Os praguicidas organofosforados (OPs) são amplamente utilizados na indústria química e na agricultura em todo o mundo. Muitos deles são potenciais causadores da \"Neuropatia Retardada Induzida por Organofosforados\" (NRIOP), caracterizada pela degeneração distal de axônios do sistema nervoso central e periférico (degeneração do tipo Walleriana). O praguicida triclorfom (dimetil 2,2,2-tricloro-1-hidroxietil fosfonato) tem sido utilizado em larga escala na produção agrícola e também no controle de vetores transmissores de várias doenças. Há relatos de efeitos neuropáticos em seres humanos expostos ao triclorfom, mas apesar disso, o seu potencial neuropático e seus mecanismos de neurotoxicidade ainda não foram elucidados. Assim, no presente estudo foram avaliados os mecanismos de toxicidade do praguicida OP triclorfom utilizando linhagem SH-SY5Y de neuroblastoma humano como modelo, e também foram avaliados possíveis agentes neuroprotetores em células tratadas com o bem estabelecido indutor da neuropatia mipafox. Foram utilizados como possíveis neuroprotetores: a amilorida e nimodipino (bloqueadores de canais de cálcio tipo T e L respectivamente), MDL 28170 (inibidor (III) de calpaína) e liraglutida (um agonista do \"glucagon like peptide\" -GLP-1). Foram usados o mipafox, como modelo de indução da NRIOP e o paraoxon, como modelo não indutor da NRIOP. Os ensaios de inibição e reativação da esterase susceptível à neuropatia (ESNp) e de citotoxicidade mostraram que somente o mipafox e o triclorfom apresentaram inibição e envelhecimento da ESNp superiores a 70% em concentrações com baixa toxicidade, condição compatível com a indução da NRIOP. A ativação das calpaínas foi observada apenas no tratamento com mipafox, efeito este inibido pela nimodipina, amilorida e pelo MDL 28170. Triclorfom e o mipafox causaram elevação significativa nos níveis de cálcio intracelular e da caspase-3, além de inibir significativamente o crescimento de neuritos. Os três OPs avaliados foram capazes de diminuir a captação da glicose, que foi aumentada nos grupos tratados com mipafox associado com neuroprotetores. As quatro substâncias utilizadas como possíveis neuroprotetoras reduziram significativamente o dano causado pelo mipafox sobre os neuritos. O modelo usado no estudo mostrou-se apropriado para a caracterização dos OP neuropáticos, pois permitiu a diferenciação dos efeitos do mipafox (neuropático) e do paraoxon (não-neuropático). Os dados obtidos indicam que o triclorfom tem potencial indutor de NRIOP, e a amilorida, nimodipino liraglutida e MDL apresentaram potencial neuroprotetor / Organophosphorus (OP) pesticides are widely used in the chemical industry and agriculture around the world. \"Organophosphate Induced Delayed Neuropathy\" (OPIDN) is characterized by distal degeneration of axons of the central and peripheral nervous system (Wallerian-type degeneration). The OP trichlorfom (dimethyl 2,2,2-trichloro-1-hydroxyethyl phosphonate) has been used in large scale in agricultural production and also for the control of vectors that are transmitter of diseases. There are reports of neuropathic effects in humans exposed to trichlorfon, but despite this, its neuropathic potential and mechanisms of neurotoxicity have not yet been elucidated. Thus, in the present study we evaluated the mechanisms of toxicity of trichlorfom and possible neuroprotective agents in SH-SY5Y human neuroblastoma cells treated with the well-established neuropathy inducer mipafox. The following neuroprotective agents were used: amyloride and nimodipine (T and L-type calcium channel blockers, respectively), MDL 28170 (calpain inhibitor (III) and liraglutide (a \"glucagon-like peptide\" - GLP-1 agonist). Mipafox was used as neuropathic OP and paraoxon was used as a non-neuropathic OP. Inhibition and reactivation assays of neurpathy target esterase (NTE) and cytotoxicity showed that only mipafox and trichlorfon showed inhibition and aging of 70% of the NTE in concentrations that presented low toxicity, consistent with development of OPIDN. Activation of calpain was observed only in the treatment with mipafox, an effect inhibited by nimodipine, amyloride and MDL 28170. Triclorfom and mipafox caused significant increase in the levels of intracellular calcium, caspase-3 and significantly inhibiting neurite growth. All three OPs assessed in this work caused a decrease in glucose uptake, which was increased in groups treated whith mipafox plus neuroprotectors. Substances used as possible neuroprotective agents significantly reduced the inhibitory effect of mipafox on neurite outgrowth. The model used in the study proved to be appropriate for characterizing neuropathic OPs, because it allowed a differentiation of the effects of mipafox (neuropathic) and paraoxon (non-neuropathic). The data obtained indicate that trichlorfonm has potential in cause OPIDN. Amiloride, nimodipine, MDL and liraglutide have presented potential neuroprotective effects

