Der hepatische Ischämie-Reperfusionsschaden stellt ein großes Problem in der Transplantations- und Leberchirurgie dar: Insbesondere durch Fibrose, Steatose oder Entzündungsprozesse vorgeschädigte Organe zeigen eine erhöhte Vulnerabilität für den Reperfusionsschaden. Protektive Effekte einer Therapie mit mesenchymalen Stammzellen konnten bereits in Vorversuchen gezeigt werden. Ein direkter Vergleich mit den morphologisch sehr ähnlichen Fibroblasten wurde bisher nicht durchgeführt. Diese Wirkung scheint nach aktuellem Forschungsstand nicht durch zellgebundene, sondern parakrine Effekte vermittelt zu werden. Eine präemptive Injektion von Extrazellulärvesikel aus dem Überstand von Zellkulturen zeigte ähnliche Effekte wie eine Therapie mit Stammzellen. Das in dieser Arbeit durchgeführte Tierversuchsmodell basiert auf einer chirurgisch induzierten 70% Ischämie der Mausleber mit präemptiver Injektion von mesenchymalen Stammzellen, Fibroblasten, sowie deren jeweilige Extrazellulärvesikel. Eine präemptive Therapie mit mesenchymalen Stammzellen und deren Extrazellulärvesikeln verringerte den Leberzellschaden, gemessen anhand der Serumtransaminasenspiegel und Ausprägung der Nekrosefläche innerhalb Ischämie-exponierter Leberabschnitte, und konnte die Leberzellregeneration durch vermehrte Ausbildung von Lipid-Microdroplets und erhöhte Zellproliferationsraten der Hepatozyten bis in die Spätphase des Ischämie-Reperfusionsschadens beschleunigen. In Tieren mit einer präemptiven Injektion von Fibroblasten und deren Extrazellulärvesikel konnten diese Effekte nicht nachgewiesen werden. Es konnte kein Unterschied zwischen einer Therapie mit mesenchymalen Stammzellen und deren Extrazellulärvesikeln festgestellt werden. / Hepatic ischemia reperfusion damage remains a major obstacle in liver transplantation surgery and liver resection: Especially organs damaged by fibrosis, steatosis or inflammatory processes show an increased vulnerability to reperfusion damage. Protective effects of mesenchymal stem cells have already been reported. A direct comparison with fibroblasts, which show many morphological similarities to mesenchymal stem cells, has not yet been carried out. The protective potential of these cells does not seem to be mediated by cell bound, but paracrine effects. A preemptive injection of extracellular vesicles from the supernatant of cell cultures showed similar effects to an injection of stem cells. The animal model carried out in this work is based on a surgically induced 70% ischemia of the mouse liver with preemptive injection of mesenchymal stem cells, fibroblasts, as well as their extracellular vesicles. Preemptive therapy with mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles reduced liver cell damage, as measured by serum transaminase levels and expression of the necrosis area within ischemia-exposed liver sections. It also accelerated liver cell regeneration through increased formation of lipid microdroplets and increased cell proliferation rates of hepatocytes into the late phase of ischemia reperfusion damage. In animals with a preemptive injection of fibroblasts and their extracellular vesicles these effects could not be demonstrated. No difference was found between mesenchymal stem cell therapy and their extracellular vesicles, supporting the hypothesis, that the effects of mesenchymal stem cell injection result from a paracrine effect.

Nach Ischämie und Reperfusion des Pankreas kommt es zu einer Mikrozirkulationsstörung sowie zu einer T-Zell-induzierten subakuten entzündlichen Reaktion mit daraus resultierender Zellzerstörung. Ziel dieser tierexperimentellen Arbeit war es, sowohl den Einfluss des S1PStrukturanalogons FTY720 auf zirkulierende T-Lymphozyten und deren Endothel- Interaktion in den postkapillären Venolen des Pankreas zu beobachten sowie die Mikrozirkulation und damit das Ausmaß des Ischämie-Reperfusionsschadens nach einer 60-minütigen Pankreasischämie durch die Gabe von FTY720 zu beurteilen. Hierfür erfolgte eine reversible Okklusion der zuführenden Gefäße des Pankreas an Ratten (48 Wistar-Ratten, 300 - 350 g KG) für 60 Minuten zur Induktion einer normothermen Pankreasischämie. Untersucht wurden folgende Gruppen: I Scheinoperation ohne Therapie, II Scheinoperation und Therapie, III Ischämie ohne Therapie, IV Ischämie und Therapie mit dem Sphingosin-1-Phosphat Strukturanalogon FTY720 (1 mg/kg KG i.v., Substitution 10 Minuten vor Reperfusionsbeginn). Mit Hilfe der invivo-Fluoreszenzmikroskopie wurden die Parameter der Mikrozirkulation (Zellzahl, Flussgeschwindigkeit, Kapillardurchmesser, Funktionelle Kapillardichte, T-Lymphozyten-Endothel-Interaktion und Leukozyten-Endothel- Interaktion) 10 Minuten nach Substitution der markierten CD4+-T-Lymphozyten beurteilt. Des Weiteren wurde der Blutparameter Lipase bestimmt. Die Studie erbrachte folgende Ergebnisse: 1. Die intravenöse Therapie mit FTY720 als Sphingosin 1-Phosphat-Rezeptor- Agonist 15 Minuten vor Reperfusion führte zu einer partiellen Verbesserung der Mikrozirkulation des Pankreas mit signifikant erhöhten Kapillardurchmesser und Funktioneller Kapillardichte. 2. Es zeichneten sich bei allen weiteren Parametern nur Tendenzen einer Verbesserung unter Substitution von FTY720 ab (Flussgeschwindigkeit, Lipase). 3. Eine Aussage zur T-Lymphozyten-Endothel-Interaktion konnte aufgrund der geringen Anzahl von „rollern“ und „stickern“ nicht gemacht werden. 4. Eine quantitative Auswertung der zirkulierenden Leukozyten war nicht möglich. Das vorliegende Bildmaterial war jedoch in allen Gruppen identisch, sodass hier kein Effekt von FTY720 auf zirkulierende Leukozyten nachweisbar war. 5. Zu einer signifikanten Zunahme der T-Lymphozyten-Zahl kam es in der Gruppe IV (Ischämie und Therapie mit FTY720). Die Ergebnisse dieser tierexperimentellen Untersuchung zeigen, dass die intraoperative Gabe des Immunmodulators FTY720 nur partiell eine Verbesserung der Mirkozirkulation und daraus resultierend eine Verminderung des Ischämie-Reperfusionsschadens bewirkt. Nach den Ergebnissen dieser Studie und dem aktuellen Stand der Literatur wäre somit für ein optimales Wirkmaximum die präoperative Gabe von FTY720 erforderlich. Die Studie zeigt ebenfalls, dass die Substitution der markierten CD4+-T-Lymphozyten zu einem früheren Zeitpunkt erfolgen muss, um eine Wirkung des FTY720 auf diese T-Zellen nachweisen zu können.

