Les rhabdomyolyses correspondent à la destruction de fibres musculaires striées squelettiques et mettent en jeu le pronostic vital. La principale cause génétique est liée à un défaut d’oxydation des acides gras ; néanmoins, plus de la moitié des cas n’ont pas de cause identifiée. En 2008, des mutations du gène LPIN1 ont été rapportées comme une nouvelle étiologie de rhabdomyolyse de transmission autosomique récessive. La protéine lipin1 a une double fonction : un rôle de PAP1 intervenant dans la synthèse du triacylglycérol et des phospholipides membranaires ; un rôle de co-activateur transcriptionnel en association avec les PPARs et PGC1α pour réguler de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme, dont certains de l’OAG. Lipin1 a deux homologues, lipin2 et lipin3, qui possèdent une activité PAP1 et un site de fixation à des récepteurs nucléaires tels que les PPARs. Nous avons montré que les mutations de LPIN1 rendent compte de plus de 50% des cas de rhabdomyolyse sévère de la petite enfance, une fois écarté le diagnostic de déficit de l’OAG. Une délétion intragénique en phase a été fréquemment identifiée chez les Caucasiens. Nous avons montré qu’il s’agissait d’un probable effet fondateur et que cette délétion est délétère. En effet, à l’inverse de la forme normale de lipin1, la forme délétée est incapable de complémenter la levure pah1, déficiente pour l’homologue de LPIN1. Nous avons ensuite étudié, dans une série de 171 patients, l’implication de LPIN1 dans des pathologies musculaires moins sévères, ainsi que le rôle des deux homologues LPIN2 et LPIN3. Les mutations de LPIN1 sont impliquées dans les rhabdomyolyses sévères et précoces uniquement et les accès de rhabdomyolyse ont toujours un facteur déclenchant, le principal étant les infections aiguës fébriles. Aucune altération majeure de LPIN2 et de LPIN3 n’a été identifiée, même dans des phénotypes modérés. Enfin, nous avons cultivé des myoblastes et des myotubes de patients avec mutations de LPIN1 afin d’étudier les mécanismes de rhabdomyolyse. Les myoblastes déficients en lipin1 ont une activité PAP1 très diminuée et une accumulation de gouttelettes lipidiques. Le niveau d’expression des gènes cibles des facteurs de transcription co-activés par lipin1 (PPARδ, PPARα, PGC1α, ACADVL, CPT1B and CPT2) sont inchangés par rapport aux contrôles, alors que le niveau de lipin2 est augmenté. L’analyse transcriptomique sur cultures de myotubes a identifié chez les patients 19 gènes sous-exprimés et 51 sur-exprimés, notamment ACACB, qui code pour Accβ, enzyme clé de la balance synthèse d’acides gras/OAG. L’invalidation d’ACACB par siRNA dans des myoblastes déficients en lipin1 diminue le nombre de gouttelettes lipidiques, confirmant le lien entre la sur-expression d’ACACB et l’accumulation d’acides gras libres chez les patients. Cependant, le taux de malonyl-CoA, produit d’Accβ, et l’activité CPT1 (étape limitatrice de l’OAG, inhibée par le malonyl-CoA), sont comparables entre myoblastes de patients et de contrôles. Néanmoins, le traitement des cultures par l’association de tumor necrosis factor alpha et d’interleukine-1 β, choisis pour simuler les conditions pro-inflammatoires des infections aiguës, entraîne une augmentation encore plus poussée du taux de malonyl-CoA, une diminution de l’activité CPT1 et une augmentation de l’accumulation de gouttelettes lipidiques chez les patients. Au total, nos données placent LPIN1 comme une cause importante de rhabdomyolyse héréditaire. Le déficit en lipin1 entraine une perturbation du métabolisme lipidique, via une sur-expression d’ACACB, qui est exacerbée en conditions pro-inflammatoires. Nos résultats suggèrent que les conséquences du déficit en lipin1 sont compensées par des mécanismes d'adaptation suffisants en condition normale, mais insuffisants pour la demande métabolique induite par des stress environnementaux comme l'infection, conduisant aux rhabdomyolyses. / Rhabdomyolyses correspond to the destruction of skeletal muscular fibers and are possibly life-threatening. The main genetic cause is linked to defects of fatty acid oxidation (FAO) ; nevertheless, half of the cases have no identified aetiology. In 2008, mutations of LPIN1 gene have been reported as a new cause of autosomal recessive rhabdomyolysis. Lipin1 protein has a double function : 1) a role of phosphatidate phosphatase 1 (PAP1) involved in synthesis of triacylglycerol and