Dentre os inúmeros fatores para o sucesso dos programas de TE, as receptoras merecem grande destaque por serem fator determinante no sucesso desta biotecnologia. Atualmente, os produtos de liberação de progesterona disponíveis no mercado brasileiro são importados e confeccionados a base de nylon e silicone. O silicone é uma matriz biocompatível, mas não biodegradável, contrariamente aos novos dispositivos que utilizam biopolímeros obtidos a partir da fermentação bacteriana da cana-de-açúcar. O presente experimento tem como objetivo estudar a eficiência do novo dispositivo intravaginal de liberação sustentada de progesterona no programa de TETF, em novilhas e vacas cruzadas, pela avaliação das taxas de aproveitamento, concepção e de prenhez. O experimento foi realizado em parceria com a empresa de Embryo-sys®, a qual foi responsável por realizar a sincronização das receptoras, assim como das inovulações. As sincronizações e as inovulações foram realizadas em três propriedades nos municípios de Paranapanema-SP, Itapetininga-SP e Ouro Fino-MG. Todos os animais foram submetidos a rigoroso manejo sanitário e ginecológico, e mantidos a pasto (Brachiaria decumbens) com suplementação mineral e água ad libitum. As receptoras (n = 205) foram agrupadas equitativamente quanto ao escore de condição corporal, condição ovariana, categoria animal e período pós-parto, em dois grupos: Grupo Controle - dispositivo auricular (Crestar®, Intervet, Holanda) contendo 3mg de norgestomet (n=103) e Grupo Tratado - implante intravaginal (Progestar®, Innovare, Brasil) contendo 1,72g de progesterona (n=102). No início da sincronização ambos os grupos foram tratados com 2mg de benzoato de estradiol (BE, Innovare, Brasil) intramuscular (IM). Os dispositivos permaneceram nos animais por oito dias, e no momento da retirada foram administradas 400UI de eCG (Novormon®, Syntex, Argentina) IM e 530&mu;g cloprostenol sódico (Sincrocio®,Ouro Fino, Brasil) IM. Após 24 horas da retirada, foi aplicado 1mg de BE IM, como indutor de ovulação. Analisando as novilhas (n=77), vacas solteiras (n=69) e paridas (n=59), obtiveram-se os seguintes resultados, respectivamente para os grupos controle e tratamento: taxa de aproveitamento (TA) 72,8% (n=103) vs 83,3% (n=102), de concepção (TC) 47,9% (n=73) vs 42,7% (n=82) e de prenhez (TP) 34,7% (n=101) vs 35,0% (n=100). Em analise posterior, as vacas paridas foram divididas em duas classes de período pós-parto: PP1 de 2 a 4 meses (n=35) e PP2 de 4 a 8 meses (n=24). Houve efeito da interação entre PP e condição ovariana (CO) para a variável TA, obtendo no PP2, os valores, significativamente diferentes (P<0,05), foram de 83,3% para as que estavam ciclando e 50% para as que não estavam ciclando. Também houve efeito de período pós-parto para TC e os valores de PP1 foi de 48,5% e no PP2 foi de 35,3% (P<0,05). Assim como para TC, houve efeito de PP para TP: vacas no PP1 tiveram 45,7% de prenhez, enquanto as que estavam no PP2, 26,4% (P<0,05). Concluiu-se que o novo dispositivo à base de biopolímeros Progestar® foi capaz de proporcionar taxas de ovulação, de concepção e de prenhez nas inovulações em programas TETF, em novilhas e vacas cruzadas, tanto quanto dispositivos confeccionados com silicone que liberam progestágenos (Crestar®). / There are many factors for the successful of ET programs, and the recipients are the major factor on this biotechnique. Nowadays, the products available in the brazilian market for releasing progesterone are imported and made of silicone, a biocompatible polymer, but not biodegradable. Recently, intravaginal progesterone devices made of PHB, a biodegradable polymer made from bacteria fermentation of sugar cane, have been studied. The objective of this present study was to compare the efficiency in ET programs of a new intravaginal device on ovulation, conception and pregnancy rate, in croosbreed heifers and cows, with a device made of silicone Crestar®, currently available in the brazilian market. The experiment was done with help of Embryo-sys® Company, which was responsible for the recipient\'s synchronizations and inovulations. The