was recorded and both tubes were removed and perfused with a suspension of 1x106 of motile spermatozoa, one with LNG and the other without it. After an incubation period of 4hours the tubes were cut to separate the isthmus and the ampulla. Each segment was flushed and the material was evaluated regarding the motile sperm number, the number of spermatozoa adhering to the oviductal epithelium and acrosome reaction (AR) rate. The addition of LNG did not significantly affect the number of recovered spermatozoa neither at the isthmus nor at the ampulla or the number of recovered spermatozoa adhered at the human tubal epithelium. Additionally, LNG did not influence the rate of AR. There were no significant differences even when the ovulatory side was taken into account. The present review showed that there are few studies which focus on the influence of LNG as EC upon sperm functions; albeit it is a plausible mechanism of action. Additionally, the different studies used different methods of evaluation and the results were in many cases contradictories. According to the results observed at the literature, when LNG is used as EC, it is probable that the drug does not achieved sufficient serum concentrations in order to be recognized by the progesterone (P) receptors. Positive results only were observed when the dose of LNG used in the experiments was much higher (comparable to the LNG-IUS) than the proposed for EC. LNG in a similar dose to that observed in serum after oral intake for EC did not affect the number, the adhesion to tubal epithelium, distribution, and AR rate of spermatozoa at the human Fallopian tubes in vitro. According to the results observed at the literature, if the LNG in doses used for EC, affects sperm function or not, it is still uncertain and warrants further studies / Doutorado / Fisiopatologia Ginecológica / Doutor em Ciências da Saúde

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laila Pereira da Silva Dissertacao.pdf: 2576409 bytes, checksum: d8ddb33c748f481b6487512d8f098802 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The in vitro production (IVP) of bovine embryos despite already used on a commercial scale, presents high variability in the results, that can often be attributed to the fertilization step. Therefore, it is important to research factors related to semen, such as sperm capacitation process. The aim of the study was to evaluate theophylline or its combination with heparin as possible replacement capacitation agent in the development of in vitro produced embryos and in acrosome reaction of sperm cells. The experiment was carried out with 4 bulls and 3 treatments, with 12 experimental groups. Each bull was evaluated in all treatments as described below: Treatment 1 (T1): Heparin - 10mg / ml; Treatment 2 (T2): Theophylline - 5 mM; Treatment 3 (T3): Heparin (10 mg / ml) + theophylline (5mM). The bulls semen was thawed and exposed to incubation in three treatments for 0, 6, 12 and 18h, subsequently stained with Trypan blue / Giemsa and analyzed by electron microscopy for assessment of the acrosome reaction. For IVP of embryos capacitation agents added to fertilization medium were evaluated utilizing the same bulls. In sperm analysis, real acrosome reaction rate was higher (p<0,05) at 0h time while the higher dead spermatozoa rate (p<0,05) was observed at 12 h (84,46 ± 5,82 ) and 18h (86,75 ± 4,19). The IVP embryos rate (37,97 ± 13) and the hatching rate (33,50 ± 14) were higher (p<0,05) in heparin treatment. There was no influence of bull or treatments (p> 0.05) in the acrosome reaction analysis. The use of theophylline as a capacitation agent decreased embryo production rates in IVF, however was as efficient as heparin in acrosome reaction induction. / A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos, apesar de já utilizada em escala comercial, apresenta elevada variabilidade em seus resultados, que pode frequentemente ser atribuída à etapa de fertilização. Sendo assim, torna-se importante o estudo dos fatores relacionados ao sêmen, como o processo de capacitação espermática. O objetivo do estudo foi avaliar a teofilina como agente de capacitação substituto ou associado à heparina no desenvolvimento de embriões produzidos in vitro e sobre a reação acrossômica das células espermáticas. O experimento foi realizado com 4 touros e 3 tratamentos, totalizando 12 grupos experimentais. Cada touro foi avaliado em cada tratamento descrito a seguir: Tratamento 1 (T1): Heparina - 10µg/mL; Tratamento 2 (T2): Teofilina 5 mM; Tratamento 3 (T3): Heparina (10µg/mL) + Teofilina (5mM). O sêmen dos touros foi descongelado e submetido à incubação com os três tratamentos por 0, 6, 12 e 18h, posteriormente corados com Trypan blue/ Giemsa e analisados em microscopia eletrônica para avaliação da reação acrossômica. Para a PIVE os agentes de capacitação adicionados aos meios de fertilização foram testados utilizando os mesmos touros. Na análise espermática a taxa de reação acrossômica verdadeira foi maior (p<0,05) no tempo 0h enquanto para os espermatozoides mortos foi observada maior taxa (p<0,05) nos tempos de 12h (84,46 ± 5,82) e 18h (86,75 ± 4,19). A taxa de embriões produzidos na PIVE (37,97 ± 13) e a taxa de eclosão (33,50 ± 14) foram maiores (p<0,05) para o tratamento heparina. Não houve influência de touro ou de tratamentos (p>0,05) na análise de reação acrossômica. A utilização da teofilina como agente de capacitação reduziu as taxas de produção embrionária na fertilização in vitro, no entanto foi tão eficiente quanto à heparina na indução da reação do acrossoma.