Ziel dieser Doktorarbeit war es, eine Verbesserung der Herstellung und Kultivierung von Rho0-Zelllinien zu erreichen. Die bisher notwendige Uridin-Supplementierung sollte durch eine Modifizierung des Zellstoffwechsels, insbesondere der De-novo-Synthese von Pyrimidinen, ersetzt werden. Die membranständige, ubiquinonabhängige Dihydroorotat-Dehydrogenase (DHODH) der Säugetiere wurde durch eine zytsolische DHODH der Hefe S. cerevisiae, die Fumarat als Elektronenakzeptor besitzt, ersetzt. Dazu wurden zunächst mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) das URA-1-Gen der DHODH aus der genomischen DNA von S. cerevisiae amplifiziert. Anschließend wurde das Gen als Insert in den pCR-II-TOPO-Vektor kloniert und vervielfältigt. Dieses Plasmid diente als Ausgangspunkt für die Herstellung verschiedener anderer Vektoren: pDHODH-IRES2-EGFP und pDHODH-IRES2-EGFP-LXRN. Mit Hilfe des Vektors pDHODH-IRES2-EGFP wurden 0 -Zellen der Linie 143B.TK- Rho0 Klon 7 transfiziert und die eingebrachte DHODH auf eventuelle Nebeneffekte, wie z.B. Toxizität für die Kulturzellen, überprüft. Der retrovirale Vektor pDHODH-IRES2-EGFP-LXRN wurde zur Transfektion einer verpackenden Zelllinie, RetroPack TM PT 67, und damit zur Retrovirenproduktion benutzt. Mit den so hergestellten Retroviren wurden dann Zellen der Linie 143B.TK- Rho0 infiziert und die zytosolische DHODH stabil in ihre genomische DNA integriert. Nach dieser Veränderung wurden die Zellen metabolischen Tests unterzogen: Kultivierung in Medium ohne Uridin-Supplementierung, mit Pyruvat-Supplementierung und Kultivierung in uridin- und pyruvat-freiem Medium. Die infizierten Zellen überlebten in uridinfreiem Medium, die Pyruvat-Abhängigkeit blieb allerdings erhalten. Den Zellen wurde also ein neuer atmungsketten-unabhängiger Weg zur Nukleotidsynthese ermöglicht. Im Anschluss an diese Versuche mussten die Kulturzellen noch retrospektiv analysiert werden, um den endgültigen Beweis zu erbringen, dass sie immer noch im Rho0-Zustand waren und die zytosolische DHODH aus S. cerevisiae wirklich enthielten. Zu diesem Zweck wurde die genomische DNA aus den Kulturzellen isoliert und anschließend mittels PCR analysiert. Zur Kontrolle der DHODH-Produktion der Zellen wurde eine RT-PCR angefertigt. Die Kontrolluntersuchungen bestätigten die Ergebnisse der metabolischen Tests. Metabolische Tests, sowie die DNA- und RNA-Analysen zeigen, dass die zytosolische DHODH aus S. cerevisiae mit Hilfe des Retrovirusvektors in das Genom von Rho0-Zellen eingebracht wurde, von dort abgelesen wird und das synthetisierte Enzym funktionsfähig und in genügend großer Menge in der Zielzelle vorhanden ist.

The Hap2/3/4/5 complex is a heme-activated, CCAATT binding, global transcriptional activator of genes involved in respiration and mitochondrial biogenesis in the yeast species Saccharomyces cerevisiae. Hap4 is the regulatory subunit of the complex and its levelsdetermine the activity of the complex. Hap4 is known to play a signaling role in response toenvironmental conditions; however, little is known about the regulation of Hap4 levels or how it responses to a cell’s functional state. The activity of the Hap2-5 complex is known to be reduced in respiratory-deficient cells. In Liu Lab, it has previously been found that a link between Hap4 stability, mediated through 26S proteasome-dependent degradation, and dependence on mitochondrial functional state plays a regulatory role on downstream targets of the Hap complex. However, the mechanism behind this regulation is still largely unknown. In normally functioning yeast cells, Hap4 is a highly unstable protein with a half-life of ~10 min. We have observed that loss of mitochondrial DNA in respiratory deficient rho 0 cells has a role in the further destabilization of Hap4 to a half-life of ~4 min through the ubiquitin-proteasome pathway. Through the screening of a collection of mutants defective in E2 ubiquitin-conjugating enzymes, we show that Hap4 is greatly stabilized in ubc1Δubc4Δ double mutant cells. We also show that Hap4 stabilization in the ubc1Δubc4Δ mutant leads to increased activity of the Hap2-5 complex, indicating that mitochondrial biogenesis in yeast is regulated by the functional state of mitochondria through ubiquitin/proteasome-dependent degradation of Hap4. Furthermore, studies on Hap4 mutants involving two highly conserved cysteine residues led to a proposed mechanism behind the regulation of Ubc4 activity towards Hap4 in response to changes in the cellular redox state.

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