Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Abstract : Activation of the antigen presentation mechanisms by cancer cells is one of the main pathways used by the immune system for tumor detection and suppression. Induction of the expression of molecules of the Major Histocompatibility complex class II (MHC-II) by the interferon- (IFN) is important for the efficient presentation of tumor antigens. Nevertheless, it has been observed that expression of these molecules is supressed in tissular contexts where the concentration of estradiol (E2) is high. In this work we attempted to explain if the down-regulation exerted by estradiol on the expression of the MHC-II molecules in breast cancer cells was mediated by a silencing effect of the estrogen receptor- (ER) through a possible estrogen receptor binding site (ERBS) in the locus of promoter IV (pIV) of the master regulator of MHC-II expression, the class II transactivator (CIITA). The breast cancer cell line MDA-MB-231 (ER-/ERβ-) and its stable transfectants MC2 (ER+) and VC5 (empty vector) were used as model cell lines. Expression of the MCH-II molecules is controlled by CIITA, and stimulation with IFN activates the transcription of the pIV of CIITA. Stimulation of these cell lines with IFN induced expression of the MCH-II molecules and addition of E2 repressed such expression only in the MC2 cell line, as observed by flow cytometry analysis. Six other breast cancer cell lines were tested, with only the MCF7 cell line showing a significant inhibition. Then we analyzed if the inhibition of the MHC-II expression was due to a down-regulation of CIITA. Protein analysis performed by western blot and mRNA quantification by RT-qPCR both revealed down-regulation of CIITA in the cells exposed to IFN+E2 compared to those treated only with IFN. However, reporter gene analysis did not demonstrate any influence of our candidate ERBS in the inhibition of the activation of CIITA-pIV. ChIP-seq analysis of the VC5 and MC2 cell lines for ER also failed to demonstrate any binding of the receptor anywhere in the vicinity of the CIITA locus. However gene ontology and disease ontology analysis of the sequencing data showed a higher activation of tumorigenic cellular pathways in the cells treated with IFN + E2 than in the cells treated only with E2. These results suggest that activation of the inflammatory pathways by IFN could exert a detrimental effect on the cancer development. / Résumé : L’activation des mécanismes de présentation antigénique par les cellules cancéreuses est l’une des voies principales employées par le système immunitaire pour la détection et la suppression des tumeurs. L’induction de l’expression de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH-II) par l’interféron- (IFN) est importante pour la présentation efficace des antigènes tumoraux. Cependant, il a été observé que l’expression de ces molécules est supprimée dans certains tissus dans lesquels la concentration d’estradiol (E2) est élevée. Dans ce travail, nous avons tenté de déterminer si l’inhibition exercée par l’estrogène (E2) sur l'expression des molécules du CMH-II dans des cellules de cancer du sein est médiée par un effet de silençage du récepteur de l’estrogène- (ER) à travers d’un possible site de liaison de récepteur d'estrogène (ERBS) dans le locus du promoteur IV du régulateur clé de l’expression du CMH-II, CIITA. La lignée cancéreuse mammaire cellulaire de cancer de sein MDA-MB-231 (ER-/ERβ-) et ses transfectants stables MC2 (ER+) et VC5 (vecteur vide) ont été utilisés comme des lignées cellulaires modèles. L'expression des molécules du CMH-II est contrôlée par CIITA, et la stimulation avec l’IFN active la transcription du pIV de CIITA. La stimulation de ces lignées cellulaires avec l’IFN induit l'expression des molécules du CMH-II et l'addition d’E2 réprime de cette expression seulement dans la lignée cellulaire MC2, telle qu'elle est observée par analyse de cytométrie de flux. Six autres lignées de cancer de sein ont été testées et seulement la lignée cellulaire MCF7 montrait une inhibition significative. Ensuite, nous avons analysé si l'inhibition de l'expression du CMH-II était due à une régulation de CIITA. L'analyse des protéines effectuée par Western blot et la quantification de l'ARNm par RT-qPCR quantitative ont révélé une inhibition de CIITA