En la presente tesis se han estudiado los distintos mecanismos de toxicidad de las micotoxinas citrinina y ocratoxina A y la respuesta adaptativa a xenobióticos en el modelo de levadura Saccharomyces cerevisiae, concretamente la regulación de los transportadores multidrogas del sistema PDR y sus factores de transcripción. La respuesta a xenobióticos permite a las células eucariotas adaptarse y sobrevivir a la exposición de gran variedad de compuestos exógenos, como toxinas o fármacos. En esta respuesta participan distintos tipos de proteínas, principalmente transportadores de membrana y factores de transcripción. Para estudiar esta respuesta adaptativa sometimos las células de levadura a distintos tratamientos con las micotoxinas citrinina (CIT) y ocratoxina A (OTA), y los oxidantes menadiona (MEN), y peróxido de hidrógeno (H2O2). Las micotoxinas CIT y OTA son metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos que contaminan alimentos básicos y que son tóxicas para el ser humano. Aquí, estudiamos sus mecanismos de toxicidad a través de experimentos de expresión génica con reporteros luciferasa, ensayos transcriptómicos, y ensayos fenotípicos con mutantes de pérdida de función para determinadas proteínas involucradas en la defensa antioxidante y de transporte multidroga. Los resultados muestran diferencia de los mecanismos de toxicidad entre ambas micotoxinas. CIT induce la expresión de genes involucrados en el transporte de drogas y la respuesta a estrés oxidativo, mientras que OTA activa, principalmente, la expresión de genes implicados en el desarrollo, como meiosis o esporulación, y en menor medida, genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo y al transporte multidroga. En levadura, los transportadores multidroga de la membrana plasmática que eliminan compuestos tóxicos de la célula forman parte del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Este sistema está compuesto por proteínas conservadas de bacterias a humanos, como transportadores multidroga y factores de transcripción. Cuando estos transportadores son sobreexpresados, da lugar al fenómeno de resistencia pleiotrópica a drogas (PDR) o resistencia a múltiples drogas (MDR). Este proceso de resistencia es de gran importancia en diversos tratamientos médicos, como quimioterapia en cáncer, o antifúngicos, ya que disminuyen su eficiencia. Aquí, hemos estudiado el funcionamiento del sistema PDR en levadura de varios transportadores multidroga (Pdr5, Pdr15, Snq2, y Yor1) y factores de transcripción (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, y Stb5) mediante cuantificación de expresión luciferasa. Los resultados muestran que, de entre los transportadores estudiados, Pdr5 y Snq2 son los principales en la respuesta de adaptación frente a CIT, OTA y MEN, mientras que Pdr15 parece actuar como un transportador secundario. Además, la regulación de estos tres transportadores ante la exposición de CIT está dirigida por el factor de transcripción Pdr1. SNQ2 es el único de los cuatro transportadores que se induce al tratar las células con H2O2. Pdr1 activa la transcripción de genes en respuesta a CIT y OTA a través de los sitios específicos PDRE, mientras que Pdr8 e Yrm1, parecen actuar como reguladores negativos en respuesta a CIT. Por último, desarrollamos un sistema binario de plásmidos que nos permite definir las distintas sensibilidades y especificidad a drogas por parte de los factores de transcripción de forma individual. Pdr1 es capaz de reconocer e inducir la activación de la expresión génica en todos los tratamientos, aunque levemente con H2O2. Yrr1 presenta inducción de la expresión génica ante CIT y, especialmente, OTA, indicando su capacidad de discriminación entre estas moléculas. Por último, Stb5 reconoce e induce la expresión génica en el tratamiento con H2O2 en mayor nivel que Pdr1. Los resultados muestran un alto nivel de regulación del sistema PDR, con Pdr1 como factor de transcripción pr / In the present thesis, we have studied the different toxicity mechanisms of the mycotoxins citrinin and ochratoxin A and the adaptive response to xenobiotics in the yeast model of Saccharomyces cerevisiae, specifically the regulation of the multidrug transporters of the PDR network and its transcription factors. The response to xenobiotics allows eukaryotic cells to adapt and survive the exposure to a wide variety of exogenous compounds, such as toxins or drugs. Different types of proteins participate in this response, mainly membrane transporters and transcription factors. To study this adaptive response we subjected the yeast cells to different treatments with the mycotoxins citrinin (CIT) and ochratoxin A (OTA), and oxidants menadione (MEN), and hydrogen peroxide (H2O2). The mycotoxins CIT and OTA are secondary metabolites produced by several filamentous fungi, which contaminate staple foods and which are toxic to humans. Here, we studied their toxicity mechanisms through gene expression experiments with luciferase reporters, transcriptomic