synchronizations and inovulations were done in three different places: Paranapanema-SP, Itapetininga-SP and Ouro Fino-MG. All the animals were kept in pasture of Brachiaria decumbens with mineral supplementation and ad libitum water. The body and ovary condition score, postpartum period and animal category were utilized for equal division of recipients (n=205), in two groups: control - auricular device (Crestar®) with 3mg of norgestomet (n=103) and treatment - intravaginal device (Progestar®) with 1.72g of progesterone (n=102). On day 0, all the animals received 2mg of estradiol benzoate (IM). On day 8, the devices were removed, 400UI of eCG and 500&mu;g of PGF2&alpha; were injected (IM). After 24 hours, was injected 1mg of estradiol benzoate (IM), as ovulation inductor. The animals had the following results, respectively for control and treatment group: ovulation rate (OR) - 72.8% (n=103) vs 83.3% (n=102), conception rate (CR) - 47.9% (n=73) vs 42.7% (n=82) and pregnancy rate (PR) - 34.7% (n=101) vs 35.0% (n=100). In further analysis, postpartum cows were divided in two classes: PP1 (2 - 4 months, n=35) and PP2 (4 - 8 months, n=24). There was an interaction between PP and ovary condition (OC) on OR, in which animals in PP2 and cyclic showed better results (83.3%) than the animals not cyclic (50%). There was effect of PP on CR, and the values for PP1 and PP2 were 48.5% and 35.5%, respectively. There was also effect of PP on PR: cows in PP1 showed 45.7% of PR, while cows in PP2, 26.4%. This experiment showed that the new intravaginal device (Progestar®) had the same efficiency on ovulation, conception and pregnancy rate, in ET programs, in crossbreed heifers and cows, as the commercially available device Crestar®.

Este trabalho foi conduzido com a finalidade de se verificar a influência da receptora e do embrião sobre o índice de prenhez (IP) e proporção de sexo. Um total de 431 embriões produzidos in vitro foram transferidos não cirurgicamente para o corno uterino de receptoras mestiças, previamente sincronizadas, de acordo com o desenvolvimento embrionário e grau de qualidade do embriâo. O primeiro exame de diagnóstico de prenhez (DP) foi realizado aos 26-28 dias da transferência e o segundo, aos 50-52 dias, quando foram também realizadas as avaliações das receptoras e a determinação do sexo dos fetos através da ultra-sonografia. O índice de prenhez foi de 38,0% (164/431) para o primeiro DP e 92,1% (151/164) das receptoras permaneceram prenhes aos 50-52 dias, evidenciando 7,9% (13/164) de perdas embrionárias e/ou fetais entre os exames. Maiores índices de prenhez (P<0,05) foram obtidos para embriões classificados como de grau 1 (86,5%) e desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto expandido (Bx; 40,1%). A avaliação das receptoras revelou maior ocorrência de corpos lúteos (CL) no ovário direito (65,1% vs. 34,9%), contudo, sem influenciar no IP, com 92,8% e 88,5% de prenhez, respectivamente, para CL no ovário direito e esquerdo. O tipo de CL (grau 1, 2 ou 3) afetou o IP, com o Cl de grau 1 (53,8%) produzindo mais animais prenhes (P<0,05) do que os demais. A presença de folículo em um ou ambos ovários, não influenciou (P>0,05) o IP, a despeito de sua ocorrência no lado direito (90,6%) ou esquerdo (92,0%). Mais (P<0,05) fetos macho (66,67%) do que fêmea (33,33%) foram obtidos a partir de embriões transferidos ao estágio de blastocisto inicial. Contudo, considerando os estágios de mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido, não houve diferença significativa (P>0,05) entre a proporção de fetos diagnosticados como sendo macho ou fêmea. Os diâmetros dos corpos lúteos, respectivamente, de 1,83, 1,88, 1,81 e 1,85cm, para receptoras com pelagem clara, malhada, marrom e preta, não influenciaram (P>0,05) os índices de prenhez, o mesmo acontecendo com relação ao tamanho do folículo, o qual variou de 0,50 a 1,6 cm de diâmetro. Baseado nos resultados obtidos, podemos concluir que tanto a receptora quanto o embrião influenciaram os índices de prenhez, sendo que o estágio do embrião também afetou a proporção de sexo dos fetos. / This study was carried