dans les cellules exposées à l’IFN + E2 par rapport à celles traitées seulement avec l’IFN. Cependant, des analyses avec un gène rapporteur n'ont pas démontré une influence quelconque de notre site de liaison de récepteur d'estrogène candidat dans l'inhibition de l'activation de CIITA-pIV. Des analyses de ChIP-seq dans les lignées cellulaires MC2 et VC5 pour l’ER n’ont également pas démontré la présence d’une liaison du récepteur dans le voisinage du locus de CIITA. Cependant, des analyses sur l'ontologie des gènes et des maladies sur les données de séquençage ont montré une activation accrue des voies cellulaires cancéreuses dans les cellules traitées avec IFN + E2 comparé avec les cellules traitées uniquement avec E2. Ces résultats suggèrent que l'activation des voies inflammatoires par l’IFN pourrait exercer un effet plus négatif qu’anticipé sur le développement du cancer. [Symboles non conformes]

De nombreuses études ont contribué à dévoiler les mécanismes à la base de l’athérosclérose. Cette maladie est médiée par un important déséquilibre homéostatique, qui entraine une inflammation vasculaire contribuant à sa progression. Plusieurs équipes de recherche ont axé leurs investigations sur l’étude d’importants biomarqueurs inflammatoires telle que la protéine C-réactive (CRP). Considérée comme facteur de risque de maladies cardiovasculaires, cette dernière participe aussi aux différents stades du développement de l’athérosclérose. Notre étude révèle pour la toute première fois un processus d’auto-induction de l’expression de la CRP régit par les CE vasculaires. Ce mécanisme représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour la prévention de l’athérosclérose. L’estrogène (E2) est une hormone féminine qui possède un rôle athéroprotecteur via entre autres, la modulation de la réponse inflammatoire. Ainsi, nous avons cherché à déterminer si elle avait un effet bénéfique sur le profil athérogénique de la CRP exprimée par les cellules endothéliales (CE). En effet, nos travaux ont démontré que l’E2 a la capacité de moduler le rétrocontrôle positif de l’expression de la CRP, contribuant à diminuer également le profil inflammatoire de cette dernière. De plus, nous avons établi que l’E2 restitue une importante voie pro-angiogénique impliquant la réponse migratoire des CE au VEGF, en contrant l’effet d’inhibition de la CRP. Cette nouvelle découverte nous a permis d’éclaircir un important mécanisme de guérison vasculaire de cette hormone dans un contexte inflammatoire. Ainsi, ces données contribuent à mieux comprendre la production endogène de la CRP par les CE vasculaires et l’activité cardioprotectrice de l’E2. / Numerous studies have contributed to reveal the mechanisms underlying cardiovascular diseases such as atherosclerosis. This disease is mediated by an important homeostatic imbalance, which causes vascular inflammation contributing to its progression. Several research groups have focused their studies on inflammatory biomarkers such as C-reactive protein (CRP). Considered as a risk factor for cardiovascular diseases, it also participates in various stages of atherosclerosis development. Our study shows for the first time a process of self-induction of the CRP expression regulated by vascular EC. This mechanism represents a new potential therapeutic target for the prevention of atherosclerosis formation. Estrogen (E2) is a female hormone which has an atheroprotective role through various vascular regulation mechanisms including modulation of the inflammatory response. Thus, we sought to determine whether it had a beneficial effect on atherogenic profile of CRP expressed by endothelial cells (EC). Indeed, our work has demonstrated for the first time that E2 has the ability to modulate the CRP expression positive feedback identified in our study, which also helps to reduce the inflammatory profile of the latter. In addition, we determined that E2 restores an important proangiogenic response involving migration of vascular EC to VEGF, by countering the inhibition effect of CRP. This new discovery has enabled us to clarify an important vascular healing mechanism of this hormone in an inflammatory context. Thus, these data provide further advances that contribute to a better understanding of the endogenous CRP production by vascular EC and the cardioprotective activity of E2.

