Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) has an extremely poor prognosis. To improve the prognosis, novel molecular markers and targets for earlier diagnosis and adjuvant and/or neoadjuvant treatment are needed. Recent advances in human genome research and high-throughput molecular technologies make it possible to cope with the molecular complexity of malignant tumors. With DNA array technology, mRNA expression levels of thousand of genes can be measured simultaneously in a single assay. As several studies using microarrays in PDAC have already been published, this review attempts to compare the published data and therefore to validate the results. In addition, the applied techniques are discussed in the context of pancreatic malignancies. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

This thesis was performed within the research project “TrophinOak”, which addresses the impact of multitrophic interactions on the pedunculate oak (Quercus robur) clone DF159. In this frame, the present work focuses on the genetic and physiological mechanisms ruling the interaction of the mycorrhiza helper bacterium (MHB) Streptomyces sp. AcH 505 with microcuttings of DF159 either alone or in presence of the ectomycorrhizal fungus Piloderma croceum or the fungal leaf pathogen oak powdery mildew Microsphaera alphitoides. The work consists of 3 chapters. Chapter 1 characterises the growth of AcH 505 and P. croceum in a soil-based culture system used within the TrophinOak project. Besides the establishment and evaluation of quantification methods of these microorganisms by quantitative real-time PCR, the impact of the soil microbial community and the oak on the bacterium-fungus interaction was investigated, and AcH 505 and P. croceum were visualized by scanning electron microscopy. It was observed that the presence of the soil microorganisms and the oak both affect the bacterium-fungus interaction, and that P. croceum enhances the growth of AcH 505. Chapter 2 presents a study with the oak, AcH 505 and the EM fungus P. croceum, enabling to disentangle the direct effect of the MHB on the oak from the indirect one via the EM symbiosis. The used approach was transcriptomic based on RNA sequencing. It was shown that i) differential gene expression occurred between root and the distant leaf tissues (local vs. systemic effects), different developmental stages and treatments, suggesting that oak specifically coordinates its gene expression patterns, and ii) that genes related to plant growth, defence and DNA modification were dominant among the differential expressed genes, suggesting that these processes play essential roles in both symbiotic interactions investigated. Chapter 3 represents a second transcriptome study, addressing how AcH 505 suppresses powdery mildew infection in oak by analysing RNA Sequencing data from singly- and coinoculated oaks. This study combined the systemic impact of the root associated bacterium with local effects of the leaf pathogen, thereby linking belowground and aboveground interactions. Systemic defence response is induced by the bacterium and further enhanced upon pathogen challenge, suggesting that on the leaf level, some bacterial effectors are recognized as harmful for the plant.

Nach der Eradikation der humanen Pockenerkrankung stellen zoonotische Orthopockenvirus-(OPV-)Infektionen heute eine mögliche Bedrohung der öffentlichen Gesundheit dar. Hierbei sind insbesondere Kuhpocken-(CPXV), Affenpocken-(MPXV) und Vaccinia Viren (VACV) von Bedeutung. In dieser Arbeit wurde das Genexpressionsprofil humaner (HeLa) Zellen nach Infektion mit CPXV, MPXV oder VACV untersucht. Es wurden sowohl zelluläre Gene identifiziert, welche generell von allen verwendeten Viren reguliert wurden, als auch Gene, die eine Virus-spezifische Regulation durch individuelle OPV aufwiesen. Gemeinsamkeiten zeigten sich insbesondere zwischen CPXV und MPXV, welche, im Gegensatz zu VACV, die Expression zahlreicher Cytokine und Chemokine induzierten. Insbesondere für Interleukin-6, -8 und CXCL1 konnte auch auf Proteinebene eine gesteigerte Sekretion durch CPXV-infizierte Zellen nachgewiesen werden. Vermutlich aufgrund dieser Induktion, trat in vitro eine verstärkte Rekrutierung von Monozyten und Makrophagen in Folge einer CPXV-, nicht aber einer VACV-Infektion auf. Makrophagen spielen eine kontroverse Rolle im Rahmen einer OPV-Infektion und sind sowohl für deren Bekämpfung, als auch, im infizierten Zustand, für die Ausbreitung der Viren im Organismus von Bedeutung. Daher wurde die Replikationsfähigkeit von CPXV und VACV in Makrophagen charakterisiert. Der Virulenzfaktor p28, welcher von den meisten VACV Stämmen nicht kodiert wird, konnte als essentiell für die Replikation von CPXV in einer murinen Makrophagen-Zelllinie, primären peritonealen Makrophagen der Ratte und in Makrophagen aus primären humanen PBMCs identifiziert werden. In Anbetracht der Bedeutung der Replikationsfähigkeit in Makrophagen für die Ausbreitung einer OPV-Infektion im Wirtsorganismus, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass CPXV, im Fall einer weiteren Adaption an den Menschen, ein höheres Bedrohungspotential im Vergleich