assays, and phenotypic assays with loss-of-function mutants for certain proteins involved in antioxidant defense and multidrug transport. The results show differences in the mechanisms of toxicity between both mycotoxins. CIT induces the expression of genes involved in drug transport and the response to oxidative stress, whereas OTA activates, mainly, the expression of genes involved in development, such as meiosis or sporulation, and to a lesser extent, genes related to response to oxidative stress and multidrug transport. In yeast, multidrug transporters of the plasma membrane that remove toxic compounds from the cell are part of the PDR (pleiotropic drug resistance) network. This system is composed of proteins conserved from bacteria to humans, such as multidrug transporters and transcription factors. When these transporters are overexpressed, it leads to a phenomenon known as pleiotropic drug resistance (PDR) or multidrug resistance (MDR). This resistance process is very important in various medical treatments, such as chemotherapy in cancer, or antifungals, since they reduce their efficiency. Here, we have studied the function of the PDR multidrug transporters (Pdr5, Pdr15, Snq2, and Yor1) and transcription factors (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, and Stb5) by quantifying luciferase expression in promoters or specific recognition sites. The results show that, among the studied transporters, Pdr5 and Snq2 have major roles in the adaptation response to CIT, OTA and MEN, while Pdr15 seems to act as a secondary transporter. Moreover, the regulation of these three transporters upon exposure to CIT is directed by the transcription factor Pdr1. SNQ2 is the only one of the four transporters that is induced by treating cells with H2O2. Pdr1 activates the transcription of genes in response to CIT and OTA through specific PDRE sites, while Pdr8 and Yrm1, appear to act as negative regulators in response to CIT. Finally, we developed a binary plasmid system that allows us to define the different sensitivities and specificity to drugs by the transcription factors individually. Pdr1 is able to recognize and induce the activation of gene expression in all treatments, albeit very slightly with H2O2. Yrr1 shows induction of gene expression with CIT and, especially, OTA, indicating its ability to discriminate between these molecules. Finally, Stb5 recognizes and induces gene expression in H2O2 treatment at a higher level than Pdr1. These results show an important level of regulation of the PDR network, with Pdr1 as the main transcription factor, but with the cooperation of more specific regulators. / En la present tesi s'han estudiat els diferents mecanismes de toxicitat de les micotoxines citrinina i ocratoxina A i la resposta adaptativa a xenobiòtics en el model de llevat Saccharomyces cerevisiae, concretament la regulació dels transportadors multidroga del sistema PDR i els seus factors de transcripció. La resposta a xenobiòtics permet a les cèl·lules eucariotes adaptar-se i sobreviure a l'exposició de gran varietat de compostos exògens, com toxines o fàrmacs. En aquesta resposta participen diferents tipus de proteïnes, principalment transportadors de membrana i factors de transcripció. Per estudiar aquesta resposta adaptativa vam sotmetre les cèl·lules de llevat a diferents tractaments amb les micotoxines citrinina (CIT) i ocratoxina A (OTA), i els oxidants menadiona (MEN), i peròxid d'hidrogen (H2O2). Les micotoxines CIT i OTA són metabòlits secundaris produïts per diversos fongs filamentosos que contaminen aliments bàsics i que són tòxiques per a l'ésser humà. Ací, estudiem els seus mecanismes de toxicitat a través d'experiments d'expressió gènica amb reporters luciferasa, assaigs transcriptòmics, i assajos fenotípics amb mutants de pèrdua de funció per a determinades proteïnes involucrades en la defensa antioxidant i de transport multidroga. Els resultats mostren diferència dels mecanismes de toxicitat entre les dues micotoxines. CIT indueix l'expressió de gens involucrats en el transport de drogues i la resposta a estrès oxidatiu, mentre que OTA activa, principalment, l'expressió de gens implicats en el desenvolupament, com meiosi o esporulació, i en menor mesura, gens relacionats amb la resposta a estrès oxidatiu i al transport multidroga. En llevat, els transportadors multidroga de la membrana plasmàtica que eliminen compostos tòxics de la cèl·lula formen part del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Aquest sistema està compost per proteïnes conservades de bacteria a humans, com transportadors multidroga i factors de transcripció. Quan aquests transportadors es troben sobreexpressats, dóna lloc al fenomen de resistència pleiotrópica a drogues (PDR) o resistència a múltiples drogues (MDR). Aquest procés de resistència és de gran importància en diversos tractaments mèdics, com quimioteràpia en càncer, o antifúngics, ja que disminueixen la seua eficiència. Ací hem estudiat el funcionament del sistema