Les récepteurs nucléaires (RN) sont des facteurs de transcription ligand dépendants qui contrôlent une grande variété de processus biologiques de la physiologie humaine, ce qui a fait d'eux des cibles pharmacologiques privilégiées pour de nombreuses maladies. L'un de ces récepteurs, le récepteur de l’œstrogène alpha (ERα), peut activer la prolifération cellulaire dans certaines sections de l'épithélium mammaire tandis qu’un autre, le récepteur de l'acide rétinoïque alpha (RARα), peut provoquer un arrêt de la croissance et la différenciation cellulaire. La signalisation de ces deux récepteurs peut être altérée dans le cancer du sein, contribuant à la tumorigénèse mammaire. L’activité d’ERα peut être bloquée par les anti-oestrogènes (AE) pour inhiber la prolifération des cellules tumorales mammaires. Par contre, l’activation des voies de RARα avec des rétinoïdes dans un contexte clinique a rencontré peu de succès. Ceci pourrait résulter du manque de spécificité des ligands testés pour RARα et/ou de leur activité seulement dans certains sous-types de tumeurs mammaires. Puisque les récepteurs nucléaires forment des homo- et hétéro-dimères, nous avons cherché à développer de nouveaux essais pharmacologiques pour étudier l'activité de complexes dimériques spécifiques, leur dynamique d’association et la structure quaternaire des récepteurs des œstrogènes. Nous décrivons ici une nouvelle technique FRET, surnommée BRET avec renforcement de fluorescence par transferts combinés (BRETFect), qui permet de détecter la formation de complexes de récepteurs nucléaires ternaires. Le BRETFect peut suivre l'activation des hétérodimères ERα-ERβ et met en évidence un mécanisme allostérique d'activation que chaque récepteur exerce sur son partenaire de dimérisation. L'utilisation de BRETFect en combinaison avec le PCA nous a permis d'observer la formation de multimères d’ERα fonctionnels dans des cellules vivantes pour la première fois. La formation de multimères est favorisée par les AE induisant la dégradation du récepteur des oestrogènes, ce qui pourrait contribuer à leurs propriétés spécifiques. Ces essais de BRET apportent une nette amélioration par rapport aux tests de vecteurs rapporteur luciférase classique, en fournissant des informations spécifiques aux récepteurs en temps réel sans aucune interférence par d'autres processus tels que la transcription et de la traduction. L'utilisation de ces tests nous a permis de caractériser les propriétés de modulation de l’activité des récepteurs nucléaires d’une nouvelle classe de molécules hybrides qui peuvent à la fois lier ERa ou RAR et inhiber les HDACs, conduisant au développement de nouvelles molécules prometteuses bifonctionnelles telles que la molécule hybride RAR-agoniste/HDACi TTNN-HA. / Nuclear receptors (NRs) are ligand-dependent transcription factors that control a wide variety of biological processes in human physiology, which has made them preferred pharmacological targets for many diseases. One such receptor, the estrogen receptor alpha (ERα), can activate cell proliferation in some sections of the mammary epithelium while another, the retinoic acid receptor alpha (RARα), can cause growth arrest and cellular differentiation. Signalling by these receptors can be altered in breast cancer, contributing to tumorigenesis. ERα can be blocked by antiestrogens (AEs) in the clinical setting to inhibit tumor cell proliferation. However, attempts to activate the RARα pathway with retinoids have not proven beneficial in clinical trials. This may result from the lack of specificity of the tested ligands for RARa and/or from their activity only in a subset of breast tumors. Since nuclear receptors form homo- and heterodimers, we sought to develop novel pharmacological assays to study the activity of specific receptor-dimer complexes, their dynamics and quaternary structure. We report here a new FRET technique dubbed BRET with fluorescence enhanced by combined transfers (BRETFect) that can detect the formation of ternary nuclear receptor complexes. BRETFect can monitor the activation of ERα-ERβ heterodimers and highlights an allosteric mechanism of activation that each receptor exerts on its dimer partner. Use of BRETFect in combination with PCA-BRET has allowed us to observe the formation of functional ERα multimers in live cells for the first time. The formation of multimers is favored by AEs which induce receptor degradation, and may underlie their specific properties. These assays are a net improvement over the classical luciferase-reporter experiment as they deliver real-time receptor specific information with no interference by other process such as transcription and translation. Using these BRET assays we developed a new class of NR hybrid ligands that can modulate ER or RAR activity and inhibit HDACs. This has allowed for the development of promising new bifunctional molecules such as the RAR-agonist/HDACi hybrid molecule TTNN-HA. In conclusion, the work presented here brings new insight in NR dynamics and quaternary structure and offers novel tools to study their mechanism of action or design new modulators of NR activity such as hybrid AE-HDACis and Retinoid-HDACis.

