Despite haemolytic anaemia being the main consequence of Babesia rossi infection in dogs, the bone marrow response has been reported to be mild in the face of severe anaemia. A similar finding has been described in falciparum malaria and has been ascribed to either a decreased production of erythroid precursors or an inability of erythroid precursors to respond to hormonal stimulus. Recently, more information has become available on the use of various reticulocyte indices in an attempt to describe and explain the underlying pathogenesis of various anaemias as their release describes the recent functional state of the bone marrow. The objective of this study was to compare the admission absolute reticulocyte count (ARC) and reticulocyte indices in dogs naturally infected with B. rossi with dogs suffering from immune-mediated haemolytic anaemia (IMHA), unrelated to babesiosis, as well as healthy control dogs. The ARC and reticulocyte indices were also evaluated in five experimentally B. rossi infected dogs throughout the disease course. This was a retrospective observational study looking at the records generated on a haematology analyser, the ADVIA 2120 (Siemens, Munich, Germany). The haematocrit (HCT), ARC and other reticulocyte indices for 103 dogs, naturally infected with B. rossi was compared to 16 dogs with IMHA and 14 control dogs. The experimentally infected dogs consisted of five purpose-bred beagles that were infected with high and low dose B. rossi parasite inoculum. Differences between groups were assessed using the Mann-Whitney U test, whereas the Friedman’s ANOVA was used to assess the change over time during the disease course in the experimentally infected dogs. The Wilcoxon Signed Ranks test was then used to determine the differences within the experimentally infected groups. The median (IQR) HCT for the Babesia (0.16 L/L; 0.12 – 0.27; P < 0.001) and IMHA (0.15 L/L; 0.12 – 0.17; P < 0.001) groups were significantly lower than the control group (0.52 L/L; 0.45 – 0.57). For the Babesia and IMHA groups the HCT did not differ significantly. Compared to the control group (42.1 x109/L; 33.8 – 62.6), the median (IQR) ARC was significantly higher in the Babesia (82.1 x109/L; 48.6 – 174.9; P = 0.006) and IMHA (256.7 x109/L; 79.0 – 436.9; P = 0.004) groups. The ARC was significantly lower in the Babesia group compared to the IMHA group (P = 0.011), despite no significant difference for HCT between groups. On day four of the experimentally infected group, approximately 24 – 48 hours after a peripheral parasitaemia was observed, there was a sudden decrease in the ARC to less than its value on day one, which was inappropriate for the degree of anaemia observed. The reticulocytes of B. rossi naturally infected dogs were larger and more hypochromic with a greater difference in cellular haemoglobin (CH) between reticulocytes and mature erythrocytes compared to the control group, whereas the reticulocytes of the experimentally infected dogs were smaller and more hypochromic than day one of infection. All reticulocyte indices demonstrated significant differences on day four compared to day one of the experimental study. The changes noted in the reticulocyte indices are postulated to be a contribution of anaemia of inflammation (AID), shift reticulocytosis and iron-restricted erythropoiesis. This study concludes that the regenerative response in dogs naturally infected with B. rossi is inappropriate, despite the severity of anaemia observed, compared to dogs with IMHA. Furthermore, the findings of the experimentally group may indicate a possible direct suppressive action of the Babesia parasite on the bone marrow during the time of parasitaemia, resulting in insufficient erythropoiesis. Similar findings have been reported in falciparum malaria and other factors will require further investigation. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2020. / Companion Animal Clinical Studies / MSc / Unrestricted

Não consta resumo na publicação. / Abstract not available.

