Foamyviren enthalten vier zentrale purinreiche Sequenzen, die Elemente A bis D. Bekannt sind solche auch bei anderen Retroviren, u.a. bei HIV, wo der cPPT (central polypurine tract) für eine effektive Replikation benötigt wird und eine Kopie des 3´PPT darstellt. Bei FV ist nur das Element D sequenzidentisch zum 3´PPT, welcher sich bei allen Retroviren findet und von welchem die Plusstrang-Synthese bei der Bildung der cDNA intiiert wird. Vermutet wurde daher für das Element D, das es einen zweiten Initiationsort für die Plusstrang-Synthese darstellt und analog zum cPPT bei HIV die Replikation zu beschleunigen vermag. Um die Funktion der purinreichen Sequenzen zu verstehen, führten wir Mutationen in die Elemente A bis D ein und untersuchten sie im infektiösen Volllängenklon sowie im Vektorkontext; zusätzlich analysierten wir die viralen Proteine in infizierten Zellen und Viruspartikeln. / Foamy viruses contain four central purine-rich sequences, namely element A, B, C and D. Such sequences are also known in other retroviruses, for example in HIV, which harbours a cPPT (central polypurine tract) that is needed for effective replication and is an exact copy of the 3´PPT. In FV only element D is a copy of the 3´PPT, which is essential for reverse transcription as it is the initiation site for plus strand DNA synthesis. Therefore, element D is thought to serve as a second initiation site for plus strand DNA synthesis in order to accelerate viral replication. We mutated the four purine-rich elements and analysed them in vector and infectious virus context to determine their role; furthermore we investigated viral protein production in infected cells and viral particles.

Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. Für ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 &#181;g Hybridisierungstarget benötigt. Dazu müssen entweder 15 - 20 &#181;g RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpräparationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu lösen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer Lösungsansatz gesucht wurde.<br> In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden können: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize.<br><br> Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfläche. Diese Möglichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv.<br><br> In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden für die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung über Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde für amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberflächen sowie für EDC-Kopplung auf silanisierten Oberflächen gezeigt. Für die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10&#181;M schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern während der PCR ermöglicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zusätzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu können.<br><br> Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode für den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet. / The detection of low quantities of mRNA is often difficult and methods like microarray analysis require large amount of starting material or have to be amplified before application. The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is often the chosen method to detect specific RNA sequences on account of its high sensitivity. The solid phase amplification technology by On-Chip-PCR provides a combination of amplification of rare target material and its on chip detection in one step.<br><br> In this report a novel application for the On-Chip-PCR technology is described. It was suitable to identify mRNA sequences and genes, respectively. For this approach we amplified cDNA sequences using immobilized specific primers and fluorescent labeled primers. They were used for genes coding subunits of the mouse muscle acetylcholine receptor (Chrna1, Chrnb1, Chrnd) and the genes coding for myogenin (Myog), muscle creatine kinase (Ckmm) and Atpase (Atp2a2). The cDNA templates were synthesized before the On-Chip application by Reverse Transcription from mRNA. For this application only at most 500 pg of total-RNA preparation was sufficient for detectable results and no pre-amplification steps were needed.<br><br> Furthermore the handling of RT-PCR could be minimized by using a One-step- RT-PCR protocol. This method used immobilized primers on glassy supports detecting specific mRNA sequences from 5 pg or less of total RNA preparations.<br> Moreover to the detection of low quantities of RNA preparation, low abundant genes could be detected by this method.