zu VACV aufweisen könnten. / Today, following the eradication of human smallpox, zoonotic infections caused by orthopoxviruses (OPV) are emerging as a potential human health threat. Especially cowpox viruses (CPXV), vaccinia viruses (VACV), and monkeypox viruses (MPXV) are gaining importance as a cause of infectious disease of man and livestock. This study aimed to analyse and compare the gene expression profile of human (HeLa) cells following infection with CPXV, MPXV or VACV. Cellular genes were identified which were either commonly modulated by infection with any of the three viruses, or which were specifically modulated by one individual OPV. Particularly similar effects on cellular gene expression were observed in the case of CPXV and MPXV infection, which both induced the expression of several cytokine and chemokine genes. Especially interleukin-6, -8, and CXCL1 were strongly secreted by CPXV-infected cells but not by VACV-infected cells. Consequently, CPXV infection also induced a strong chemotactic recruitment of monocytes and macrophages in vitro in contrast to VACV infection. Especially macrophages are known to play a controversial role during OPV infection. On the one hand, macrophages are of importance for the control of the infection. On the other hand, infected macrophages also facilitate virus spread across the organism. Therefore, the capability of CPXV and VACV to replicate in macrophages was analysed. Thereby, the poxviral virulence factor p28, which is absent from most strains of VACV, was identified as an essential factor, allowing CPXV replication in a murine macrophage cell line, primary peritoneal rat macrophages and in human PBMC-derived macrophages. Concerning the importance of productively infected macrophages for OPV spread, these results suggest that CPXV, if further adapted to human beings as host species, may harbor a greater threat to human health when compared to VACV.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) has an extremely poor prognosis. To improve the prognosis, novel molecular markers and targets for earlier diagnosis and adjuvant and/or neoadjuvant treatment are needed. Recent advances in human genome research and high-throughput molecular technologies make it possible to cope with the molecular complexity of malignant tumors. With DNA array technology, mRNA expression levels of thousand of genes can be measured simultaneously in a single assay. As several studies using microarrays in PDAC have already been published, this review attempts to compare the published data and therefore to validate the results. In addition, the applied techniques are discussed in the context of pancreatic malignancies. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

This thesis was performed within the research project “TrophinOak”, which addresses the impact of multitrophic interactions on the pedunculate oak (Quercus robur) clone DF159. In this frame, the present work focuses on the genetic and physiological mechanisms ruling the interaction of the mycorrhiza helper bacterium (MHB) Streptomyces sp. AcH 505 with microcuttings of DF159 either alone or in presence of the ectomycorrhizal fungus Piloderma croceum or the fungal leaf pathogen oak powdery mildew Microsphaera alphitoides. The work consists of 3 chapters. Chapter 1 characterises the growth of AcH 505 and P. croceum in a soil-based culture system used within the TrophinOak project. Besides the establishment and evaluation of quantification methods of these microorganisms by quantitative real-time PCR, the impact of the soil microbial community and the oak on the bacterium-fungus interaction was investigated, and AcH 505 and P. croceum were visualized by scanning electron microscopy. It was observed that the presence of the soil microorganisms and the oak both affect the bacterium-fungus interaction, and that P. croceum enhances the growth of AcH 505. Chapter 2 presents a study with the oak, AcH 505 and the EM fungus P. croceum, enabling to disentangle the direct effect of the MHB on the oak from the indirect one via the EM symbiosis. The used approach was transcriptomic based on RNA sequencing. It was shown that i) differential gene expression occurred between root and the distant leaf tissues (local vs. systemic effects), different developmental stages and treatments, suggesting that oak specifically coordinates its gene expression patterns, and ii) that genes related to plant growth, defence and DNA modification were dominant among the differential expressed genes, suggesting that these processes play essential roles in both symbiotic interactions investigated. Chapter 3 represents a second transcriptome study, addressing how AcH 505 suppresses powdery mildew infection in oak by analysing RNA Sequencing data from singly- and coinoculated oaks. This study combined the systemic impact of the root associated bacterium with local effects of the leaf pathogen, thereby linking belowground and aboveground interactions. Systemic defence response is induced by the bacterium and further enhanced upon pathogen challenge, suggesting that on the leaf level, some bacterial effectors are recognized as harmful for the plant.