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Allt mer forskning kring digitala bildanalysplattformar sker då de har visat lika bra eller bättre prestation än existerande manuella och automatiserade metoder samt effektiviserat handläggningstiden för patientprov. Nyligen har företaget CellaVision utvecklat ett prototypprogram som via bildanalys kan räkna och klassificera retikulocyter. Syftet med studien var att jämföra noggrannheten och precisionen av CellaVisions prototypprogram för retikulocytnumrering med manuell mikroskopering och en automatiserad cellräknare. Totalt 40 blodutstryk tillverkades av 20 blodprov med abnormala värden retikulocyter (&gt;2,5%) och 20 med normala värden retikulocyter (0,5-2,5%). Blodutstryken analyserades med prototypprogrammet, manuell mikroskopering och den automatiserade cellräknaren varpå retikulocytkoncentrationen för respektive resultat jämfördes med Pearsons korrelationstest och Bland-Altmananalys. Blodutstryk tillverkades av tre nivåer retikulocytkontroller och analyserades flertal gånger med prototypprogrammet vars retikulocytkoncentration jämfördes med andra metoders retikulocytkoncentrationer. Samma blodutstryk analyserades med olika antal inskannade celler för att utvärdera hur variationen påverkades. Resultaten från komparabilitetsstudien visade att prototypprogrammet erhöll en utmärkt korrelation och en god överensstämmelse med de andra metoderna. Precisionsstudien visade att prototypprogrammet erhöll konsekventa retikulocytkoncentrationer vid repeterade analyser och en låg variationskoefficient (0,25-10%) vid högre antal inskannade celler vid tre olika nivåer av retikulocytkontroller. Resultaten visar CellaVisions prototypprogram designat för retikulocyträkning erhåller en god noggrannhet och en hög precision vid jämförelse med manuell mikroskopering och en automatiserad cellräknare, dock behöver större studier utföras då antalet patientprov var begränsade. / More and more research on digital image analysis platforms is taking place as they have shown to have as good or better performance than existing manual and automated methods and have also streamlined the processing time for patient samples. Recently, the company CellaVision has developed a prototype program that can enumerate and classify reticulocytes via image analysis. The purpose of the study was to compare the accuracy and precision of CellaVision's prototype program for reticulocyte numbering with manual microscopy and an automated cell counter. A total of 40 blood smears were made from 20 blood samples with abnormal reticulocyte values (&gt;2,5%) and 20 with normal reticulocyte values (0,5-2,5%). The blood smears were analysed with the prototype program, manual microscopy, and the automated cell counter, after which the reticulocyte concentration for each result was compared with Pearson's correlation test and Bland-Altman analysis. Blood smears were made by three levels of reticulocyte controls and analysed several times with the prototype program whose reticulocyte concentration was compared with the other methods' reticulocyte concentrations. The same blood smears were analysed with different numbers of scanned cells to evaluate how the variation was affected. The results of the comparability study showed that the prototype program obtained an excellent correlation and a good agreement with the other methods. The precision study showed that the prototype program obtained consistent reticulocyte concentrations in repeated assays and a low coefficient of variation (0,25-10%) in higher numbers of scanned cells at three different levels of reticulocyte controls. The results showed the CellaVision's prototype program designed for reticulocyte counting obtained good accuracy and high precision when compared with manual microscopy and an automated cell counter, however, larger studies need to be performed as the number of patient samples was limited.

Einleitung: Eisenmangel ist ein häufiges Problem bei Ausdauersportlern, da dieser die Leistungsfähigkeit einschränken und zu einer Blutanämie führen kann. Von den klassischen Eisenstoffwechselparametern sind nur wenige geeignet, den tatsächlichen Eisenstatus anzuzeigen, da sie durch sportliche Aktivität per se beeinflusst werden können. In der Studie wird die Wertigkeit moderner Eisenstoffwechselparameter im Ausdauersport untersucht. Ergebnisse und Diskussion: Der Hämoglobingehalt der Retikulozyten (CHr) und der prozentuale Anteil der hypochromen Erythrozyten (% HYPO) bleiben als moderne Parameter der Eisenstoffwechseldiagnostik auch nach regenerativen, extensiven sowie intensiven Ausdauerbelastungen konstant. Sie zeigen somit unbeeinflusst von der (Ausdauer-)Sportart als auch von der Belastungsdauer und –intensität die aktuelle Eisenversorgung der Erythropoese im Knochenmark an. Als Monitoringparameter im Rahmen einer Eisensubstitution sind der CHr sowie der prozentuale Anteil hypochromer Retikulozyten sensible Parameter, mit denen sich schnell und zuverlässig die Effektivität einer oralen Eisensubstitution nachweisen lässt. Der Eisenstatus kann durch die alleinige Bestimmung des CHr bzw. des % HYPO nicht exakt ermittelt werden. Im Gegensatz zum Einsatz bei klinischen Fragestellungen können sie zu diesem Zeitpunkt in der Sportmedizin allenfalls nur ein ergänzender Parameter in der Differentialdiagnostik eines Eisenmangels sein. Die für Ausdauersportler ermittelten Referenzwerte liegen bei 28,8-35,9 pg für den CHr und bei 0-0,5 % für die hypochromen Erythrozyten. Ein belastungsbedingter Anstieg des Eisen-regulierenden Hormons Hepcidin könnte auf Grund seiner inhibitorischen Wirkung auf die intestinale Eisenabsorption sowie auf die Freisetzung von Eisen aus den Makrophagen zur Entwicklung von Eisenmangel-zuständen führen. Die Entwicklung von Hepcidin-Antagonisten könnte in Zukunft therapeutische Anwendungen finden. / Introduction: Athletes are commonly diagnosed with iron deficiency, particularly those involved in endurance sports. It often not only decreases athletic performance but also contributes to the development of anaemia. Many biochemical markers are used to evaluate body iron stores but some of them are affected by physical exercises. This study was designed to investigate new haematological parameters in endurance athletes. Results and discussion: Reticulocyte hemoglobin content (CHr) and percentage of hypochromic red cells (% HYPO) were highly stable in athletes subjected to varying physical loads. Furthermore, they were neither affected by different forms of endurance sports nor by their duration and intensity. These modern indices are able to reflect the availability of iron during erythropoiesis at all times. In the early prediction of response to oral iron supplementation, the reticulocyte indices CHr and % HYPOr (percentage of hypochromic reticulocytes) are the most sensitive parameters. However, it is not possible to assess the iron status in athletes by CHr and % HYPO alone. In contrast to other clinical cases they can only be an additional parameter in the differential diagnosis of iron deficiency. The calculated reference range for endurance athletes are 28,8 - 35,9 pg for CHr and 0-0,5 % for % HYPO. As the iron-regulating hormone hepcidin is inhibiting the absorption of iron from the diet at the site of the duodenal enterocytes and blocking the release of iron from macrophages that have collected senescent erythrocytes, an exercise induced up-regulation of hepcidin activity might potentially be a new mechanism causing iron deficiency in athletes. Therefore, the development of hepcidin antagonists could prove to be helpful with regard to therapeutic utilization.