out to verify the influence of the recipient and embryo on pregnancy rate (PR) and proportion of sex. A total of 431 in vitro- produced embryos were non-surgically transferred to the uterine horns from crossbred recipients previously synchronized, according to the embryo development stage and quality grade. The first exam for pregnancy was performed between 26th-28th day of embryo transfer following a second exam between 50th-52th day, when recipient evaluation and fetal sex determination were performed by ultrasonography. The pregnancy rate was 38,0% (164/431) for the first exam and 92,1% (151/164) of the recipients were kept pregnants on day 50-52, leading a 7,9% (12/164) of embryonic and/or fetal loss between the exams. Higher pregnancy rate (P<0,05) were obtained for embryo graded as 1 (86,5%) and embryo development at expanded blastocyst stage (EB;40,1%). The recipients evaluation showed more corpora lutea (CL) in the right ovary (65,1% vs.34,9%); however, it did not influence PR, with 92,8% and 88,5% of pregnancies, respectively, to CL in the right or left ovary. The type of CL affected the PR, with CL graded as 1 (53,8%) producing more pregnancies (P<0,05) than the others. The presence of a follicle in one or both ovaries did not influence (P>0,05) the PR, in despite of its presence in the right side (90,6%) or in the left side (92,0%). More (P< 0,05) male fetus (66,67%) than female ones (33,33%) were obtained from transferred embryos to the early blastocyst stage. However, considering the early blastocyst, blastocyst and expanded blastocyst stages, no difference (P>0,05) between the proportion of sex fetus was found. The CL diameters, respectively, from 1,83, 1,88, 1,81 and 1,85 cm for light-hair, threshed, brown and black recipients, did not affect (P>0,05) the PR, and the same happend in relation to the size of the follicle, which varied from 0,50 to 1,6 cm in diameter. These results suggest that the recipient and the embryo can influence the pregnancy rate and embryo development stage also affect the proportion of sex.

Este trabalho foi conduzido com a finalidade de se verificar a influência da receptora e do embrião sobre o índice de prenhez (IP) e proporção de sexo. Um total de 431 embriões produzidos in vitro foram transferidos não cirurgicamente para o corno uterino de receptoras mestiças, previamente sincronizadas, de acordo com o desenvolvimento embrionário e grau de qualidade do embriâo. O primeiro exame de diagnóstico de prenhez (DP) foi realizado aos 26-28 dias da transferência e o segundo, aos 50-52 dias, quando foram também realizadas as avaliações das receptoras e a determinação do sexo dos fetos através da ultra-sonografia. O índice de prenhez foi de 38,0% (164/431) para o primeiro DP e 92,1% (151/164) das receptoras permaneceram prenhes aos 50-52 dias, evidenciando 7,9% (13/164) de perdas embrionárias e/ou fetais entre os exames. Maiores índices de prenhez (P<0,05) foram obtidos para embriões classificados como de grau 1 (86,5%) e desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto expandido (Bx; 40,1%). A avaliação das receptoras revelou maior ocorrência de corpos lúteos (CL) no ovário direito (65,1% vs. 34,9%), contudo, sem influenciar no IP, com 92,8% e 88,5% de prenhez, respectivamente, para CL no ovário direito e esquerdo. O tipo de CL (grau 1, 2 ou 3) afetou o IP, com o Cl de grau 1 (53,8%) produzindo mais animais prenhes (P<0,05) do que os demais. A presença de folículo em um ou ambos ovários, não influenciou (P>0,05) o IP, a despeito de sua ocorrência no lado direito (90,6%) ou esquerdo (92,0%). Mais (P<0,05) fetos macho (66,67%) do que fêmea (33,33%) foram obtidos a partir de embriões transferidos ao estágio de blastocisto inicial. Contudo, considerando os estágios de mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido, não houve diferença significativa (P>0,05) entre a proporção de fetos diagnosticados como sendo macho ou fêmea. Os diâmetros dos corpos lúteos, respectivamente, de 1,83, 1,88, 1,81 e 1,85cm, para receptoras com pelagem clara, malhada, marrom e preta, não influenciaram (P>0,05) os índices de