Nach Ischämie und Reperfusion des Pankreas kommt es zu einer Mikrozirkulationsstörung sowie zu einer T-Zell-induzierten subakuten entzündlichen Reaktion mit daraus resultierender Zellzerstörung. Ziel dieser tierexperimentellen Arbeit war es, sowohl den Einfluss des S1PStrukturanalogons FTY720 auf zirkulierende T-Lymphozyten und deren Endothel- Interaktion in den postkapillären Venolen des Pankreas zu beobachten sowie die Mikrozirkulation und damit das Ausmaß des Ischämie-Reperfusionsschadens nach einer 60-minütigen Pankreasischämie durch die Gabe von FTY720 zu beurteilen. Hierfür erfolgte eine reversible Okklusion der zuführenden Gefäße des Pankreas an Ratten (48 Wistar-Ratten, 300 - 350 g KG) für 60 Minuten zur Induktion einer normothermen Pankreasischämie. Untersucht wurden folgende Gruppen: I Scheinoperation ohne Therapie, II Scheinoperation und Therapie, III Ischämie ohne Therapie, IV Ischämie und Therapie mit dem Sphingosin-1-Phosphat Strukturanalogon FTY720 (1 mg/kg KG i.v., Substitution 10 Minuten vor Reperfusionsbeginn). Mit Hilfe der invivo-Fluoreszenzmikroskopie wurden die Parameter der Mikrozirkulation (Zellzahl, Flussgeschwindigkeit, Kapillardurchmesser, Funktionelle Kapillardichte, T-Lymphozyten-Endothel-Interaktion und Leukozyten-Endothel- Interaktion) 10 Minuten nach Substitution der markierten CD4+-T-Lymphozyten beurteilt. Des Weiteren wurde der Blutparameter Lipase bestimmt. Die Studie erbrachte folgende Ergebnisse: 1. Die intravenöse Therapie mit FTY720 als Sphingosin 1-Phosphat-Rezeptor- Agonist 15 Minuten vor Reperfusion führte zu einer partiellen Verbesserung der Mikrozirkulation des Pankreas mit signifikant erhöhten Kapillardurchmesser und Funktioneller Kapillardichte. 2. Es zeichneten sich bei allen weiteren Parametern nur Tendenzen einer Verbesserung unter Substitution von FTY720 ab (Flussgeschwindigkeit, Lipase). 3. Eine Aussage zur T-Lymphozyten-Endothel-Interaktion konnte aufgrund der geringen Anzahl von „rollern“ und „stickern“ nicht gemacht werden. 4. Eine quantitative Auswertung der zirkulierenden Leukozyten war nicht möglich. Das vorliegende Bildmaterial war jedoch in allen Gruppen identisch, sodass hier kein Effekt von FTY720 auf zirkulierende Leukozyten nachweisbar war. 5. Zu einer signifikanten Zunahme der T-Lymphozyten-Zahl kam es in der Gruppe IV (Ischämie und Therapie mit FTY720). Die Ergebnisse dieser tierexperimentellen Untersuchung zeigen, dass die intraoperative Gabe des Immunmodulators FTY720 nur partiell eine Verbesserung der Mirkozirkulation und daraus resultierend eine Verminderung des Ischämie-Reperfusionsschadens bewirkt. Nach den Ergebnissen dieser Studie und dem aktuellen Stand der Literatur wäre somit für ein optimales Wirkmaximum die präoperative Gabe von FTY720 erforderlich. Die Studie zeigt ebenfalls, dass die Substitution der markierten CD4+-T-Lymphozyten zu einem früheren Zeitpunkt erfolgen muss, um eine Wirkung des FTY720 auf diese T-Zellen nachweisen zu können.

Einleitung - Die ethische Rechtfertigung von Tierversuchen ist in unserer Gesellschaft höchst umstritten. Es ist in zunehmendem Maße Gegenstand von wissenschaftlichen Bemühungen, Alternativmethoden zu Tierversuchen zu etablieren. Fragestellung - In dieser Arbeitsgruppe wurde ein Modell zur isolierten Vollblutperfusion kältekonservierter Schlachthoforgane entwickelt. Es wurde anhand von Experimenten mit vasoaktiven Pharmaka der hämodynamische Funktionszustand der isoliert reperfundierten Schweineniere evaluiert. Methoden - 21 Nieren wurden nach einer warmen Ischämiephase von 16,5 min ± 4,3 min und einer Kältekonservierung von 6,6 h ± 1,9 h für insgesamt 150 Minuten normotherm reperfundiert, wovon eine Zeitspanne von 45 Minuten nach einer einstündigen Äquilibrierungsphase bei allen Nieren als interne Kontrolle diente. Daraufhin wurde ohne Pharmakongabe bei 6 Nieren (Gruppe 1, Kontrolle), unter Dauerinfusion von Nitroprussid-Natrium (NN) bei 8 Nieren (Gruppe 2) und von Noradrenalin (NA) bei 7 Nieren (Gruppe 3) für weitere 45 Minuten mit der Perfusion fortgefahren. In 15-minütigen Abständen wurden Blut- und Urinproben entnommen, und so wurden die renalen Funktionsparameter bestimmt sowie der Urin per Gelelektrophorese qualitativ auf Proteinurie untersucht. Anschließend an die Perfusion wurden die Nieren einer pathologisch-histologischen Begutachtung unterzogen, die mittels eines selbstentwickelten Scores quantifiziert wurde. Ergebnisse - Die beiden vasoaktiven Pharmaka entfalteten in der Interventionsphase die ihnen normalerweise zugeschriebenen Primärwirkungen: NA konstringierte die Hauptwiderstandsgefäße der Niere. Der renale Widerstand stieg von 0,61 auf 0,80 mmHg*min/(ml*100gNG). NN dilatierte die Hauptwiderstandsgefäße. Der Perfusionswiderstand sank von 0,74 auf 0,65 mmHg*min/(ml*100gNG). Umgekehrt verhielt sich der Perfusionsplasmafluß. Er sank unter NA von 104,74 auf 87,45 ml/(min*100gNG), während er unter NN von 107,20 auf 121,98 ml/(min*100gNG) stieg. Das Harnzeitvolumen stieg unter NA von 3,01 auf 3,33 ml/(min*100gNG) und sank unter NN von 1,62 auf 1,10 ml/(min*100gNG). Die Kreatininclearance sank sowohl unter NA (von 11,02 