Das Problem des Missbrauchs von Erythropoietin (EPO) als Dopingsubstanz zur Steigerung der Ausdauerleistung wurde schlagartig weltweit durch den Skandal zur Tour de France 1998 bekannt. Das Internationale Olympische Komitee (IOC) führte ab 1992 Erythropoietin explizit auf der Liste der verbotenen Wirkstoffe auf, ohne des es möglich war zwischen den rekombinantem und dem körpereigene Erythropoietin zu unterscheiden. Bei der im Institut für Dopinganalytik und Sportbiochemie Kreischa durchgeführten Arbeit wurden zwei generelle Strategien verfolgt: zum einen ein indirekter Nachweis des rhEPO, basisierend auf dessen Auswirkungen auf die Erythropoese, und zum anderen der direkte Nachweis des Unterschieds zwischen rekombinantem und humanem Erythropoietin. In der ersten durchgeführten Populationsuntersuchung von 229 Leistungssportlern konnte bei der Auswertung der Daten lediglich eine signifikante Erhöhung des löslichen Transferrinrezeptors (sTfR) bei den Ausdauerathleten gefunden werden, während sich die hämatologischen Parameter nicht unterschieden. In der anschließenden Verlaufsuntersuchung von Ausdauerathleten des Deutschen Leichtathletikverbandes wurden zusätzlich zu den bereits in der Populationsstudie untersuchten Parametern erstmalig von Hochleistungs-athleten Retikulozyten und deren Reifeparameter untersucht. Bei den Hochleistungs-sportlern konnten, insbesondere für die Retikulozyten-parameter, über den Zeitraum der Studie konstante Werte gefunden werden. Die Untersuchung der zirkadianen Rhythmik zeigte lediglich für den Parameter Erythropoietin einen signifikante Veränderung mit einem Maximum in den späten Abendstunden (20:00 bis 23:00 Uhr) erreichte. Die Untersuchung der Variation der indirekten Parameter über den Zeitraum eines Jahres zeigte, dass im Gegensatz zu der Verlaufsuntersuchung der DLV-Athleten, bei der der längste Untersuchungs-zeitraum sechs Monate betrug, eine Veränderung aller Parameter, mit Ausnahme von Erythropoietin, bestand. Bei der Auswertung der Belastungsstudien wurde für die gut trainierten Athleten nur ein geringer Einfluss auf die hämatologischen Parameter gefunden, während bei einigen Retikulozytenparametern signifikante Erhöhungen durch die Belastung festgestellt werden konnten. Mit der Etablierung der direkten Nachweismethode für EPO im Urin und der Anpassung der ursprünglichen Methode an das neue Präparat ARANESP, ein modifiziertes EPO, änderte sich die Aufgabenstellung für die indirekten Parameter, da es ab sofort möglich war eine große Anzahl Proben unter Verwendung von niedrigeren Grenzwerten zu screenen. Anhand der Werte der weltbesten Ausdauerathleten wurden allgemein gültige Grenzwerte und eine globale Strategie für ein Screening aufgestellt. Bei einem auffälligen Befund würde in jedem Fall die korrespondierende Urinprobe mittels der direkten Methode untersucht und erst mit dem Nachweis des rekombinanten Erythropoietins als positiv bewertet werden. Zusätzlich zu den indirekten Parametern wurden Untersuchungen hinsichtlich des direkten Nachweis, d. h. der Anreicherung von Erythropoietin und einer massenspektrometrischen Analyse einzelner Glykanketten, durchgeführt, bei denen mit der Kombination Nanospray und TOF-MS die notwendigen Nachweisgrenzen erreicht werden konnten. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass ausgewählter Blutparameter sehr gut geeignet sind, um als Screeningmethode für erythropoesesteigernde Substanzen zu dienen. Im Gegensatz zur Methode des direkten Nachweises von EPO im Urin, die durch die Verfügbarkeit der Referenzsubstanzen limitiert ist, bietet der indirekte Nachweis über Blutparameter den Vorteil, Veränderungen des erythropoetischen Systems, verursacht durch neue Substanzen oder Methoden, erfassen zu können.