PDR en llevat de diversos transportadors multidroga (Pdr5, Pdr15, Snq2, i Yor1) i factors de transcripció (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, i Stb5) mitjançant quantificació d'expressió luciferasa. Els resultats mostren que, d'entre els transportadors estudiats, Pdr5 i Snq2 són els principals en la resposta d'adaptació davant de CIT, OTA i MEN, mentre que Pdr15 sembla actuar com un transportador secundari. A més d'això, la regulació d'aquests tres transportadors davant l'exposició de CIT està dirigida pel factor de transcripció Pdr1. SNQ2 és l'únic dels quatre transportadors que s'indueix en tractar les cèl·lules amb H2O2. Pdr1 activa la transcripció de gens en resposta a CIT i OTA a través dels llocs específics PDRE, mentre que Pdr8 i Yrm1, semblen actuar com a reguladors negatius en resposta a CIT. Finalment, vam desenvolupar un sistema binari de plasmidis que enspermet definir les diferents sensibilitats i especificitat a drogues per part dels factors de transcripció de forma individual. Pdr1 és capaç de reconèixer i induir l'activació de l'expressió gènica en tots els tractaments, encara que lleument amb H2O2. Yrr1 presenta inducció de l'expressió gènica davant CIT i, especialment, OTA, indicant la seua capacitat de discriminació entre aquestes molècules. Finalment, Stb5 reconeix i indueix l'expressió gènica en el tractament amb H2O2 en major nivell que Pdr1. Els resultats mostren un important nivell de regulació del sistema PDR, amb Pdr1 com a factor de transcripció principal, però amb la cooperació d'altres regulador / Vanacloig Pedrós, ME. (2018). Estrategias de defensa a estrés químico en Saccharomyces cerevisiae: regulación genética del transporte multidroga y mecanismos de detoxificación [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111949 / TESIS

[ES] El correcto desarrollo de tejidos vasculares depende del ajuste preciso entre la proliferación de células vasculares y la diferenciación celular. En Arabidopsis thaliana, la proliferación de células vasculares en el cambium es potenciada por la citoquinina, la síntesi de la cual está promovida por la actividad dependiente de auxina de un heterodímero de factores de transcripción (TF) formado por LONESOME HIGHWAY (LHW) y por TARGET OF MONOPTEROS 5 (TMO5). Como mecanismo de seguridad, las auxinas también activan un módulo inhibidor que implica la inducción precisa de la Termospermina (Tspm) sintasa ACAULIS5 (ACL5) en células vasculares proliferantes por acción conjunta de las auxinas y del TF Class III HD-ZIP (C3HDZ) AtHB8. Entonces, la Tspm permite la traducción de las proteínas SACL de forma celular autónoma, que perjudican la actividad de LHW. Sin embargo, la observación de que estos elementos están presentes en los genomas de todas las plantas terrestres - y no sólo de las plantas vasculares - plantea dos preguntas desde una perspectiva evolutiva: (i) ¿cuál es la función de estos genes en las plantas terrestres no vasculares? y (ii) ¿cuándo se creó el módulo regulador concreto? En esta Tesis, mediante la combinación de análisis filogenéticos, celulares y moleculares con la hepática Marchantia polymorpha, proponemos que la auxina y C3HDZ son reguladores ancestrales de la expresión de ACL5, y que esta conexión se mantiene en las traqueófitas y las briófitas existentes. Por el contrario, la traducción dependiente de Tspm de SACL parece ser específica de las traqueófitas, basado en la aparición de un uORF conservado en la secuencia 5' líder de los tránscritos de SACL y en evidencia experimental basada en ensayos transitorios para la traducción de SACL. De acuerdo con estas observaciones, las funciones de MpACL5 y MpSACL son diferentes en M. polymorpha. MpACL5 se expresa en "notches" apicales y modula la bifurcación de los meristemos. Por otro lado, la expresión de MpSACL está mayoritariamente excluida de los "notches" apicales y su actividad afecta negativamente la producción de gemas y rizoides mediante la interacción con MpRSL1. Finalmente, la hibridación de ARN in situ de ortólogos de C3HDZ, ACL5 y SACL en la gimnosperma Ginkgo biloba, el helecho Ceratopteris richardii y la licófita Selaginella kraussiana indican que la expresión de los tres genes se solapa en los tejidos vasculares. Nuestros resultados sugieren que la función de C3HDZ, ACL5 y SACL ha seguido trayectorias evolutivas divergentes en briófitas y traqueófitas, para controlar, finalmente, diferentes funciones específicas dentro de cada linaje. Sólo en las traqueófitas se formó el módulo regulador y se asoció con la restricción de la proliferación de células vasculares. / [CA] El correcte desenvolupament dels teixits vasculars depèn del precís ajust entre la proliferació de cèl·lules vasculars i la diferenciació cel·lular. En Arabidopsis thaliana, la proliferació de cèl·lules vasculars al càmbium és potenciada per la citoquinina, la síntesi de la qual està promoguda per l'activitat dependent d'auxina d'un heterodímer de factors de transcripció (TF) format per LONESOME HIGHWAY (LHW) i TARGET OF MONOPTEROS 5 (TMO5). Com a mecanisme de seguretat, l'auxina també activa un mòdul inhibidor que implica la inducció precisa de la Termospermina (Tspm) sintasa ACAULIS5 (ACL5) en cèl·lules vasculars proliferants per l'acció conjunta de l'auxina i del TF Class III HD-ZIP (C3HDZ) AtHB8. Llavors, la Tspm permet la traducció de les proteïnes SACL de forma autònoma cel·lular, que perjudiquen l'activitat de LHW. Tanmateix, l'observació de que aquests elements estan presents en els genomes de totes les plantes terrestres - i no només de les plantes vasculars - planteja dues preguntes des d'una perspectiva evolutiva: (i) quina és la funció d'aquests gens en les plantes terrestres no vasculars? i (ii) quan es va crear el mòdul regulador complet? En aquesta Tesi, mitjançant la combinació d'anàlisis filogenètics, cel·lulars i moleculars amb la hepàtica Marchantia polymorpha, proposem que l'auxina i C3HDZ són reguladors ancestrals de l'expressió d'ACL5, i que aquesta connexió es mantén en els traqueòfits i briòfits existents. Per contra, la traducció depenent de Tspm de SACL sembla ser específica dels traqueòfits, basat en l'aparició d'un uORF conservat a la seqüència 5' líder dels trànscrits de SACL i en evidència experimental basada en assajos transitoris per a la traducció de SACL. D'acord amb aquestes observacions, les funcions de MpACL5 i MpSACL són diferents a M. polymorpha. MpACL5 s'expressa en "notch" apicals i modula la bifurcació dels meristems. D'altra banda, l'expressió de MpSACL està majoritàriament exclosa dels "notch" apicals i la seva activitat afecta negativament la producció de gemmes i rizoids mitjançant la interacció amb MpRSL1. Finalment, la hibridació d'ARN in situ d'ortòlegs de C3HDZ, ACL5 i SACL a la gimnosperma Ginkgo biloba, la falguera Ceratopteris richardii i el licòfit Selaginella kraussiana indica que l'expressió dels tres gens es solapa als teixits vasculars. Els nostres resultats suggereixen que la funció de C3HDZ, ACL5 i SACL va seguir trajectòries evolutives divergents en briòfits i traqueòfits, per controlar, finalment, diferents funcions específiques dins de cada llinatge. Només en els traqueòfits es va formar el mòdul regulador i es va associar amb la restricció de la proliferació de cèl·lules vasculars. / [EN] The correct development of vascular tissues depends on the precise adjustment between vascular cell proliferation and cell differentiation. In Arabidopsis thaliana, vascular cell proliferation in the cambium is enhanced by cytokinin, whose synthesis is promoted by the auxin-dependent activity of a transcription factor (TF) heterodimer formed by LONESOME HIGHWAY (LHW) and TARGET OF MONOPTEROS 5 (TMO5). As a safety mechanism, auxin also deploys a negative feedforward regulatory module which involves the precise induction of the Thermospermine (Tspm) synthase ACAULIS5 (ACL5) in proliferating vascular cells by the joint action of auxin and the class-III HD-ZIP (C3HDZ) AtHB8 TF. Tspm then allows the cell-autonomous translation of the SACL proteins, which impair the activity of LHW. However, the observation that these elements are present in the genomes of all land plants -and not only vascular plants- poses two questions from an evolutionary perspective: (i) what is the function of these genes in non-vascular land plants? and (ii) when was the full regulatory module assembled? In this Thesis, through the combination of phylogenetic, cellular, and molecular genetic analyses with the liverwort Marchantia polymorpha, we propose that auxin and C3HDZ are ancestral regulators of ACL5 expression, and that this connection is maintained in extant tracheophytes and bryophytes. On the contrary, thermospermine-dependent translation of SACL seems to be specific of tracheophytes, based on the appearance of a conserved uORF in the 5' leader sequence of SACL transcripts and on experimental evidence using transient assays for SACL translation. In agreement with these observations, the functions of MpACL5 and MpSACL are different in M. polymorpha. MpACL5 is expressed in apical notches and modulates meristem bifurcation. On the other hand, MpSACL expression is mostly excluded from apical notches and its activity negatively affects gemmae and rhizoid production through the interaction with MpRSL1. Finally, in situ RNA hibridization of C3HDZ, ACL5 and SACL orthologs in the gymnosperm Ginkgo biloba, the fern Ceratopteris richardi and the lycophyte Selaginella kraussiana indicates that the expression of the three genes overlaps in vascular tissues. Our results suggest that the function of C3HDZ, ACL5 and SACL followed divergent evolutionary trajectories in bryophytes and tracheophytes, to ultimately control different lineage-specific functions. Only in tracheophytes was the regulatory module assembled and associated with the restriction of vascular cell proliferation. / Solé Gil, A. (2023). Origin & Evolution of the C3HDZ-ACL5-SACL Regulatory Module in Land Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196681