Aim: To develop an immunomagnetic assay for the isolation of circulating tumor cells (CTCs) followed by the analysis of a multimarker panel, which will enable the characterization of these malignant cells with high accuracy. Patients and Methods: Peripheral blood (PB) was collected from 32 metastatic breast cancer patients and 42 negative controls. The antibodies BM7 and VU1D9 were used for immunomagnetic tumor cell enrichment. A real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) approach for the markers KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 and ERBB2 was used for CTC detection and characterization. Results: The positivity rates for each marker were as follows: 46.9% for KRT19, 25.0% for SCGB2A2, 28.1% for MUC1, 28.1% for EPCAM, 21.9% for BIRC5, and 15.6% for ERBB2. After the creation of individualized cutoffs, the sensitivity and specificity of the combined marker gene panel increased to 56.3% and 100%, respectively. Interestingly, 27.0% of the HER2-negative tumor patients showed ERBB2 mRNA-positive CTCs. Conclusions: The described technique can be used to measure CTCs with great accuracy. The use of a multimarker panel for the characterization of CTCs may provide real-time information and be of great value in therapy monitoring. / Ziel: Entwicklung eines immunomagnetischen Verfahrens zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) in Kombination mit einer molekularen Multimarkeranalyse für die hochspezifische Identifizierung maligner Zellen. Patientinnen und Methoden: Peripheres Blut (PB) von 32 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom und von 42 gesunden Kontrollen wurde für die immunomagnetische Tumorzellanreicherung mit den Antikörpern BM7 und VU1D9 genutzt. Eine Real-Time Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)-Methodik mit den Markern KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 und ERBB2 wurde für den CTC-Nachweis und die Tumorzellcharakterisierung entwickelt. Ergebnisse: Für die einzelnen Marker wurden die folgenden Positivitätsraten ermittelt: 46,9% für KRT19, 25,0% für SCGB2A2, 28,1% für MUC1, 28,1% für EPCAM, 21,9% für BIRC5 und 15,6% für ERBB2. Nach der Bestimmung individualisierter Cut-off-Werte ergab sich für den kombinierten Multimarkernachweis eine Sensitivität und Spezifität von 56,3% bzw. 100%. Bemerkenswert war der Befund, dass 27,0% der HER2-tumornegativen Patientinnen ERBB2-mRNA-positive CTCs aufwiesen. Schlussfolgerung: Die hier beschriebene Methodik bestimmt CTCs mit hoher Spezifität. Die molekulare Multimarkeranalyse liefert wertvolle Real-Time-Informationen für personalisierte Behandlungsmodalitäten. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Aim: To develop an immunomagnetic assay for the isolation of circulating tumor cells (CTCs) followed by the analysis of a multimarker panel, which will enable the characterization of these malignant cells with high accuracy. Patients and Methods: Peripheral blood (PB) was collected from 32 metastatic breast cancer patients and 42 negative controls. The antibodies BM7 and VU1D9 were used for immunomagnetic tumor cell enrichment. A real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) approach for the markers KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 and ERBB2 was used for CTC detection and characterization. Results: The positivity rates for each marker were as follows: 46.9% for KRT19, 25.0% for SCGB2A2, 28.1% for MUC1, 28.1% for EPCAM, 21.9% for BIRC5, and 15.6% for ERBB2. After the creation of individualized cutoffs, the sensitivity and specificity of the combined marker gene panel increased to 56.3% and 100%, respectively. Interestingly, 27.0% of the HER2-negative tumor patients showed ERBB2 mRNA-positive CTCs. Conclusions: The described technique can be used to measure CTCs with great accuracy. The use of a multimarker panel for the characterization of CTCs may provide real-time information and be of great value in therapy monitoring. / Ziel: Entwicklung eines immunomagnetischen Verfahrens zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) in Kombination mit einer molekularen Multimarkeranalyse für die hochspezifische Identifizierung maligner Zellen. Patientinnen und Methoden: Peripheres Blut (PB) von 32 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom und von 42 gesunden Kontrollen wurde für die immunomagnetische Tumorzellanreicherung mit den Antikörpern BM7 und VU1D9 genutzt. Eine Real-Time Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)-Methodik mit den Markern KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 und ERBB2 wurde für den CTC-Nachweis und die Tumorzellcharakterisierung entwickelt. Ergebnisse: Für die einzelnen Marker wurden die folgenden Positivitätsraten ermittelt: 46,9% für KRT19, 25,0% für SCGB2A2, 28,1% für MUC1, 28,1% für EPCAM, 21,9% für BIRC5 und 15,6% für ERBB2. Nach der Bestimmung individualisierter Cut-off-Werte ergab sich für den kombinierten Multimarkernachweis eine Sensitivität und Spezifität von 56,3% bzw. 100%. Bemerkenswert war der Befund, dass 27,0% der HER2-tumornegativen Patientinnen ERBB2-mRNA-positive CTCs aufwiesen. Schlussfolgerung: Die hier beschriebene Methodik bestimmt CTCs mit hoher Spezifität. Die molekulare Multimarkeranalyse liefert wertvolle Real-Time-Informationen für personalisierte Behandlungsmodalitäten. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.