Das Problem des Missbrauchs von Erythropoietin (EPO) als Dopingsubstanz zur Steigerung der Ausdauerleistung wurde schlagartig weltweit durch den Skandal zur Tour de France 1998 bekannt. Das Internationale Olympische Komitee (IOC) führte ab 1992 Erythropoietin explizit auf der Liste der verbotenen Wirkstoffe auf, ohne des es möglich war zwischen den rekombinantem und dem körpereigene Erythropoietin zu unterscheiden. Bei der im Institut für Dopinganalytik und Sportbiochemie Kreischa durchgeführten Arbeit wurden zwei generelle Strategien verfolgt: zum einen ein indirekter Nachweis des rhEPO, basisierend auf dessen Auswirkungen auf die Erythropoese, und zum anderen der direkte Nachweis des Unterschieds zwischen rekombinantem und humanem Erythropoietin. In der ersten durchgeführten Populationsuntersuchung von 229 Leistungssportlern konnte bei der Auswertung der Daten lediglich eine signifikante Erhöhung des löslichen Transferrinrezeptors (sTfR) bei den Ausdauerathleten gefunden werden, während sich die hämatologischen Parameter nicht unterschieden. In der anschließenden Verlaufsuntersuchung von Ausdauerathleten des Deutschen Leichtathletikverbandes wurden zusätzlich zu den bereits in der Populationsstudie untersuchten Parametern erstmalig von Hochleistungs-athleten Retikulozyten und deren Reifeparameter untersucht. Bei den Hochleistungs-sportlern konnten, insbesondere für die Retikulozyten-parameter, über den Zeitraum der Studie konstante Werte gefunden werden. Die Untersuchung der zirkadianen Rhythmik zeigte lediglich für den Parameter Erythropoietin einen signifikante Veränderung mit einem Maximum in den späten Abendstunden (20:00 bis 23:00 Uhr) erreichte. Die Untersuchung der Variation der indirekten Parameter über den Zeitraum eines Jahres zeigte, dass im Gegensatz zu der Verlaufsuntersuchung der DLV-Athleten, bei der der längste Untersuchungs-zeitraum sechs Monate betrug, eine Veränderung aller Parameter, mit Ausnahme von Erythropoietin, bestand. Bei der Auswertung der Belastungsstudien wurde für die gut trainierten Athleten nur ein geringer Einfluss auf die hämatologischen Parameter gefunden, während bei einigen Retikulozytenparametern signifikante Erhöhungen durch die Belastung festgestellt werden konnten. Mit der Etablierung der direkten Nachweismethode für EPO im Urin und der Anpassung der ursprünglichen Methode an das neue Präparat ARANESP, ein modifiziertes EPO, änderte sich die Aufgabenstellung für die indirekten Parameter, da es ab sofort möglich war eine große Anzahl Proben unter Verwendung von niedrigeren Grenzwerten zu screenen. Anhand der Werte der weltbesten Ausdauerathleten wurden allgemein gültige Grenzwerte und eine globale Strategie für ein Screening aufgestellt. Bei einem auffälligen Befund würde in jedem Fall die korrespondierende Urinprobe mittels der direkten Methode untersucht und erst mit dem Nachweis des rekombinanten Erythropoietins als positiv bewertet werden. Zusätzlich zu den indirekten Parametern wurden Untersuchungen hinsichtlich des direkten Nachweis, d. h. der Anreicherung von Erythropoietin und einer massenspektrometrischen Analyse einzelner Glykanketten, durchgeführt, bei denen mit der Kombination Nanospray und TOF-MS die notwendigen Nachweisgrenzen erreicht werden konnten. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass ausgewählter Blutparameter sehr gut geeignet sind, um als Screeningmethode für erythropoesesteigernde Substanzen zu dienen. Im Gegensatz zur Methode des direkten Nachweises von EPO im Urin, die durch die Verfügbarkeit der Referenzsubstanzen limitiert ist, bietet der indirekte Nachweis über Blutparameter den Vorteil, Veränderungen des erythropoetischen Systems, verursacht durch neue Substanzen oder Methoden, erfassen zu können.