La espectroscopía de absorción transitoria ha resultado ser una herramienta útil para investigar la formación y desaparición de estados excitados singlete formados por aniquilación triplete-triplete, tras sensibilización. De este modo, tras excitar selectivamente BZP a 355 nm en presencia de NPT, se detectó mediante espectroscopía de absorción transitoria una banda negativa centrada a 340 nm, cuya formación y desaparición ocurría en la escala de los microsegundos. Esta banda fue asignada como fluorescencia retardada tipo P de NPT. En el caso de sistemas BZP/NPT quirales, se observó estereodiferenciación en las cinéticas de los procesos fotofísicos implicados. Se ha profundizado en el comportamiento del estado excitado triplete de pseudopéptidos basados en naftaleno en presencia de benzofenona y/o bifenilo, como cromóforos dadores de energía. Este comportamiento ha sido comparado con el del compuesto modelo DMN. En todos los casos, la absorción triplete-triplete de NPT se ha detectado por espectroscopía de absorción transitoria, tras excitación selectiva de benzofenona a 355 nm. Las cinéticas de desaparición y formación de estas especies resultaron ser menores en los PSP, debido a que son más lentos los procesos de transferencia de energía tripletetriplete y formación de exciplejos. La fluorescencia retardada detectada en el modelo de naftaleno no fue observada en los PSP. Se han estudiado las interacciones entre FBP y dThd unidos covalentemente, formando diadas (S)- o (R)-FBP-dThd. En ellas, la única especie que emisora fue 1 FBP*, pero con rendimientos cuánticos y tiempos de vida de fluorescencia menores que los del FBP libre en disolución. Estos resultados indican una desactivación dinámica debida a una transferencia electrónica o formación de exciplejo, donde FBP es la especie dadora de carga. En acetonitrilo, ambos mecanismos resultaron favorables, mientras que en dioxano predominó la formación de exciplejo. El enantiómero (S)- presentó valores más bajos de ¿F y ¿F que su análogo (R)- indicando que la disposición espacial de ambos cromóforos desempeñaba un papel importante. El rendimiento cuántico de triplete de las diadas resultó ser mayor que el esperado únicamente a partir de los ¿CIS de 1 FBP*-dThd, siendo ¿T ((S)-) > ¿T ((R)-). Este hecho se pudo explicar debido a una recombinación de carga del par de iones radicales y/o exciplejos, que podrían depender de factores geométricos. El tiempo de vida de las diadas resultó ser similar al del FBP libre, indicando ausencia de interacción en el estado excitado triplete. Con el propósito de estudiar las interacciones fármaco/proteína se sintetizaron diadas conteniendo un derivado de bifenilo unido covalentemente a triptófano. En el caso de las diadas FBP-Trp se observó una notable desactivación de la fluorescencia, cuya emisión fue asignada al residuo de Trp. Esta desactivación se asignó a una TESS desde 1 FBP* a Trp que resultó ser muy rápida y estereoselectiva, con una constante de desactivación mayor para el diastereómero (R,S)-FBPTrp. A escalas de tiempo mayores, se observó una desactivación, también estereoselectiva, de la fluorescencia del 1 Trp* debido a una transferencia de electrón y/o la formación de un exciplejo. Para el caso de los sistemas BPOH-Trp, la sustitución de F por OH en FBP produjo una disminución de la ES. La emisión en las diadas fue asignada al residuo de BPOH, este hecho fue debido a una TESS desde el 1 Trp* al BPOH. Se observó una marcada desactivación en las diadas, que resultó ser estereoselectiva, con kD mayor para el diastereómero (S,R)-. La desactivación se explica por transferencia de electrón intramolecular y/o formación de un exciplejo. El diasterómero (S,R)- presentó una conformación plegada que justifica los valores obtenidos de ¿F y ¿F, siendo éstos menores para la diada (S,R)- que para la (S,S)-. El tiempo de vida de las diadas resultó inferior al de BPOH, confirmando que la desactivación de las primeras era de naturaleza dinámica. Por otro lado, se estudiaron las interacciones entre derivados de bifenilo y ASH. En el caso de los sistemas FBP/ASH las cinéticas de desaparición a ¿em = 310 nm revelaron una desactivación dinámica de 1 ASH*, tanto en la escala de picosegundos (FU) como nanosegundos (TCSPC). El proceso de transferencia de energía desde 1 FBP* a la ASH resultó ser estereoselectivo. Las cinéticas de desaparición a ¿em = 380 nm, donde únicamente emite la proteína, también fueron dependientes de la configuración de FBP, aunque en menor medida. La desactivación puede ser debida a una transferencia electrónica y/o formación de exciplejo. Se ha caracterizado fotofísicamente BPOH en ausencia de proteína; el espectro de emisión de fluorescencia en medio acuoso presentó dos bandas, una a 332 nm correspondiente a 1 BPOH* y otra a 414 nm correspondiente al 1 (BPOH- )*. En presencia de ASH se detectó la formación de un complejo BPOH@ASH en el estado fundamental (máximo a ca. 300 nm), cuya intensidad se veía aumentada a concentraciones más elevadas de proteína. Tras adición de ASH se observó una disminución de la banda de emisión del fenolato (a ¿em ca. 410 nm), confirmando la inhibición de la desprotonación en el estado excitado dentro de la cavidad hidrofóbica de la proteína. Tras adición de (S)-IBP, como sonda desplazante del sitio II de la ASH la banda correspondiente al complejo BPOH@ASH disminuyó significativamente; en cambio, reapareció la banda correspondiente al fenolato. También se observó una gran estereodiferenciación tanto en la formación del complejo en el estado fundamental como en la desprotonación en el estado excitado. En el espectro de absorción transitoria del BPOH se observó una banda centrada a 380 nm correspondiente a su estado excitado triplete; en presencia de ASH el tiempo de vida del mismo aumentó de 1.3 a 19 µs; en este caso no se observó diastereodiferenciación. / Bonancía Roca, P. (2012). Especies transitorias en sistemas bioorgánicos modelo conteniendo cromóforos de tipo bifenilo, naftaleno o benzofenona [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/27553