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Caractérisation du complexe jonctionnel de RONs et étude de la contribution de la cellule hôte lors de l’invasion du parasite Toxoplasma gondii / Characterization of the junctional RONs complex and study of the contribution of the host cell during invasion by Toxoplasma gondii parasiteGuérin, Amandine 30 June 2017 (has links)
Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire responsable de la toxoplasmose. Il appartient au phylum des Apicomplexes, qui regroupe les espèces de Plasmodium responsables de la malaria. Les Apicomplexes ont un mécanisme d’invasion unique, impliquant la formation d’une interaction étroite entre la membrane plasmique du parasite et celle de la cellule hôte, appelée « jonction mobile » (MJ). Cette jonction est composée de la protéine AMA1 exposée à la surface du parasite qui interagit avec le complexe de protéines parasitaires RON2/RON4/RON5/RON8 injecté dans la cellule hôte. Les objectifs de ma thèse ont été d’étayer la composition moléculaire de la MJ et d’étudier la contribution de la cellule hôte dans l’invasion au travers de la recherche de partenaires de l’hôte pour les RONs. Quatre protéines de l’hôte, ALIX, TSG101, CD2AP et CIN85, ont été identifiées à la MJ. Les sites d’interactions ont été cartographiés sur RON2, RON4 et RON5. Des parasites mutants déficients pour le recrutement de ces partenaires ont été générés, et ont permis de montrer l’importance de l’association d’ALIX, TSG101, CD2AP et CIN85 à la MJ pour l’invasion de T. gondii et sa virulence dans un modèle murin. Le rôle de ces protéines dans le maintien des jonctions intercellulaires mais aussi leur participation à des processus de déformation membranaire, suggère que le parasite les recrute afin de favoriser son attachement et son internalisation. Nous avons également identifié un nouveau membre du complexe de RONs, appelé RON14. RON14 n’est pas essentielle pour la survie du parasite in vitro mais contribue à sa virulence in vivo. / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite responsible for toxoplasmosis. It belongs to the phylum Apicomplexa, which include Plasmodium species responsible for malaria. Apicomplexa has developed a unique invasion mechanism, involving the formation of a tight connection between the parasite and the host cell plasma membranes called moving junction (MJ). This junction is composed of AMA1 exposed at the surface of the parasite which interacts with a complex of parasite proteins RON2/RON4/RON5/RON8 injected into the host cell. The objectives of my thesis were to decipher the molecular composition of the MJ and to study the contribution of the host cell during invasion though the search of hosts partners for RONs. Four host proteins, ALIX, TSG101, CIN85 and CD2AP, have been identified at the MJ. Binding sites has been mapped on RON2, RON4 and RON5. By generating mutant parasites deficient for host partners recruitment, we show the importance of ALIX, TSG101, CIN85 and CD2AP association at the MJ for invasion and virulence in a mouse model. The role of these proteins in maintaining the intercellular junctions and inducing membrane deformation suggest that the parasite recruits them in order to favor its attachment and its internalization. We also identified a new member of the RON complex, called RON14. RON14 is not essential for the parasite survival in vitro but contributes to its virulence in vivo.
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Caracterização molecular de proteínas de roptrias (ROP15B e ROP55) de Neospora caninum / Molecular characterization of rhoptry proteins (ROP15B and ROP55) from Neospora caninumPaula, Julia Audrey de 19 November 2018 (has links)
Neospora caninum (Apicomplexa) é o agente causador da neosporose, descrita como a principal causa de aborto parasitário em gado bovino .Parasitos desse filo interagem e invadem as células hospedeiras através da secreção coordenada de proteínas do complexo apical, formado por diversas organelas, dentre elas as roptrias (ROPs), que desempenham papel fundamental no processo de infecção, associado à formação do vacúolo parasitóforo (PV), sobrevivência no ambiente intracelular e virulência do parasito. Essas proteínas podem ser caracterizadas em: proteínas de roptrias de pescoço (RONs), e proteínas de roptrias (ROPs). Além disso, algumas ROPs podem se diferenciar e, dessa maneira, constituem uma grande família de quinases e pseudo-quinases, denominada família de roptrias quinase (ROPKs). O objetivo deste estudo foi caracterizar as proteínas de roptrias NcROP15B (NcLIV_011700) e NcROP55 (NcLIV_031550) de N. caninum. As sequências de NcROP15B e NcROP55 foram alinhadas com homólogos de alguns microrganismos, incluindo apicomplexas, ao BLAST. NcROP15B apresentou identidade de 19% com as sequencias de ROP15 de T. gondii e Hammondia hammondi. NcROP55 mostrou identidade de 14% com a ROP37 de T. gondii e com ROP28 de Hammondia hammondi, e 15% com a ROP28 de Neospora caninum. Foram detectados domínios pertencentes à família de proteínas quinase para NcROP15B e