membrane phospholipids ; 2) a role of transcriptional co-activator which regulates, in association with the PPARs (peroxysome-proliferator activated receptor) and PGC1α (PPARγ-coactivator1α), numerous genes involved in the metabolism including some genes encoding FAO enzymes. Lipin1 has got two homologues, lipin2 and lipin3, which have a PAP1 activity and a binding site for nuclear receptors, such as the PPARs. We have shown that LPIN1 mutations account for more than 50% of the cases of severe rhabdomyolysis of early infancy, when FAO defects have been excluded. An intragenic in frame deletion has been frequently identified in Caucasians. We have shown that it probably comes from a founding effect and that this deletion is deleterious. Unlike normal lipin1, deleted lipin1 protein is unable to complement the Δpah1 yeast which is defective for the yeast LPIN1 homolog. In a series of 171 patients, we have further studied the involvement LPIN1 in less severe muscular diseases, as well as the role of the two homologues LPIN2 and LPIN3. LPIN1 mutations are involved only in severe and early rhabdomyolyses and the bouts of rhabdomyolysis always have a triggerring factor, mainly acute febrile infections. No major alteration of LPIN2 and LPIN3 has been identified, even in milder phenotypes. Eventually, we have cultivated myoblasts and myotubes of patients with LPIN1 mutations in order to study the mechanisms of the rhabdomyolysis. Lipin1-deficient myoblasts have a drastically decreased PAP1 activity and an accumulation of lipid droplets. The expression level of target genes of the transcription factors co-activated by lipin1 (PPARδ, PPARα, PGC1α, acyl-Coenzyme A very long chain dehydrogenase (ACADVL), carnitine palmitoyl-transferase 1B and 2 (CPT1B and CPT2)) are similar to controls, whereas the level of lipin2 is increased. Transcriptomic analysis of myotube cultures have identified in patients 19 under-expressed genes and 51 over-expressed ones, notably ACACB, which encodes Accβ (acetyl-CoA carboxylase β), key enzyme of the balance between fatty acid synthesis and FAO. ACACB invalidation by siRNA in lipin1-deficient myoblasts decreases the number of lipid droplets, comforting the link between ACACB over-expression and free fatty acid accumulation in patients. However, the level of malonyl-CoA, product of Accβ, and CPT1 activity (limitative step of FAO, inhibited by malonyl-CoA), are similar between myoblasts of patients and controls. But treatment of the cultures with an association of tumor necrosis factor α and interleukin-1 β (TNFα + IL-1β), chosen for mimicking pro-inflammatory conditions of acute infections, leads to a further increase of the level of malonyl-CoA, a decrease of CPT1 activity and an increase of lipid droplets accumulation in patients. In total, our data show that LPIN1 is an important cause of inherited rhabdomyolysis. Lipin1 deficiency leads to a disturbance of the lipidic metabolism, via ACACB over-expression, which is exacerbated in pro-inflammatory conditions. Our results suggest that the consequences of lipin1 deficiency are counterbalanced by adaptative mechanisms which are sufficient at basal state, but insufficient for the metabolic request induced by environmental stresses, such as infections, leading to the rhabdomyolyses. Next step is the study of adipose tissue and the establishment of the inflammatory signature of the patients, in order to determine if this new disease is an auto-inflammatory pathology.

Les rhabdomyolyses correspondent à la destruction de fibres musculaires striées squelettiques et mettent en jeu le pronostic vital. La principale cause génétique est liée à un défaut d'oxydation des acides gras ; néanmoins, plus de la moitié des cas n'ont pas de cause identifiée. En 2008, des mutations du gène LPIN1 ont été rapportées comme une nouvelle étiologie de rhabdomyolyse de transmission autosomique récessive. La protéine lipin1 a une double fonction : un rôle de PAP1 intervenant dans la synthèse du triacylglycérol et des phospholipides membranaires ; un rôle de co-activateur transcriptionnel en association avec les PPARs et PGC1α pour réguler de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme, dont certains de l'OAG. Lipin1 a deux homologues, lipin2 et lipin3, qui possèdent une activité PAP1 et un site de fixation à des récepteurs nucléaires tels que les PPARs. Nous avons montré que les mutations de