auf 9,48 ml/(min*100gNG)), als auch unter NN (von 10,89 auf 6,31 ml/(min*100gNG)). Während die Filtrationsfraktion unter NA konstant blieb, sank sie unter NN von 11,66 auf 6,30 %. Der Natriumtransport sank unter beiden Pharmaka, und zwar unter NA von 1,34 auf 1,14 mmol/(min*100gNG) und unter NN von 1,43 auf 0,84 mmol/(min*100gNG).Die Elektrophorese zeigte qualitativ eine selektive, im späteren Perfusionsverlauf unselektiver werdende Proteinurie bei allen untersuchten Nieren. In der Histologie zeigte sich in der Referenzgruppe tendentiell ein geringer ausgeprägter Ischämie-Reperfusionsschaden als nach Perfusion mit den verwendeten Pharmaka. Unter NN ließ sich hauptsächlich eine vermehrte Vakuolenbildung ausmachen, unter NA eine Dilatation der proximalen Tubuli. Diskussion - An den gemessenen Funktionsparametern konnte eine bevorzugte Wirkung beider Substanzen an den postglomerulären Arteriolen abgelesen werden, wie dies auch von der Literatur fast einhellig bestätigt wird. Die Ergebnisse der Elektrophorese lassen auf einen glomerulären Ischämieschaden schließen. Auch durch die histologische Begutachtung konnte diese Aussage des Ischämie-Reperfusionsschadens mit Ausdehnung auf eine tubuläre Komponente des Schadens bekräftigt werden. Sie steht in direktem Zusammenhang mit den Ergebnissen der Evaluation der Funktionsparameter. Die Ischämie bewirkte in erster Linie eine Erhöhung des renalen Gefäßwiderstandes. Die Verwendung des Kalziumantagonisten Verapamil sollte diesen Effekt einschränken und führte zu einer aufgehobenen Autoregulation. Die Experimente liefern als ein Modell des ischämisch induzierten Nierenversagens reproduzierbare und signifikante Ergebnisse. / Introduction - Ethical justification of vivisection is subject to controverse discussion. It is an issue of scientific effort to establish alternative methods. In this study a model of normothermic reperfusion was established including organs from slaughterhouse animals undergoing cold ischemia before reperfusion. Vasoactive agents were used to determine the state of function of the isolated reperfused pig kidney. Methods - 21 kidneys were reperfused for 150 minutes after a cold ischemia of 6.6 h ± 1.9 h and a warm ischemia of 16.5 min ± 4.3 min. Normothermic conditions were established. After a time span of an hour that served as an equilibration time, 45 minutes of untreated perfusion followed (internal control). After that, 6 kidneys remained untreated for another 45 minutes (group 1), 8 kidneys were continuously treated with sodium nitroprusside (SN) and 7 kidneys with norepinephrine (NE). In intervals of 15 minutes, blood and urine samples were taken. Thus parameters of renal function were determined and the urine was examined with gel electrophoresis. After the perfusion, all kidneys underwent a histopathological examination which was quantified using a self-established score. Results - Both pharmacological substances revealed their primary effects on renal vasculature. NE constricted the main renal resistance vessels. Renal resistance raised from 0.61 to 0.80 mmHg*min/(ml*100g renal weight). SN dilated the main resistance vessels. Perfusion resistance was reduced from 0.74 to 0.65 mmHg*min/(ml*100g renal weight). Perfusion plasma flow was reduced from 104.74 to 87.45 ml/(min*100g renal weight) under NE. It was raised from 107.20 to 121.98 ml/(min*100grenal weight) under SN. Under NE, urine time volume was raised from 3.01 to 3.33 ml/(min*100g renal weight) and it was reduced from 1.62 to 1.10 ml/(min*100g renal weight) under SN. Creatinine clearance was reduced rom 11.02 to 9.48 ml/(min*100g renal weight) under NE as well as under SN (from 10.89 to 6.31 ml/(min*100g renal weight)). Filtration fraction remained constant during infusion of NE, but it was reduced from 11.66 to 6.30 % under SN. Sodium transport was reduced under both substances. NE reduced it from 1.34 to 1.14 mmol/(min*100g renal weight) and from 1.43 to 0.84 mmol/(min*100g renal weight) under SN. Electrophoresis revealed qualitatively selective proteinuria in all examined kidneys, becoming more unselective in the course of the experiment. Histopathological findings revealed a smaller reperfusion injury in the control group than in both other groups (P>0.05). SN led to a vacuolisation in proximal tubular epithelium, NE was mainly responsible for a dilation of the proximal tubuli. Discussion - All measured function parameters revealed that the main effect of both substances was located in the postglomerular sphincter, which is also postulated by most of the literature. The results of urine electrophoresis lead to the assumption that there is a glomerular ischemic injury. Histological findings show also a tubular aspect of the reperfusion injury. It can be seen in direct context with the parameters of renal function. Ischemia was mainly responsible for a raise in renal vascular resistance. The calcium antagonist verapamil hydrochloride was used to diminish this effect and prevented autoregulation. Being defined as a model of ischemically induced renal failure, the experiments reveal reproducible and significant results.

