Influenza A viruses (IAVs) cause occasional pandemics and seasonal epidemics, thus presenting continuous challenges to public health. Vaccination is the primary strategy for the prevention and control of influenza outbreaks. The antigenicity matched high-yield seed strain is critical for the success of influenza vaccine. Currently, there are several limitations for the influenza vaccine manufacture: 1) the conventional methods for generating such strains are time consuming; 2) egg-based vaccines, the predominant production platform, have several disadvantages including the emergence of viral antigenic variants that can be induced during egg passage; 3) vaccine seed viruses often do not grow efficiently in mammalian cell lines. Previous studies suggested that mutations in the receptor binding site (RBS) that locates at the globular head of the HA1 can change IAVs’ binding specificity, antigenicity, and yield and thus RBS would be an potential target for engineering vaccine seed strain. However, systematic analysis of the mutations on RBS affecting those viral phenotypes is lacking. Specifically, this dissertation has following aims: Firstly, we developed a novel method to rapidly generate high-yield candidate vaccine strains by integrating error-prone PCR, site-directed mutagenesis strategies, and reverse genetics. The error-prone PCR- based reverse genetic system could also be applied to gain-ofunction studies for influenza virus and other pathogens; Secondly, in this dissertation, we identified an Y161F mutation in the hemagglutinin (HA) that enhanced the infectivity and thermostability of virus without changing its original antigenic properties which would prompted the development of cell-based vaccines; Thirdly, the molecular mechanisms underlying host adaption of equine-origin influenza A(H3N8) virus from horses to dogs are unknown. This dissertation identified that a substitution of W222L in the HA of the equine-origin A(H3N8) virus facilitated its host adaption to dogs. This mutation increased binding avidity of the virus specifically to sialyl Lewis X motifs, which were found abundantly in the submucosal glands of dog trachea but not in equine trachea. To summary, this dissertation investigated the role of RBS in IAVs biology and expanded the current knowledge toward IAV vaccine strain engineering, IAV host adaption and evolution.

Abstract : Activation of the antigen presentation mechanisms by cancer cells is one of the main pathways used by the immune system for tumor detection and suppression. Induction of the expression of molecules of the Major Histocompatibility complex class II (MHC-II) by the interferon- (IFN) is important for the efficient presentation of tumor antigens. Nevertheless, it has been observed that expression of these molecules is supressed in tissular contexts where the concentration of estradiol (E2) is high. In this work we attempted to explain if the down-regulation exerted by estradiol on the expression of the MHC-II molecules in breast cancer cells was mediated by a silencing effect of the estrogen receptor- (ER) through a possible estrogen receptor binding site (ERBS) in the locus of promoter IV (pIV) of the master regulator of MHC-II expression, the class II transactivator (CIITA). The breast cancer cell line MDA-MB-231 (ER-/ERβ-) and its stable transfectants MC2 (ER+) and VC5 (empty vector) were used as model cell lines. Expression of the MCH-II molecules is controlled by CIITA, and stimulation with IFN activates the transcription of the pIV of CIITA. Stimulation of these cell lines with IFN induced expression of the MCH-II molecules and addition of E2 repressed such expression only in the MC2 cell line, as observed by flow cytometry analysis. Six other breast cancer cell lines were tested, with only the MCF7 cell line showing a significant inhibition. Then we analyzed if the inhibition of the MHC-II expression was due to a down-regulation of CIITA. Protein analysis performed by western blot and mRNA quantification by RT-qPCR both revealed down-regulation of CIITA in the cells exposed to IFN+E2 compared to those treated only with IFN. However, reporter gene analysis did not demonstrate any influence of our candidate ERBS in the inhibition of the activation of CIITA-pIV. ChIP-seq analysis of the VC5 and MC2 cell lines for ER also failed to demonstrate any binding of the receptor anywhere in the vicinity of the CIITA locus. However gene ontology and disease ontology analysis of the sequencing data showed a higher activation of tumorigenic cellular pathways in the cells treated with IFN + E2 than in the cells treated only with E2. These results suggest that activation of the inflammatory pathways by IFN could exert a detrimental effect on the cancer development. / Résumé : L’activation des mécanismes de présentation antigénique par les cellules cancéreuses est l’une des voies principales employées par le système immunitaire pour la détection et la suppression des tumeurs. L’induction de l’expression de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH-II) par l’interféron- (IFN) est importante pour la présentation efficace des antigènes tumoraux. Cependant, il a été observé que l’expression de ces molécules est supprimée dans certains tissus dans lesquels la concentration d’estradiol (E2) est élevée. Dans ce travail, nous avons tenté de déterminer si l’inhibition exercée par l’estrogène (E2) sur l'expression des molécules du CMH-II dans des cellules de cancer du sein est médiée par un effet de silençage du récepteur de l’estrogène- (ER) à travers d’un possible site de liaison de récepteur d'estrogène (ERBS) dans le locus du promoteur IV du régulateur clé de l’expression du CMH-II, CIITA. La lignée cancéreuse mammaire cellulaire de cancer de sein MDA-MB-231 (ER-/ERβ-) et ses transfectants stables MC2 (ER+) et VC5 (vecteur vide) ont été utilisés comme des lignées cellulaires modèles. L'expression des molécules du CMH-II est contrôlée par CIITA, et la stimulation avec l’IFN active la transcription du pIV de CIITA. La stimulation de ces lignées cellulaires avec l’IFN induit l'expression des molécules du CMH-II et l'addition d’E2 réprime de cette expression seulement dans la lignée cellulaire MC2, telle qu'elle est observée par analyse de cytométrie de flux. Six autres lignées de cancer de sein ont été testées et seulement la lignée cellulaire MCF7 montrait une inhibition significative. Ensuite, nous avons analysé si l'inhibition de l'expression du CMH-II était due à une régulation de CIITA. L'analyse des protéines effectuée par Western blot et la quantification de l'ARNm par RT-qPCR quantitative ont révélé une inhibition de CIITA dans les cellules exposées à l’IFN + E2 par rapport à celles traitées seulement avec l’IFN. Cependant, des analyses avec un gène rapporteur n'ont pas démontré une influence quelconque de notre site de liaison de récepteur d'estrogène candidat dans l'inhibition de l'activation de CIITA-pIV. Des analyses de ChIP-seq dans les lignées cellulaires MC2 et VC5 pour l’ER n’ont également pas démontré la présence d’une liaison du récepteur dans le voisinage du locus de CIITA. Cependant, des analyses sur l'ontologie des gènes et des maladies sur les données de séquençage ont montré une activation accrue des voies cellulaires cancéreuses dans les cellules traitées avec IFN + E2 comparé avec les cellules traitées uniquement avec E2. Ces résultats suggèrent que l'activation des voies inflammatoires par l’IFN pourrait exercer un effet plus négatif qu’anticipé sur le développement du cancer. [Symboles non conformes]