LPIN1 rendent compte de plus de 50% des cas de rhabdomyolyse sévère de la petite enfance, une fois écarté le diagnostic de déficit de l'OAG. Une délétion intragénique en phase a été fréquemment identifiée chez les Caucasiens. Nous avons montré qu'il s'agissait d'un probable effet fondateur et que cette délétion est délétère. En effet, à l'inverse de la forme normale de lipin1, la forme délétée est incapable de complémenter la levure pah1, déficiente pour l'homologue de LPIN1. Nous avons ensuite étudié, dans une série de 171 patients, l'implication de LPIN1 dans des pathologies musculaires moins sévères, ainsi que le rôle des deux homologues LPIN2 et LPIN3. Les mutations de LPIN1 sont impliquées dans les rhabdomyolyses sévères et précoces uniquement et les accès de rhabdomyolyse ont toujours un facteur déclenchant, le principal étant les infections aiguës fébriles. Aucune altération majeure de LPIN2 et de LPIN3 n'a été identifiée, même dans des phénotypes modérés. Enfin, nous avons cultivé des myoblastes et des myotubes de patients avec mutations de LPIN1 afin d'étudier les mécanismes de rhabdomyolyse. Les myoblastes déficients en lipin1 ont une activité PAP1 très diminuée et une accumulation de gouttelettes lipidiques. Le niveau d'expression des gènes cibles des facteurs de transcription co-activés par lipin1 (PPARδ, PPARα, PGC1α, ACADVL, CPT1B and CPT2) sont inchangés par rapport aux contrôles, alors que le niveau de lipin2 est augmenté. L'analyse transcriptomique sur cultures de myotubes a identifié chez les patients 19 gènes sous-exprimés et 51 sur-exprimés, notamment ACACB, qui code pour Accβ, enzyme clé de la balance synthèse d'acides gras/OAG. L'invalidation d'ACACB par siRNA dans des myoblastes déficients en lipin1 diminue le nombre de gouttelettes lipidiques, confirmant le lien entre la sur-expression d'ACACB et l'accumulation d'acides gras libres chez les patients. Cependant, le taux de malonyl-CoA, produit d'Accβ, et l'activité CPT1 (étape limitatrice de l'OAG, inhibée par le malonyl-CoA), sont comparables entre myoblastes de patients et de contrôles. Néanmoins, le traitement des cultures par l'association de tumor necrosis factor alpha et d'interleukine-1 β, choisis pour simuler les conditions pro-inflammatoires des infections aiguës, entraîne une augmentation encore plus poussée du taux de malonyl-CoA, une diminution de l'activité CPT1 et une augmentation de l'accumulation de gouttelettes lipidiques chez les patients. Au total, nos données placent LPIN1 comme une cause importante de rhabdomyolyse héréditaire. Le déficit en lipin1 entraine une perturbation du métabolisme lipidique, via une sur-expression d'ACACB, qui est exacerbée en conditions pro-inflammatoires. Nos résultats suggèrent que les conséquences du déficit en lipin1 sont compensées par des mécanismes d'adaptation suffisants en condition normale, mais insuffisants pour la demande métabolique induite par des stress environnementaux comme l'infection, conduisant aux rhabdomyolyses.

Akute Nierenschädigung (acute kidney injury, AKI) ist ein häufiger Grund für die Aufnahme auf eine Intensivstation und hat eine hohe Morbidität und Mortalität, insbesondere bei Patienten mit Indikation zur Nierenersatztherapie. In etwa 7-10% wird eine Rhabdomyolyse als mögliche Ursache angegeben. Die rasche Entfernung vom Myoglobin, als direkt renal schädigendes Molekül, erscheint sinnvoll. Allerdings gibt es bisher wenige Daten zur Wirksamkeit einer Nierenersatztherapie bei akuter Nierenschädigung im Rahmen einer Rhabdomyolyse. In dieser prospektiven, randomisierten, einfach verblindeten, monozentrischen Studie wurde erstmalig die Myoglobinclearance bei einer CVVHDF mit „Standard“ high-flux Filter im Postdilutionsmodus (Kontrollarm) mit einer CVVHD mit high-cutoff Filter (Interventionsarm) verglichen. In beiden Gruppen erfolgte die Antikoagulation des extrakorporalen Kreislaufs mit Citrat. Das Ziel der Studie bestand darin, die „Nicht-Unterlegenheit“ des CVVHD-HCO Arms gegenüber des CVVHDF Arms zu zeigen („Non-inferiority design“). Im Rahmen dieser Studie wurden 70 Intensivpatienten mit der Indikation zur kontinuierlichen Nierenersatztherapie eingeschlossen und zu gleichen Teilen in beide Therapiearme randomisiert. Die Patientencharakteristika beider Studienarme unterschieden sich nicht. Die Myoglobin-Clearance war im Interventionsarm durchschnittlich 5.5ml/min (4-7ml/min (95%-Konfidenzintervall), p< 