Assessment of lung edema by gravimetrical analysis is a standard method to evaluate the severity of experimentally induced ischemia/reperfusion (IR) injury. The aim of this study was to compare gravimetrical assessment of pulmonary edema with a stereological approach which allows for qualitative and quantitative distinction between intravascular and edematous fluids by light microscopy. Eight experimental groups which differed in mode of preservation, ischemic storage and pharmacological treatments were studied in an extracorporeal rat lung model. Analysis of the pooled data showed that the wet/dry ratio values mainly reflected the amount of intra-alveolar edema (rs = 0.442; p = 0.0057) but only stereological assessment of edema formation revealed differences depending on the treatment used. Only stereological data correlated significantly with oxygen tension measured at the end of reperfusion (rs = –0.530; p = 0.0009). We conclude that gravimetry is of minor functional importance compared to assessment by stereological methods which prove to be a reliable and efficient tool for the evaluation of IR injury in the different experimental settings. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Die Niere ist ein lebenswichtiges Organ, das für die Homöostase des Körpers unentbehrlich ist. Bei einem Funktionsverlust, entweder kongenital oder durch ein akutes oder chronisches Nierenversagen, muss die Funktion ersetzt werden. Für die Nierenersatztherapie gibt es als Ersatzverfahren die Dialyse und die Nierentransplantation. Da eine Dialyse nicht alle Funktionen der Niere ersetzen kann sowie eine hohe Belastung für den Patienten darstellt, ist die Nierentransplantation der Goldstandard im Organersatz. Das vorhandene Angebot an Spenderorganen kann den aktuellen Bedarf allerdings nicht decken, sodass die aktuelle durchschnittliche Wartezeit auf ein postmortal gespendetes Organ in Deutschland derzeit bei etwa sieben bis zehn Jahren liegt. Erschwerend kommt hinzu, dass die verfügbaren Organe häufig von älteren Spendern mit Komorbiditäten stammen. Diese Nieren haben oft eine unklare Funktionsfähigkeit. Aus diesem Grund werden diese Nieren nicht immer für eine Transplantation angenommen oder gar nicht erst entnommen. Eine Methode, den verfügbaren Spenderpool zu vergrößern, ist daher, diese Nieren so gut als möglich nutzbar zu machen. Dafür müssen die Nieren vor der Transplantation medizinisch bewertet werden. Die Maschinenperfusion (MP) ist eine Methode der dynamischen Konservierung und Konditionierung von Organen. Die Vorteile einer Lagerung mittels hypothermer MP für die Niere sind bereits bekannt. Bei der normothermen MP wird die Niere mit einer oxygenierten, temperierten Perfusionslösung durchströmt. So wird der Metabolismus der Zellen aufrechterhalten und die Ischämiezeit verkürzt. Damit bietet die normotherme MP eine Plattform, um Nieren unter reperfusionsähnlichen Bedingungen zu observieren. Für diese Arbeit wurden die Nieren aus Schlachthofschweinen gewonnen und autologes Vollblut als Perfusionslösung verwendet. Die Perfusion erfolgte mittels einer eigens dafür vom Kooperationspartner (Institut für Biomedizinische Technik) konzipierten Perfusionsmaschine. Es konnte gezeigt werden, dass die Nieren damit stabil für 4 h mit Vollblut perfundiert werden können. Die Level verschiedener Biomarker wurden im Gewebe (Biopsien nach 0 und 4 h Perfusion), Urin (1 h-Sammelurin nach 1, 2 und 4 h Perfusion) und Plasma (nach 0, 1, 2 und 4 h) analysiert. Die Nieren wurden anhand verschiedener Kriterien in jeweils zwei Gruppen (gut und schlecht) eingeteilt. So erfolgte eine direkte Bewertung der Makroskopie nach der Perfusion durch einen anwesenden Arzt. Während diese direkte Bewertung der Situation dem klinischen Alltag ähnelt, ist diese jedoch subjektiver Art. Um diese Subjektivität zu relativieren, wurden die Nieren weiterhin durch mehrere Gutachter nach einem Makroskopischen Score eingeteilt. Dabei zeigte sich teilweise eine große Varianz zwischen den Gutachtern. Neben der Makroskopie wurden die Nieren auch nach ihrer Histologie bewertet. Hierfür wurden diese über den Remuzzi-Score klassifiziert. Dabei zeigte sich, dass die Nieren zum größten Teil sehr gut bewertet wurden und nur wenige Schäden aufzeigten. Da die Tubuli besonders schnell unter Ischämie geschädigt werden, wurden die Nieren insbesondere nach der Tubulus-Atrophie histologisch bewertet. Hierbei konnten häufiger und schneller Schäden an den Nieren beobachtet werden. Auch die Information über die Filtrationsleistung der Niere stellt einen wesentlichen Wissensgewinn dar, ist jedoch nur aufwändig bestimmbar. Mittels Inulin-Clearance-Bestimmung während der MP wurden die Nieren anhand dieser in eingeschränkt und nicht funktionsfähig eingeteilt. Auffällig dabei war, dass die einzelnen Klassifikationen nur eine vergleichsweise geringe Übereinstimmung hatten. Insbesondere die als Inulin-Clearance gemessene Funktionsfähigkeit korrelierte in keiner Weise mit der Makroskopie oder der Histologie. Im Gewebe wurden die Level der Biomarker für oxidativen Stress, 8-OHdG, und für Schäden des Epithels des proximalen Tubulus, KIM-1, mittels IHC untersucht. Der Ischämie-Reperfusionsschaden spiegelte sich hierbei in der Zunahme der Intensität der 8-OHdG-Färbung wider. Es zeigten sich jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den guten und schlechten Nieren. Die immunohistochemische KIM-1-Färbung nahm in histologisch guten Nieren häufiger ab als in histologisch schlechten Nieren. In den anderen Klassifizierungen zeigten sich keine Unterschiede. Aus dem Gewebe wurde die mRNA isoliert und die Expressionslevel mehrerer Biomarker vor und nach der Perfusion