De nombreuses études ont contribué à dévoiler les mécanismes à la base de l’athérosclérose. Cette maladie est médiée par un important déséquilibre homéostatique, qui entraine une inflammation vasculaire contribuant à sa progression. Plusieurs équipes de recherche ont axé leurs investigations sur l’étude d’importants biomarqueurs inflammatoires telle que la protéine C-réactive (CRP). Considérée comme facteur de risque de maladies cardiovasculaires, cette dernière participe aussi aux différents stades du développement de l’athérosclérose. Notre étude révèle pour la toute première fois un processus d’auto-induction de l’expression de la CRP régit par les CE vasculaires. Ce mécanisme représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour la prévention de l’athérosclérose. L’estrogène (E2) est une hormone féminine qui possède un rôle athéroprotecteur via entre autres, la modulation de la réponse inflammatoire. Ainsi, nous avons cherché à déterminer si elle avait un effet bénéfique sur le profil athérogénique de la CRP exprimée par les cellules endothéliales (CE). En effet, nos travaux ont démontré que l’E2 a la capacité de moduler le rétrocontrôle positif de l’expression de la CRP, contribuant à diminuer également le profil inflammatoire de cette dernière. De plus, nous avons établi que l’E2 restitue une importante voie pro-angiogénique impliquant la réponse migratoire des CE au VEGF, en contrant l’effet d’inhibition de la CRP. Cette nouvelle découverte nous a permis d’éclaircir un important mécanisme de guérison vasculaire de cette hormone dans un contexte inflammatoire. Ainsi, ces données contribuent à mieux comprendre la production endogène de la CRP par les CE vasculaires et l’activité cardioprotectrice de l’E2. / Numerous studies have contributed to reveal the mechanisms underlying cardiovascular diseases such as atherosclerosis. This disease is mediated by an important homeostatic imbalance, which causes vascular inflammation contributing to its progression. Several research groups have focused their studies on inflammatory biomarkers such as C-reactive protein (CRP). Considered as a risk factor for cardiovascular diseases, it also participates in various stages of atherosclerosis development. Our study shows for the first time a process of self-induction of the CRP expression regulated by vascular EC. This mechanism represents a new potential therapeutic target for the prevention of atherosclerosis formation. Estrogen (E2) is a female hormone which has an atheroprotective role through various vascular regulation mechanisms including modulation of the inflammatory response. Thus, we sought to determine whether it had a beneficial effect on atherogenic profile of CRP expressed by endothelial cells (EC). Indeed, our work has demonstrated for the first time that E2 has the ability to modulate the CRP expression positive feedback identified in our study, which also helps to reduce the inflammatory profile of the latter. In addition, we determined that E2 restores an important proangiogenic response involving migration of vascular EC to VEGF, by countering the inhibition effect of CRP. This new discovery has enabled us to clarify an important vascular healing mechanism of this hormone in an inflammatory context. Thus, these data provide further advances that contribute to a better understanding of the endogenous CRP production by vascular EC and the cardioprotective activity of E2.