0.0005) höher und damit dem Kontrollarm nicht unterlegen bzw. sogar signifikant überlegen. Ebenso war die Clearance von β2-Mikroglobulin im Interventionsarm signifikant höher. Die Kreatinin- und Harnstoffclearance in den beiden Studienarmen war nach Adjustierung anhand des Dialysegesamtumsatzes gleich. Die Clearance von Interleukin-6 und Albumin während des gesamten Beobachtungszeitraums unterschied sich nicht. Im Vergleich der einzelnen Zeitpunkte war allerdings die Il-6 Clearance nach 1, 6 und 24 Stunden signifikant höher im Interventionsarm. In beiden Studienarmen kam es zu keinem relevanten Albumin-verlust. Die Dialysefilterstandzeit war im Interventionsarm länger, so betrug diese im Kontrollarm: 57.0 [38.0, 72.0] Stunden und im Interventionsarm 70.0 [56.75, 72.0] Stunden (p = 0.029). Frühere Studien zu HCO-Filtern untersuchten häufig β2-Mikroglobulin als Markermolekül für mittleres Molekulargewicht. Die klinische Bedeutung erhöhter β2-Mikroglobulin Spiegel bei akuter Nierenschädigung ist allerdings unklar. Im Gegensatz dazu sind hohe Myoglobin Plasmaspiegel mit akuter Nierenschädigung und einer erhöhten Mortalität assoziiert. Eine rasche und effektive Entfernung dieses nephrotoxischen Moleküls erscheint sinnvoll und ist relevant. Aus diesem Grund wurde in dieser Studie die Myoglobin Clearance bewusst als primärer Endpunkt ausgewählt. Eine gesunde Niere kann deutlich mehr Myoglobin ausscheiden als ein extrakorporales System, weshalb immer der Versuch unternommen werden sollte, die Diurese mit ausreichender Flüssigkeitsgabe zu erhalten. Sollte dennoch eine Nierenersatztherapie notwendig werden, ist aktuell unklar, welches extrakorporale System dafür am besten geeignet ist und ob dies die Erholung der Nierenfunktion oder die Mortalität beeinflussen könnte. Eine bessere Il-6 Clearance im Interventionsarm konnte nur zu Beginn der Dialysebehandlung gezeigt werden. Die Beobachtung einer schlechter werdenden Clearance während zunehmender Behandlungsdauer ist vereinbar mit Ergebnissen anderen Studien. Als Ursache diskutiert werden Proteinablagerungen und Polarisierung am Dialysefilter. Die längere Dialysestandzeit im CVVHD-HCO Arm könnte mit der der Hämokonzentration am Dialysefilter im CVVHDF Arm zusammenhängen. Dieser Effekt wird durch den Postdilutionsmodus verstärkt. Durch das konzentrierte Blut steigt das Risiko der Gerinnselbildung und einer vorzeitigen Verstopfung der Dialysekapillaren. Eine weitere mögliche Erklärung der kürzeren Dialysestandzeit ist die komplexere technische Betreuung einer CVVHDF mit RCA, da unterschiedliche Dialysat- und Substituatlösungen verwendet werden müssen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass durch den Einsatz einer CVVHD mit high cutoff Filter Myoglobin sicher aus der Zirkulation bei Patienten mit akuter Nierenschädigung entfernt werden kann. Die Myoglobin Clearance ist dabei sogar höher als beim Einsatz einer CVVHDF mit high-flux Filter. Besonders blutungsgefährdete oder blutende Patienten mit Rhabdomyolyse und akutem Nierenversagen können vom Einsatz einer CVVHD-HCO unter Nutzung einer regionalen Citratantikoagulation profitieren. Die signifikant längere Dialysefilterstandzeit stellt einen weiteren großen Vorteil des Einsatzes einer CVVHD-HCO dar. Die generierten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern die Basis für die Planung weiterer klinischer Studien. Perspektivisch könnte untersucht werden, ob der Einsatz einer CVVHD-HCO die Prognose bei Patienten mit schwerer akuten Nierenschädigung und Rhabdomyolyse verbessern könnte und zu welchem Zeitpunkt die Nierenersatztherapie begonnen werden sollte.:1. EINFÜHRUNG 4 1.1. Akute Nierenschädigung beim kritisch kranken Patienten 4 1.2. Nierenersatztherapie bei akuter Nierenschädigung 5 1.3. Clearance von Molekülen mit mittlerem Molekulargewicht bei verschieden Nierenersatzverfahren 7 1.4. Renale Schädigung durch Myoglobin 10 1.5. Fragestellung und Studiendesign 12 2. PUBLIKATION 15 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 16 4. LITERATURVERZEICHNIS 19 5. ANHANG 27 5.1. Supplemental Table 1: Dialysis protocol 27 5.2. Supplemental Table 2: Substance specific clearances (ml/min) after 1h and adjustment for TTR 28 5.3. Supplemental Table 3: Substance specific clearances (ml/min) at different time points 29 III. Nachweis über Anteile der Co-Autoren 30 IV. Erklärung über die eigenständige Verfassung der Arbeit 32