analysiert. Die Kim-1-mRNA war nicht nachweisbar. Die mRNA-Level der Marker EDN-1, TLR 4 und IL-6 nahmen im Verlauf der Zeit zu. Bei den meisten Klassifikationen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den jeweiligen Gruppen. Einzig in den Nieren, welche nach dem Remuzzi-Score eingeteilt wurden, waren die NGAL-mRNA-Level in den schlechten Nieren signifikant höher als in den guten. Dieser Unterschied trat jedoch nur bei der 0 h-Probe auf, am Ende der Perfusion war er nicht mehr zu beobachten. Im Urin wurden die Level von IL-6, KIM-1, NAG und NGAL bestimmt. Die Level der vier Biomarker nahmen im Verlauf der Zeit zu. Die jeweiligen Gruppen der verschiedenen Klassifizierungen unterschieden sich in den Urinsammelproben nicht anhand der IL-6-, NAG- und KIM-1-Level. Einzig in den guten und schlechten Nieren nach dem Makroskopischem Score waren die NGAL-Level signifikant unterschiedlich. Dieser Unterschied war nur im Sammelurin der 1 h-Probe nachzuweisen. Die gleichen Biomarker wurden ebenfalls im Plasma untersucht. Auch hier kam es zu einem Anstieg der Level aller Marker im Verlauf der Perfusion. KIM-1 unterschied sich in keiner Klassifikation in den jeweiligen guten und schlechten Nieren. NGAL war hingegen nach 1 h in Nieren, die nach dem Makroskopischen Score als schlecht beurteilt wurden, signifikant höher als in Nieren, die nach dem Score als gut eingeteilt wurden. In Nieren, welche von dem anwesenden Arzt als nicht transplantabel bewertet wurden, waren die Level von IL-6 und NAG in der 4 h-Plasmaprobe signifikant höher als in potentiell transplantablen Nieren. Dies weist darauf hin, dass die Plasma-basierten Marker IL-6 und NAG nach 4 h robust makroskopisch schlechte und gute Nieren differenzieren konnten. Dahingegen zeigte sich ein Unterschied in den NGAL-Leveln frühzeitig, aber nicht robust. Es konnte noch kein Marker gefunden werden, der frühzeitig und robust zwischen den jeweils stärker und schwächer geschädigten Nieren unterscheiden konnte. Trotzdem könnten sie nach einer Validierung dafür geeignet sein, in einem experimentellen Setting als Parameter dienen zu können, die die Qualität einer Niere unter NMP bewerten können. Weitere Biomarker, welche prädikativ für die Funktionalität oder Histologie des Organs sind, müssen in zukünftigen Versuchen evaluiert werden.:Inhaltsverzeichnis I Abkürzungen V 1 Einleitung 1 1.1 Die Niere 1 1.1.1 Aufgaben und Funktion der Niere 1 1.1.2 Das Nephron 1 1.2 Ausfall der Nierenfunktion 3 1.2.1 Akutes Nierenversagen 3 1.2.2 Chronische Niereninsuffizienz 4 1.3 Nierenersatztherapie 5 1.3.1 Die Dialyse 5 1.3.2 Leben unter Dialyse 5 1.4 Die Nierentransplantation 6 1.4.1 Aktueller Stand der Nierentransplantation in Deutschland 6 1.4.2 Allokation in der Eurotransplant-Region 7 1.4.3 Spendernieren 8 1.4.4 Transplantatfunktion 9 1.5 Ischämie und Reperfusion 11 1.5.1 Warme Ischämiezeit 11 1.5.2 Kalte Ischämiezeit 12 1.5.3 Ischämie-Reperfusionsschaden 12 1.6 Organkonservierung 14 1.6.1 Static cold storage 14 1.6.2 Hypotherme Maschinenperfusion 15 1.6.3 Normotherme Maschinenperfusion 15 1.6.4 Perfusionsgeräte 16 1.6.5 Die Maschinenperfusion als Bewertungstool 18 1.7 Biomarker 19 1.7.1 8-Hydroxyl-Desoxyguanosin 19 1.7.2 Endothelin-1 20 1.7.3 Toll-like receptor-4 20 1.7.4 Interleukin-6 21 1.7.5 Kidney injury molecule 1 22 1.7.6 N-Acetyl-/β-glucosaminidase 22 1.7.7 Neutrophile Gelatinase-assoziiertes Lipocalin 23 2 Zielstellung der Arbeit 24 3 Material 25 3.1 Geräte 25 3.2 Verbrauchsmaterial 26 3.3 Software 27 3.4 Chemikalien und Reagenzien 27 3.5 Kits 28 3.6 Medien, Puffer und Lösungen 29 3.7 qPCR-Assays 30 3.8 Antikörper 31 4 Methoden 32 4.1 Normotherme Maschinenperfusion 32 4.1.1 Nieren- und Vollblutentnahme bei Schlachthof-Tieren 32 4.1.2 Lagerung und Transport 33 4.1.3 Vorbereiten der Nieren 33 4.1.4 Vorbereiten des Perfusionskreislaufes 34 4.1.5 Nierenperfusion 38 4.1.6 Probenentnahme 40 4.2 Histologische Färbungen von Biopsien 42 4.2.1 Einbetten der Biopsien und Anfertigung von Schnitten 42 4.2.2 Hämalaun-Eosin-Färbung 44 4.2.3 Etablierung eines geeigneten IHC-Färbeprotokolls 45 4.2.4 Immunohistochemische Färbungen 46 4.2.5 Mikroskopie 47 4.2.6 Semi-quantitative Auswertung der Färbungen 48 4.3 RNA-Isolation aus Biopsien 48 4.3.1 Gewebeaufschluss der Biopsien 48 4.3.2 RNA-Aufreinigung mittels RNAeasy lipid tissue-Kit 48 4.4 RNA-Konzentrationsbestimmung 50 4.4.1 RNA-Konzentrationsbestimmung über Spektralphotometrie 50 4.4.2 Prüfen der RNA-Qualität mittels automatisierter Elektrophorese 50 4.5 cDNA-Synthese aus RNA mittels Superskript III Reverse Transkriptase 51 4.6 Real Time quantitative PCR 52 4.7 Quantifizierung der Markerkonzentration mittels ELISA 53 4.7.1 Prinzip des ELISA 53 4.7.2 Interleukin-6-ELISA 55 4.7.3 KIM-1-ELISA und NAG-ELISA 55 4.7.4 NGAL-ELISA 56 4.8 Gesamtprotein-Bestimmung mittels BCA-Assay 56 4.9 Bestimmung der Inulin-Clearance 57 4.10 Nierenklassifikation 61 4.10.1 Direkte makroskopische Bewertung 61 4.10.2 Bewertung nach dem Makroskopischen Score 61 4.10.3 Bewertung nach Remuzzi-Score 62 4.10.4 Bewertung nach Tubuli-Atrophie 63 4.10.5 Bewertung nach Funktionalität 64 4.11 Sequenzen und Alignments 64 4.12 Statistik 65 4.12.1 Signifikanzberechnungen 65 4.12.2 Receiver operated characteristic-Kurven 65 5 Ergebnisse 66 5.1 Ergebnisse der Methodenetablierung 66 5.1.1 Immunohistochemie 66 5.1.2 Eine gute RNA-Aufarbeitung kann allein durch Mörsern der Biopsie erreicht werden 71 5.1.3 GAPDH und RPL19 sind als Referenzgene für die qPCR geeignet 73 5.2 Ergebnisse der Klassifikation der Nieren 74 5.2.1 Die Nieren wurden anhand verschiedener Merkmale in fünf Gruppen eingeteilt 74 5.2.2 Die Übereinstimmung zwischen direkter Bewertung, Makroskopischem