Aim: To develop an immunomagnetic assay for the isolation of circulating tumor cells (CTCs) followed by the analysis of a multimarker panel, which will enable the characterization of these malignant cells with high accuracy. Patients and Methods: Peripheral blood (PB) was collected from 32 metastatic breast cancer patients and 42 negative controls. The antibodies BM7 and VU1D9 were used for immunomagnetic tumor cell enrichment. A real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) approach for the markers KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 and ERBB2 was used for CTC detection and characterization. Results: The positivity rates for each marker were as follows: 46.9% for KRT19, 25.0% for SCGB2A2, 28.1% for MUC1, 28.1% for EPCAM, 21.9% for BIRC5, and 15.6% for ERBB2. After the creation of individualized cutoffs, the sensitivity and specificity of the combined marker gene panel increased to 56.3% and 100%, respectively. Interestingly, 27.0% of the HER2-negative tumor patients showed ERBB2 mRNA-positive CTCs. Conclusions: The described technique can be used to measure CTCs with great accuracy. The use of a multimarker panel for the characterization of CTCs may provide real-time information and be of great value in therapy monitoring. / Ziel: Entwicklung eines immunomagnetischen Verfahrens zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) in Kombination mit einer molekularen Multimarkeranalyse für die hochspezifische Identifizierung maligner Zellen. Patientinnen und Methoden: Peripheres Blut (PB) von 32 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom und von 42 gesunden Kontrollen wurde für die immunomagnetische Tumorzellanreicherung mit den Antikörpern BM7 und VU1D9 genutzt. Eine Real-Time Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)-Methodik mit den Markern KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 und ERBB2 wurde für den CTC-Nachweis und die Tumorzellcharakterisierung entwickelt. Ergebnisse: Für die einzelnen Marker wurden die folgenden Positivitätsraten ermittelt: 46,9% für KRT19, 25,0% für SCGB2A2, 28,1% für MUC1, 28,1% für EPCAM, 21,9% für BIRC5 und 15,6% für ERBB2. Nach der Bestimmung individualisierter Cut-off-Werte ergab sich für den kombinierten Multimarkernachweis eine Sensitivität und Spezifität von 56,3% bzw. 100%. Bemerkenswert war der Befund, dass 27,0% der HER2-tumornegativen Patientinnen ERBB2-mRNA-positive CTCs aufwiesen. Schlussfolgerung: Die hier beschriebene Methodik bestimmt CTCs mit hoher Spezifität. Die molekulare Multimarkeranalyse liefert wertvolle Real-Time-Informationen für personalisierte Behandlungsmodalitäten. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

T-Helfer-9-(Th9-)Zellen produzieren große Mengen Interleukin-(IL-)9 und lösen bei Wurm- und Tumorerkrankungen protektive Immunantworten aus. Sie sind aber auch maßgeblich an der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt. Im Widerspruch zu diesen entzündungsauslösenden Eigenschaften steht ihre Rolle bei der Erzeugung von Toleranz gegenüber allogenen Transplantaten. Diese gegensätzlichen inflammatorischen Eigenschaften deuten eine bisher nicht untersuchte funktionelle Heterogenität an. In vitro-differenzierte allo-reaktive Th9-Zellen zeigten sich in ihrer Gesamtheit pro-inflammatorisch. Dies äußerte sich nach Transfer in recombination activating gene-defiziente (Rag-/-) Mäuse durch einen akut einsetzenden Gewichtsverlust mit intestinaler Entzündung und durch die Abstoßung allogener Hauttransplantate. Mittels Einzelzell-Genexpressionsanalyse wurden zwei Th9-Subpopulationen identifiziert, die sich vor allem in ihrer CD96-Expression unterschieden (CD96low versus CD96high Th9-Zellen). Die differenzielle Expression von CD96 spiegelte sich auch im inflammatorischen Potenzial der Zellen wider. Während der Transfer von CD96low Th9-Zellen in Rag-/- Mäuse einen Gewichtsverlust mit Darmentzündung sowie die Transplantatzerstörung verursachte, zeigten CD96high-rekonstituierte Tiere kaum Entzündungsanzeichen im Transplantat bzw. im Darm. Dementsprechend verloren sie auch kein Gewicht. Es zeigte sich, dass CD96low Th9-Zellen ein höheres Potenzial zur Produktion von IL-4 und IL-9 sowie zur Expansion besaßen als CD96high Th9-Zellen. Eine Blockade von CD96 in vivo stellte die inflammatorischen Eigenschaften von CD96high Th9-Zellen wieder her, wodurch die funktionelle Relevanz der CD96-Expression unterstrichen wurde. Diese Daten belegen, dass es sich bei Th9-Zellen um eine