prenhez, o mesmo acontecendo com relação ao tamanho do folículo, o qual variou de 0,50 a 1,6 cm de diâmetro. Baseado nos resultados obtidos, podemos concluir que tanto a receptora quanto o embrião influenciaram os índices de prenhez, sendo que o estágio do embrião também afetou a proporção de sexo dos fetos. / This study was carried out to verify the influence of the recipient and embryo on pregnancy rate (PR) and proportion of sex. A total of 431 in vitro- produced embryos were non-surgically transferred to the uterine horns from crossbred recipients previously synchronized, according to the embryo development stage and quality grade. The first exam for pregnancy was performed between 26th-28th day of embryo transfer following a second exam between 50th-52th day, when recipient evaluation and fetal sex determination were performed by ultrasonography. The pregnancy rate was 38,0% (164/431) for the first exam and 92,1% (151/164) of the recipients were kept pregnants on day 50-52, leading a 7,9% (12/164) of embryonic and/or fetal loss between the exams. Higher pregnancy rate (P<0,05) were obtained for embryo graded as 1 (86,5%) and embryo development at expanded blastocyst stage (EB;40,1%). The recipients evaluation showed more corpora lutea (CL) in the right ovary (65,1% vs.34,9%); however, it did not influence PR, with 92,8% and 88,5% of pregnancies, respectively, to CL in the right or left ovary. The type of CL affected the PR, with CL graded as 1 (53,8%) producing more pregnancies (P<0,05) than the others. The presence of a follicle in one or both ovaries did not influence (P>0,05) the PR, in despite of its presence in the right side (90,6%) or in the left side (92,0%). More (P< 0,05) male fetus (66,67%) than female ones (33,33%) were obtained from transferred embryos to the early blastocyst stage. However, considering the early blastocyst, blastocyst and expanded blastocyst stages, no difference (P>0,05) between the proportion of sex fetus was found. The CL diameters, respectively, from 1,83, 1,88, 1,81 and 1,85 cm for light-hair, threshed, brown and black recipients, did not affect (P>0,05) the PR, and the same happend in relation to the size of the follicle, which varied from 0,50 to 1,6 cm in diameter. These results suggest that the recipient and the embryo can influence the pregnancy rate and embryo development stage also affect the proportion of sex.

Dentre os inúmeros fatores para o sucesso dos programas de TE, as receptoras merecem grande destaque por serem fator determinante no sucesso desta biotecnologia. Atualmente, os produtos de liberação de progesterona disponíveis no mercado brasileiro são importados e confeccionados a base de nylon e silicone. O silicone é uma matriz biocompatível, mas não biodegradável, contrariamente aos novos dispositivos que utilizam biopolímeros obtidos a partir da fermentação bacteriana da cana-de-açúcar. O presente experimento tem como objetivo estudar a eficiência do novo dispositivo intravaginal de liberação sustentada de progesterona no programa de TETF, em novilhas e vacas cruzadas, pela avaliação das taxas de aproveitamento, concepção e de prenhez. O experimento foi realizado em parceria com a empresa de Embryo-sys®, a qual foi responsável por realizar a sincronização das receptoras, assim como das inovulações. As sincronizações e as inovulações foram realizadas em três propriedades nos municípios de Paranapanema-SP, Itapetininga-SP e Ouro Fino-MG. Todos os animais foram submetidos a rigoroso manejo sanitário e ginecológico, e mantidos a pasto (Brachiaria decumbens) com suplementação mineral e água ad libitum. As receptoras (n = 205) foram agrupadas equitativamente quanto ao escore de condição corporal, condição ovariana, categoria animal e período pós-parto, em dois grupos: Grupo Controle - dispositivo auricular (Crestar®, Intervet, Holanda) contendo 3mg de norgestomet (n=103) e Grupo Tratado - implante intravaginal (Progestar®, Innovare, Brasil) contendo 1,72g de progesterona (n=102). No início da sincronização ambos os grupos foram tratados com 2mg de benzoato de estradiol (BE, Innovare, Brasil) intramuscular (IM). Os dispositivos permaneceram nos animais por oito dias, e no momento da retirada foram administradas 400UI de eCG (Novormon®, Syntex, Argentina) IM e 530&mu;g cloprostenol sódico (Sincrocio®,Ouro Fino, Brasil) IM. Após 24 horas da retirada, foi aplicado 1mg de BE IM, como indutor de ovulação. Analisando as novilhas (n=77), vacas solteiras (n=69) e paridas (n=59), obtiveram-se os seguintes resultados, respectivamente para os grupos controle e tratamento: taxa de aproveitamento (TA) 72,8% (n=103) vs 83,3% (n=102), de concepção (TC) 47,9% (n=73) vs 42,7% (n=82) e de prenhez (TP) 34,7% (n=101) vs 35,0% (n=100). Em analise posterior, as vacas paridas foram divididas em duas classes de período pós-parto: PP1 de 2 a 4 meses (n=35) e PP2 de 4 a 8 meses (n=24). Houve efeito da interação entre PP e condição ovariana (CO) para a variável TA, obtendo no PP2, os valores, significativamente diferentes (P<0,05), foram de 83,3% para as que estavam ciclando e 50% para as que não estavam ciclando. Também houve efeito de período pós-parto para TC e os valores de PP1 foi de 48,5% e no PP2 foi de 35,3% (P<0,05). Assim como para TC, houve efeito de PP para TP: vacas no PP1 tiveram 45,7% de prenhez, enquanto as que estavam no PP2, 26,4% (P<0,05). Concluiu-se que o novo dispositivo à base de biopolímeros Progestar® foi capaz de proporcionar taxas de ovulação, de concepção e de prenhez nas inovulações em programas TETF, em novilhas e vacas cruzadas, tanto quanto dispositivos confeccionados com silicone que liberam progestágenos (Crestar®). / There are many factors for the successful of ET programs, and the recipients are the major factor on this biotechnique. Nowadays, the products available in the brazilian market for releasing progesterone are imported and made of silicone, a biocompatible polymer, but not biodegradable. Recently, intravaginal progesterone devices made of PHB, a biodegradable polymer made from bacteria fermentation of sugar cane, have been studied. The objective of this present study was to compare the efficiency in ET programs of a new intravaginal device on ovulation, conception and pregnancy rate, in croosbreed heifers and cows, with a device made of silicone Crestar®, currently available in the brazilian market. The experiment was done with help of Embryo-sys® Company, which was responsible for the recipient\'s synchronizations and inovulations. The synchronizations and inovulations were done in three different places: Paranapanema-SP, Itapetininga-SP and Ouro Fino-MG. All the animals were kept in pasture of Brachiaria decumbens with mineral supplementation and ad libitum water. The body and ovary condition score, postpartum period and animal category were utilized for equal division of recipients (n=205), in two groups: control - auricular device (Crestar®) with 3mg of norgestomet (n=103) and treatment - intravaginal device (Progestar®) with 1.72g of progesterone (n=102). On day 0, all the animals received 2mg of estradiol benzoate (IM). On day 8, the devices were removed, 400UI of eCG and 500&mu;g of PGF2&alpha; were injected (IM). After 24 hours, was injected 1mg of estradiol benzoate (IM), as ovulation inductor. The animals had the following results, respectively for control and treatment group: ovulation rate (OR) - 72.8% (n=103) vs 83.3% (n=102), conception rate (CR) - 47.9% (n=73) vs 42.7% (n=82) and pregnancy rate (PR) - 34.7% (n=101) vs 35.0% (n=100). In further analysis, postpartum cows were divided in two classes: PP1 (2 - 4 months, n=35) and PP2 (4 - 8 months, n=24). There was an interaction between PP and ovary condition (OC) on OR, in which animals in PP2 and cyclic showed better results (83.3%) than the animals not cyclic (50%). There was effect of PP on CR, and the values for PP1 and PP2 were 48.5% and 35.5%, respectively. There was also effect of PP on PR: cows in PP1 showed 45.7% of PR, while cows in PP2, 26.4%. This experiment showed that the new intravaginal device (Progestar®) had the same efficiency on ovulation, conception and pregnancy rate, in ET programs, in crossbreed heifers and cows, as the commercially available device Crestar®.

Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune. / In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

À partir des postulats théoriques de l'École de Constance et spécialement de Wolfgang Iser, sur la base de la phénoménologie husserlienne, nous affirmons, à l’inverse des théories littéraires «immanentes» qui ont prédominé durant des décennies, que tout texte littéraire est nécessairement produit par l'auteur dans l'intention d'être lu par un destinataire, en l'occurrence le lecteur. En prenant comme référence le concept de sujet cognitif de W. Iser, nous soutenons que le récepteur, n’approche pas le texte d'une manière neutre et passive, mais qu’il incorpore toujours ses connaissances et ses coordonnées sociales, historiques, culturelles, idéologiques, d'identité et de sexe. Par conséquent, le principal objectif de notre travail est d’expliquer et de démontrer comment, en nous appuyant sur les structures discursives de la narration, une lectrice dotée de savoirs théoriques féministes et forte de sa propre optique en tant que femme dans le monde, peut re-construire certains personnages féminins du roman galdosien depuis une perspective féministe.À partir des postulats théoriques de l'École de Constance et spécialement de Wolfgang Iser, sur la base de la phénoménologie husserlienne, nous affirmons, à l’inverse des théories littéraires «immanentes» qui ont prédominé durant des décennies, que tout texte littéraire est nécessairement produit par l'auteur dans l'intention d'être lu par un destinataire, en l'occurrence le lecteur. En prenant comme référence le concept de sujet cognitif de W. Iser, nous soutenons que le récepteur, n’approche pas le texte d'une manière neutre et passive, mais qu’il incorpore toujours ses connaissances et ses coordonnées sociales, historiques, culturelles, idéologiques, d'identité et de sexe. Par conséquent, le principal objectif de notre travail est d’expliquer et de démontrer comment, en nous appuyant sur les structures discursives de la narration, une lectrice dotée de savoirs théoriques féministes et forte de sa propre optique en tant que femme dans le monde, peut re-construire certains personnages féminins du roman galdosien depuis une perspective féministe. / From the theoretical postulates of the School of Constance and especially of W. Iser, based upon the Husserlian phenomenology, we hold that all literary text is not necessarily produced by the author with the intention of being read by a receptor, in this case the reader. In acoordance with the W. Iser's concept of cognitive subject, we argue that the reader, against the inmanents literary theories that have prevailed for decades, does not read the literary text in a neutral and passive way but that always incorporates their knowledge and social, historical, cultural, ideological, identity and sexual coordinates. Therefore, the aim of our work is to explain and demonstrate how a female reader, substantiated by the discursive structures of the narration and due to her feminist theoretical contents and her woman's point of view in the world, can re-build to certain female characters of the galdosian roman —only to those who have an important narrative unit and a subversive elements— from a feminist perspective. / A partir de los postulados teóricos de la Escuela de Constanza y especialmente de W. Iser, con base en la fenomenología husserliana, sostenemos que todo texto literario es necesariamente producido por el autor en la intención de ser leído por un destinatario, en este caso el lector. Tomando como referencia el concepto de sujeto cognitivo de W. Iser, afirmamos que el receptor, contra las teorías literarias inmanentistas que han predominado durante décadas, no se acerca al texto de una manera neutra y pasiva sino que siempre incorpora sus conocimientos y coordenadas sociales, históricas, culturales, ideológicas, de identidad y de sexo. Por ello, el principal objetivo de nuestro trabajo es explicar y demostrar cómo, apoyada en las estructuras discursivas de la narración, una lectora, por sus contenidos teóricos feministas y su propia óptica como mujer en el mundo, puede re-construir a determinados personajes femeninos de la novela galdosiana —solamente aquellos dotados de una importante entidad narrativa y de elementos subversivos— desde una perspectiva feminista.