Score und Remuzzi-Score ist nicht hoch 75 5.2.3 Die Filtrationsleistung ist nicht mit den makroskopischen Bewertungen assoziiert 77 5.3 Analyse der mRNA-Level der potentiellen Biomarker im Gewebe von perfundierten Nieren 79 5.3.1 EDN-1-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 79 5.3.2 TLR-4-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 81 5.3.3 IL-6-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 83 5.3.4 KIM-1-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 85 5.3.5 NGAL-mRNA-Expression vor und nach 4 h NMP 85 5.4 Auswertung der histologischen und immunohistochemischen Färbungen 87 5.4.1 Leichte Zunahme des Remuzzi-Scores über die Zeit 87 5.4.2 In histologisch wenig geschädigten Nieren kommt es häufiger zu einer Abnahme der KIM-1-Färbung 88 5.4.3 Der 8-OHdG-Gehalt steigt im Verlauf der Zeit an 88 5.5 Analyse der potentiellen Biomarker im Urin im Verlauf der NMP 89 5.5.1 IL-6-Konzentrationsverlauf im Urin während der NMP 90 5.5.2 KIM-1-Konzentrationsverlauf im Urin während der NMP 91 5.5.3 NAG-Aktivitätsverlauf im Urin während der NMP 93 5.5.4 NGAL-Konzentrationsverlauf im Urin während der NMP 94 5.6 Analyse der potentiellen Biomarker im Plasma im Verlauf der NMP 96 5.6.1 IL-6-Konzentrationsverlauf im Plasma während der NMP 96 5.6.2 KIM-1-Konzentrationsverlauf im Plasma während der NMP 96 5.6.3 NAG-Aktivitätsverlauf im Plasma während der NMP 98 5.6.4 NGAL-Konzentrationsverlauf im Plasma während der NMP 100 5.7 ROC-Analysen der statistisch signifikanten Biomarker 101 6 Diskussion 104 6.1 Evaluation der Methodenetablierung 104 6.1.1 Kritische Betrachtung der Nutzbarkeit der Immunohistochemie 104 6.1.2 Wahl der Methodik für eine maximale RNA-Ausbeute 105 6.2 Das Modell „Schlachthofschwein“ 105 6.3 Setting der Maschinenperfusion im Vergleich zur Literatur 106 6.4 Vergleich der verschiedenen Klassifikationen 107 6.5 Evaluation der Biomarker auf ihre Eignung 108 6.5.1 8-OHdG als Biomarker für oxidative Schäden in der NMP 108 6.5.2 Endothelin-1 als Biomarker für die Endothelaktivierung in der NMP 110 6.5.3 TLR-4 als Biomarker für die Aktivierung der Immunantwort in der NMP 111 6.5.4 IL-6 als Biomarker für die akute Phase in der NMP 112 6.5.5 NAG als Biomarker für Zellschäden in der NMP 114 6.5.6 KIM-1 als Biomarker für Schäden am proximalen Tubulus in der NMP 116 6.5.7 NGAL als Biomarker für Schäden am proximalen Tubulus in der NMP 119 6.6 Kritische Betrachtung der Faktoren, welche die Aussagekraft einschränken können 121 6.7 Andere Parameter zur Vorhersage der Nierenqualität 122 6.8 Aussichten auf einen Bewertungsscore und Zukunft der NMP 122 7 Zusammenfassung 124 8 Summary 127 9 Literatur 129 Danksagung 160 Eigenständigkeitserklärung 161 Erklärung zur Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 162 Anhang 163 10.1 Abbildungsverzeichnis 163 10.2 Tabellenverzeichnis 164

Einleitung: Der Ischämie/Reperfusionsschaden (I/R) ist die wesentliche Ursache des frühen Transplantatversagens nach Lebertransplantation (LTx). Fettlebern sind dabei besonders betroffen. Freie Sauerstoffradikale spielen bei der Pathogenese eine zentrale Rolle. Die Morphologie der so versagenden Transplantatleber ist charakterisiert durch Entzündung, Nekrose und Apoptose. Endogene Radikalfänger wie die Superoxiddismutase (SOD), nicht aber exogen zugefuhrte, bauen freie Radikale ab. Das Ziel der vorgelegten Studien war es, im Modell der LTx von gesunden und verfetteten Lebern in der Ratte mittels adenoviralem Gentransfer von SOD den I/R zu vermindern, die Überlebensrate zu erhöhen und zugrunde liegende Mechanismen aufzuzeigen. Methoden: Bei Experimenten mit verfetteten Lebern wurde eine ausgeprägte Steatose der Spenderlebern durch Füttern einer Ethanol- und fettreichen Diät (Lieber-DiCarli) erzeugt. Explantierte Lebern wurden für 24 h konserviert und orthotop transplantiert. Einigen Spendern wurde 72 h vor Organentnahme Cu/Zn-SOD enthaltendes Adenovirus (Ad.SOD1) i.v. appliziert. Als Kontrollen dienten Fettlebern, welche mit dem Gen von b-Galaktosidase (Ad.lacZ) transfiziert wurden, oder aber gesunde Lebern. Untersuchungsparameter waren neben Transfektionsparametern die Transaminasen, histopathologische Morphologie, Überlebensraten, sowie die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und deren Kinasen. Freie Radikale wurden in der Galle mittels Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie nachgewiesen. In weiteren Experimenten wurden auch die mitochondriale und die extrazelluläre Isoform hinsichtlich ihrer protektiven Wirkung untersucht. Ebenso wurde die Auswirkung der freien Radikale auf die Regeneration nach Teillebertransplantation untersucht. Ergebnisse: 72 h nach Injektion von Ad.lacZ exprimierten etwa 80% aller Hepatozyten die b-Galaktosidase. In der Ad.SOD1 Gruppe war die Genexpression 3-fach, die Aktivität 12-fach erhöht. Im Vergleich zu den unbehandelten oder Ad.lacZ infizierten Empfängern von Fettlebern, stiegen die Transaminasen um etwa 50% bei der Ad.SOD1 Gruppe an. Alle Empfänger von Ad-SOD1 behandelten Fettlebern überlebten, hingegen nur 10% der Ad.lacZ Gruppe. Etwa 35% der Hepatozyten von Fettlebern waren nekrotisch, jedoch nur 10% in Ad.SOD1-behandelten Fettlebern. Ad.SOD1 halbierte die Freisetzung von freien Radikalen und minimierte die Aktivierung von NF-kB. Die Aktivität der Kinase IKK wurde nicht reduziert, der Anstieg der Aktivität von JNK jedoch komplett inhibiert. Die Freisetzung von TNFa wurde nicht beeinflußt. Als wirksamste Isoform hat sich die zytosolische erwiesen, die extrazelluläre ist nach Überexpression ohne protektive Wirkung. Die Leberregeneration läßt sich nach Transplantation durch SOD-Überexpression massiv anregen und das Organversagen bei