funktionell heterogene Zellpopulation handelt. Weiterhin zeigen sie, dass CD96 – ein Molekül mit bislang unklarer Funktion in CD4+ T-Zellen – die Aktivität von Th9-Zellen negativ beeinflusst. / T helper 9 (Th9) cells are potent producers of interleukin(IL-)9 driving host immunity against worm infections and tumors. Furthermore, they are predominantly involved in the pathogenesis of chronic inflammatory bowel diseases. However, they also induce tolerance in allogeneic transplantation, which contrasts with their pro-inflammatory properties. These observations indicate a functional heterogeneity of Th9 cells not examined so far. Total in vitro differentiated allo-reactive Th9 cells injected into recombination activating gene-deficient (Rag-/-) mice caused weight loss, intestinal inflammation and rejection of allogenic skin grafts which proofed their inflammatory character. However, using single cell profiling, two subsets of Th9 cells mainly differing in their CD96 expression were identified (CD96low versus CD96high Th9 cells). Transfer of CD96low Th9 cells into Rag-/- mice induced severe weight loss, intestinal inflammation and graft destruction. In contrast, transfer of CD96high Th9 cells did cause neither weight loss nor resulted in graft rejection. Transcriptional profiling revealed a higher IL-9 and IL-4 expression potential as well as an increased expansion capacity in CD96low Th9 cells compared to CD96high Th9 cells. Blockade of CD96 in vivo restored the inflammatory properties of CD96high Th9 cells demonstrating, that expression of CD96 controls effector functions in Th9 cells. Thus, Th9 cells are heterogeneous in function. Moreover, this study suggests an inhibitory role for the co-signaling receptor CD96 – a molecule with so far unknown function in CD4+ T cells – in Th9 cells.

Aim: To develop an immunomagnetic assay for the isolation of circulating tumor cells (CTCs) followed by the analysis of a multimarker panel, which will enable the characterization of these malignant cells with high accuracy. Patients and Methods: Peripheral blood (PB) was collected from 32 metastatic breast cancer patients and 42 negative controls. The antibodies BM7 and VU1D9 were used for immunomagnetic tumor cell enrichment. A real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) approach for the markers KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 and ERBB2 was used for CTC detection and characterization. Results: The positivity rates for each marker were as follows: 46.9% for KRT19, 25.0% for SCGB2A2, 28.1% for MUC1, 28.1% for EPCAM, 21.9% for BIRC5, and 15.6% for ERBB2. After the creation of individualized cutoffs, the sensitivity and specificity of the combined marker gene panel increased to 56.3% and 100%, respectively. Interestingly, 27.0% of the HER2-negative tumor patients showed ERBB2 mRNA-positive CTCs. Conclusions: The described technique can be used to measure CTCs with great accuracy. The use of a multimarker panel for the characterization of CTCs may provide real-time information and be of great value in therapy monitoring. / Ziel: Entwicklung eines immunomagnetischen Verfahrens zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) in Kombination mit einer molekularen Multimarkeranalyse für die hochspezifische Identifizierung maligner Zellen. Patientinnen und Methoden: Peripheres Blut (PB) von 32 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom und von 42 gesunden Kontrollen wurde für die immunomagnetische Tumorzellanreicherung mit den Antikörpern BM7 und VU1D9 genutzt. Eine Real-Time Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)-Methodik mit den Markern KRT19, SCGB2A2, MUC1, EPCAM, BIRC5 und ERBB2 wurde für den CTC-Nachweis und die Tumorzellcharakterisierung entwickelt. Ergebnisse: Für die einzelnen Marker wurden die folgenden Positivitätsraten ermittelt: 46,9% für KRT19, 25,0% für SCGB2A2, 28,1% für MUC1, 28,1% für EPCAM, 21,9% für BIRC5 und 15,6% für ERBB2. Nach der Bestimmung individualisierter Cut-off-Werte ergab sich für den kombinierten Multimarkernachweis eine Sensitivität und Spezifität von 56,3% bzw. 100%. Bemerkenswert war der Befund, dass 27,0% der HER2-tumornegativen Patientinnen ERBB2-mRNA-positive CTCs aufwiesen. Schlussfolgerung: Die hier beschriebene Methodik bestimmt CTCs mit hoher Spezifität. Die molekulare Multimarkeranalyse liefert wertvolle Real-Time-Informationen für personalisierte Behandlungsmodalitäten. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.