Les estrogènes sont impliqués dans plusieurs aspects de la physiologie humaine en particulier, le développement, la croissance, la différenciation des tissus reproducteurs, la reproduction, et la grossesse. Les effets cellulaires des estrogènes sont transmis via l'interaction avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. L’activation de ERα et ERβ contrôle directement la transcription des gènes cibles nécessaires pour médier les effets physiologiques des estrogènes. L’effet des estrogènes peut aussi être mitogénique et devient la cause de plusieurs pathologies surtout dans les tissus qui présentent une sensibilité accrue à l’hormone tel que les tissus mammaires, les ovaires et l’utérus. De ce fait, une surexposition de ces tissus à l’estrogène augmente le risque de développer le cancer. Dans une lignée cellulaire qui coexprime les deux récepteurs, nous avons identifié la chimiokine SDF-1 qui interagit avec le récepteur CXCR4 et qui décrit une boucle de régulation autocrine/paracrine entre la voie des chimiokines et celle des estrogènes. Cette régulation induit une augmentation de l’expression des gènes cibles prolifératifs du cancer du sein. Cependant, les mécanismes exacts de cette régulation restent inconnus. Afin d'identifier les cibles exactes de cette régulation au niveau génomique, nous avons développé un modèle cellulaire pour discriminer le rôle respectif de ERα et ERβ au niveau du contrôle transcriptionnel de cette boucle de régulation des chimiokines. En partant d’une lignée cellulaire ER-, nous avons généré un système cellulaire qui exprime l’un ou l’autre des isoformes en plus du mutant ERβ-S87A. Nous avons construit le promoteur CXCR4bLuc qu’on a testé dans les lignées cellulaires générées. En utilisant la construction du promoteur CXCR4bLuc, nous avons démontré une voie de régulation des récepteurs des chimiokines par les récepteurs des estrogènes. L’activation membranaire de CXCR4 par SDF-1 implique l’activation directe du récepteur de l’estrogène ERβ par phosphorylation de la sérine 87. Cette phosphorylation active ERβ et favorise l’expression du gène de CXCR4. La transcription de CXCR4 passe par la liaison de ERβ au niveau d’un élément de liaison ERE que nous avons identifié dans ce travail par la technique de ChIP. Ainsi, nous avons identifié une cible exacte de la régulation des récepteurs des chimiokines CXCR4 par le récepteur des estrogènes ERβ qui peut constituer une approche prometteuse pour contrer les pathologies associées au cancer du sein et ses métastases. / Estrogens are involved in development, growth, differentiation, reproduction, and pregnancy. The cellular effects of estrogens are mediated through its interaction with estrogen receptors ERα and ERβ. The ERα and ERβ activation controls directly the transcription of target genes required to mediate the physiological effects of estrogen. The effect of estrogen may be mitogenic and becomes the cause of many diseases especially in tissues that have greater sensitivity to the hormone such as breast tissue, ovaries and uterus. Therefore, overexposure of these tissues to estrogen increases the risk of developing cancer. In a cell line that co-expresses both receptors, we identified the chemokine SDF-1 that interacts with the CXCR4 receptor and describes an autocrine / paracrine loop pathway between chemokines and estrogen. This control leads to an increase of the expression of proliferatives target genes in breast cancer. However, the exact mechanisms of this regulation remain unknown. To identify the exact target of this regulation at the genomic level, we have developed a cellular model to discriminate the respective role of ERα and ERβ level of transcriptional control of the loop chemokines. Starting from an ER- cell line, we generated a cell system that expresses one or other of isoforms in addition to the mutant ERβ-S87A. We built the promoter CXCR4bLuc that we have tested in the generated cell lines. Using the CXCR4bLuc promoter construct, we have demonstrated a regulatory pathway of chemokine receptors by estrogen receptors. The membrane activation of CXCR4 by SDF-1 involves the direct activation of estrogen receptor ERβ by phosphorylation of serine 87. This phosphorylation leads to activate ERβ and promotes the expression of CXCR4 gene. The transcription of CXCR4 involves the binding of ERβ at an ERE binding element that we have identified in this work by the ChIP technical. Thus the identification of a precise ERE target regulation of chemokine receptors CXCR4 by estrogen receptor ERβ, is a promising approach to counter the pathologies associated with breast cancer and its metastases.

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