kritischer Leberzellmasse vermeiden. Schlußfolgerung: Diese Studie zeigt erstmals die Wirksamkeit einer neuen Strategie zur Organprotektion fur gesunde Lebern und Fettlebern. Die Eliminierung von Sauerstoffradikalen spielt bei der Pathogenese eine Schlüsselrolle. Der adenoviraler Gentransfer von SOD stellt ein gangbares therapeutisches Verfahren für die Zukunft dar, um auch marginale, verfettete Organe vor reperfusionsbedingtem Versagen zu schützen. Dabei ist die zytosolische SOD am effektivsten. Auch bei der Teilleber-Transplantation ist diese Therapieform erfolgversprechend. / Background: Oxygen-derived free radicals play a central role in pathomechanisms of reperfusion injury after organ transplantation, and fatty livers are particularly susceptible. Endogenous radical scavenger systems such as superoxide dismutase (SOD) degrade toxic radicals; however, SOD is degraded rapidly when given exogenously. Therefore, the hypothesis that treatment of the donor liver with an adenoviral vector encoding the Cu/Zn-SOD gene (Ad.SOD1), or the Mn-SOD gene or the ec-SOD gene would lead to permanent gene expression and therefore protect the organ against injury and increase survival in a rat model of liver transplantation including fatty livers was tested. Transplantation of reduced-size livers may lead to a hypermetabolic state and increased production of oxygen radicals. Since oxygen radicals may cause liver injury and impair liver regeneration, we tested the hypothesis that overexpression of superoxide dismutase (SOD) in reduced-size livers (RSL) would accelerate regeneration and reduce injury in a rat model of transplantation of RSL. Methods: Donors received chow diet (untreated), high-fat diet, or ethanol-containing high-fat diet. Some donors were infected with Ad-SOD1, while untreated grafts and livers infected with the indicator gene lacZ encoding bacterial b-galactosidase (Ad.lacZ) served as controls. Some livers were harvested 72 hours later, reduced to 45% of weight, and transplanted. After liver transplantation, SOD activity and protein expression in liver, survival, histopathology, release of transaminases, free radical adducts in bile and activation of NF-kB, IkB kinase (IKK), Jun-N-terminal kinase (JNK) and TNFa were evaluated. Moreover, in transplanted split-livers regeneration was evaluated by Brdu-staining, and measurement of cyclinD1 and p21. Results: Approximately 80% of hepatocytes expressed b-galactosidase 72h after injection of Ad-lacZ. Moreover, SOD1 gene expression and activity were increased 3- and 10-fold in the Ad-SOD1 group, respectively. Following transplantation, 20-25% of rats treated with Ad.lacZ survived. In contrast, all SOD1-treated animals survived. Transaminases measured 8h after transplantation in Ad-SOD1 rats were only 40% of those in controls which increased 40-fold above normal values. Approximately 20% of hepatocytes in untreated and Ad.lacZ-infected organs were necrotic 8h after reperfusion, whereas necrosis was nearly undetectable in grafts from rats treated with Ad.SOD1. Free radical adducts were increased 2-fold in the ethanol group compared to untreated controls. Ad.SOD1 blunted this increase and reduced the activation of NF-kB, which was similar in untreated and ethanol-treated groups. Ad.SOD1 did not affect activity of IKK, but JNK activity was blunted. Release of TNFa was not affected. In recipients of Ad.SOD1-RSL survival was dramatically increased (100% vs. 20% in Ad.lacZ-RSL), and peak levels of AST/ALT and bilirubin levels were reduced by 75% and 87.5%, respectively (p

Der renale Ischämie-/Reperfusionsschaden (IRI) stellt in der Transplantationsmedizin ein grosses Problem dar. Fucoidin, ein potenter Antagonist der Selektin-vermittelten Leukozytenaggregation, verbesserte an der Rattenleber (in einer Konzentration von 360mg/l) das Ausmass der leukozytären Gewebeinfiltration in der frühen Phase nach Ischämie und Reperfusion. In einem Modell der isoliert hämoperfundierten Schweineniere sollte die Wirkung von Fucoidin auf die postischämische Organfunktion untersucht werden. Hierzu wurden 24 Versuche durchgeführt. Dem Blut der Versuchsgruppen wurde vor Beginn der Reperfusion Fucoidin in einer Konzentration von 100 mg/l zugesetzt. Es zeigte sich unter Fucoidin ein signifikanter Abfall des renalen Blutflusses (55 ( 28 vs. 143 ( 97 ml*min-1*100g-1, p / Renal postischemic reperfusion injury constitutes a significant problem after kidney transplantation. The polysaccharide fucoidin (360 mg/l) improves postischemic function in Ratliver, presumably by blocking selectin-mediated leukocyte adhesion. Twelve pairs of ischemic pig kidneys were reperfused in an ex vivo model with autologous blood with or without fucoidin (100 mg/L). Fucoidin resulted in a significant decrease of renal blood flow (55 ( 28 vs. 143 ( 97 mL*min-1*100g-1, p < 0.001) and increased vascular resistance (2.9 ( 2.8 vs. 1.1 ( 1.5 mmHg*mL-1*min-1*100g-1, p < 0.001). Compared to untreated control kidneys significantly more interstitial and intravascular leucocytes were found in fucoidin treated kidneys. Intraglomerular fibrinogen and thrombocytic aggregates were also increased significantly. Granulocytic emboli were present in afferent glomerular arteries of 10/12 fucoidin-treated kidneys and in 2/12 controls (p < 0.001). L-selectin-dependent granulocytic aggregation under shear stress in vitro was prevented by fucoidin in a dose-dependent fashion. However similar concentrations used in reperfused kidneys caused large granulocytic aggregates. The observed formation of embolizing granulocytic aggregates indicates limited effectiveness of fucoidin as an inhibitor of selectin-mediated leukocyte adhesion.

Diese Arbeit befasst sich tierexperimentell und klinisch mit Aspekten der Nierenfunktion bei der Behandlung angeborener Herzfehler. Von Patientenseite sind das Neonatal- und Säuglingsalter und ab der Adoleszenz eine chronische Zyanose, von Behandlungsseite Röntgenkontrastmittelgaben, Dauer, Blutviskositätsänderungen und Kreislaufstillstand am kardiopulmonalen Bypass Risikofaktoren. Cortikosteroidgaben, Optimierung von Blutviskosität und Hydratation sowie eine prophylaktische Peritonealdialyse sind Ansätze zur Behandlung eines Nierenschadens. Die Ergebnisse zeigen, dass Verbesserungen der Plasmaviskosität Nierenschäden am hypothermen kardiopulmonalen Bypass vermindern während eine Cortikosteroidgabe vor Kreislaufstillstand bei Ferkeln nicht nephroprotektiv wirkt. Bei Risikopatienten erweist sich der prophylaktische Einsatz einer Peritonealdialyse als günstig. Bei chronisch zyanotischen Patienten mit einer Glomerulopathie und einem erhöhtem Risiko für Röntgenkontrastmittelexposition und kardiopulmonale Byppassoperationen muss der Nierenstatus die Operationsplanung und postoperative Therapie beeinflussen. Nephroprotektion und Verbesserungsmöglichkeiten der Blutviskosität am kardiopulmonalen Bypass müssen weiter untersucht werden. / This work focusses on clinical aspects of kidney function in the treatment of congenital heart disease. Neonates and infants as well as adolescents with cyanosis may be especially at risk. Contrast agents, duration, blood viscosity changes, and circulatory arrest in cardiopulmonary bypass may be risk factors. Corticosteroids, optimized blood viscosity and hydration, and early onset of peritoneal dialysis are considerations of treatment. Our results demonstrate a reduction of renal damage with optimized plasma viscosity during hypothermia in cardiopulmonary bypass, while corticosteroids have no advantage in young pigs after circulatory arrest. Prophylactic treatment with peritoneal dialysis has advantages in patients at risk. In chronicly cyanotic patients with glomerulopathy the risk of contrast agents and cardiopulmonary bypass is elevated. Thus, renal status should influence operative procedures and postoperative treatment. The possibilities of nephroprotection and improvement of blood viscosity should be further evaluated.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von intraepithelialen Lymphozyten (IEL), oxidativem Streß und endogenen Schutzmechanismen bei GvHR, Dünndarmtransplantation, Sepsis, Morbus Crohn sowie intestinalem Ischämie/Reperfusionsschaden (I/RS) analysiert. Die Bestimmung der phänotypischen und funktionellen Charaktistika der IEL im Rahmen der o. g. Erkrankungen wies auf eine Selektion bestimmter T-Zell Subpopulationen in der Darmschleimhaut hin. Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß IEL nicht nur als Effektorzellen zur mukosalen Barrierefunktion beitragen, sondern auch regulierende Funktionen bei weiteren Abwehrmechanismen der Darmschleimhaut, wie z.B. der NOS-2 Expression besitzen. Die Untersuchungen zum intestinalen I/RS zeigten eine Gewebeschädigung nicht nur im Darm sondern auch der Leber nach selektiver intestinaler Ischämie. Dabei konnte in beiden Organen oxidativer Streß als ein Faktor der Gewebeschädigung nachgewiesen werden. Bei der Modulation des I/RS durch Gabe von Zytokinen konnte eine Zunahme des I/RS durch Gabe von IL-10 und eine Abnahme des I/RS durch IL-2 erreicht werden. Der positive Effekt der IL-2 Gabe war von einer verstärkten und verlängerten NOS-2 mRNA Expression sowie einer gesteigerten NO-Freisetzung begleitet. Im Gegensatz dazu fehlte nach IL-10 Gabe die Zunahme der NOS-2 Epxression ebenso wie ein Anstieg der NO-Metabolite im Serum. Die verminderte NO-Produktion könnte somit den negativen Effekt des anti-inflammatorischen IL-10 auf den I/RS erklären. / In this study, the role of intraepithelial lymphocytes (IEL) was analyzed in Graft-versus-Host disease, small bowel transplantation, sepsis and inflammatory bowel disease. Furthermore, the influence of oxidative stress and endogenous protective mechanisms on the development of intestinal ischemia/reperfusion injury was determined. The phenotypic and functional characteristics of IEL in these diseases indicated that only specific T-cell subsets selectively migrate and/or survive in the intestinal mucosa. In addition, it was demonstrated that IEL display several functions in the intestinal barrier system: they are cytolytic effector cells, but do also exert regulatory functions on the expression of mucosal host defense mechanisms such as NOS-2 expression. The investigations on intestinal ischemia / reperfusion injury revealed that selective intestinal ischemia induces tissue injury not only in the intestine, but in the liver as well. In both organs, oxidative stress plays a predominant role in the development of tissue destruction. Modulation of I/RS by administration of cytokines lead to increased tissue damage after IL-10 administration and reduced tissue injury after IL-2 administration. The beneficial effect of IL-2 may have been due to an increased NOS-2 mRNA expression and the subsequently increased NO production. In contrast, IL-10 administration failed to induce an increased NOS-2 mRNA expression or NO production in the intestine and liver.