NcROP55, e peptídeo sinal apenas para NcROP15B. Os primers foram delineados para amplificar regiões de cDNA de ambos os genes com diferentes tamanhos, denominados NcROP15B maior, NcROP15B menor, NcROP55 maior e NcROP55 menor. Os insertos foram subclonados (pGEM) e posteriormente ligados em plasmídeo de expressão pET28 em E. coli BL21(DE3) e a expressão recombinante induzida por IPTG. As formas recombinantes foram expressas com 30 kDa e 16 kDa (NcROP15B fragmento Maior e Menor, respectivamente) e NcROP55 Maior e Menor gerou um peso molecular de 19.9 kDa e 15 kDa, respectivamente. Após purificação, NcROP15B e NcROP55 foram utilizadas para obtenção de soros policlonais. Anti-ROP15B e anti-ROP55 reagiram com extrato de N. caninum em Western Blot 1D, tendo NcROP15B sido detectada com 35 kDa, próximo ao predito (32 kDa) e NcROP55 com aproximadamente 35 KDa, porém abaixo do predito (47.9 kDa). Na imunofluorescência confocal, NcROP-15B e NcROP55 exibiram padrão de localização na região perinuclear de taquizoítos de N. caninum. Os anticorpos anti-NcROP15B e anti-NcROP55 apresentaram, individualmente, capacidade limitada para inibir o processo de adesão/invasão de N. caninum, sendo 16% e 6,43% respectivamente. Quando os soros anti-NcROP15B e anti-NcROP55 foram associados, a a inibição da invasão aumentou para 62%. As proteínas NcROP-15B e NcROP55 podem representar quinases importantes no metabolismo de N. caninum, e podem estar relacionadas ao processo de invasão e proliferação do parasito. Dessa maneira, são possíveis alvos para se considerar no estudo de medidas preventivas, sendo necessários mais estudos para avaliar suas funções na sobrevivência intracelular e virulência de N. caninum. / Neospora caninum (Apicomplexa) is the causative agent of neosporosis, described as the main responsible of parasitic abortion in cattle. Parasites of this phylum interact and invade the host cells through a coordinated secretion of proteins of the apical complex, formed by organelles like rhoptries, which play a key role in the infection process, associated to the formation of the parasitophorous vacuole (PV), intracellular survival and parasite virulence. These proteins can be characterized in: neck rhoptry proteins (RONs), and rhoptry proteins (ROPs). Some ROPs can differentiate and thus constitute a large family of kinases and pseudo-kinases, called the kinase rhoptry family (ROPKs). The aim of this study was to characterize N. caninum NcROP15B (NcLIV_011700) and NcROP55 (NcLIV_031550) rhoptry proteins. The amino acid sequences of NcROP15B and NcROP55 were aligned with homologous proteins from some microorganisms, including apicomplexan on BLAST. NcROP15B showed a 19% identity with the ROP15 of T. gondii and Hammondia hammondi. NcROP55 had 14% of identity with ROP37 of T. gondii and with ROP28 of Hammondia hammondi, and 15% with ROP28 of Neospora caninum. Domains were detected belonging to the protein kinase family for NcROP15B and NcROP55, and signal peptide only for NcROP15B. Primers were designed to amplify cDNA regions of both genes, opting for fragments of different sizes, names as NcROP15B major, NcROP15B minor, NcROP55 major and NcROP55 minor. The inserts were subcloned (pGEM) and then ligated into pET28 expression plasmid in E. coli BL21 (DE3) and IPTG-induced recombinant expression. The recombinant forms were expressed with 30 kDa and 16 kDa (NcROP15B Major and Minor, respectively) and Major and Minor NcROP55 had molecular weights of 19.9 kDa and 15 kDa, respectively. After purification, NcROP15B and NcROP55 were used to obtain polyclonal serum. Anti-ROP15B and anti-ROP55 reacted with N. caninum extract in Western Blot 1D, with NcROP15B being detected at 35 kDa, near predicted (32 kDa) and NcROP55 at approximately 35 KDa, but below the predicted (47.9 kDa). At confocal immunofluorescence, NcROP-15B and NcROP55 exhibited a localization pattern at the perinuclear region of N. caninum tachyzoites. Anti-NcROP15B and anti-NcROP55 antibodies had, individually, limited ability to inhibit the N. caninum adhesion/invasion process (16 and 6,43%, respectively). When associated, anti-NcROP15B and anti-NcROP55 sera inhibition of invasion increased to 62%. NcROP-15B and NcROP55 proteins might represent important kinases in the metabolism of N. caninum with a possible role in the parasite invasion and proliferation process. Thus, they represent possible targets for preventive measures, but further studies are necessary to evaluate their functions in intracellular survival and virulence of N. caninum.
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Identification de nouvelles protéines régulées différentiellement au cours du cycle cellulaire de Toxoplasma gondii / Identification of new proteins differentially regulated along the cell cycle of Toxoplasma gondiiLentini, Gaëlle 03 June 2015 (has links)
Toxoplasma gondii est un protiste apicomplexe responsable de la toxoplasmose. Ce parasite intracellulaire obligatoire possède des organites sécrétoires apicaux dont les rhoptries qui contiennent des facteurs de virulence essentiels à l'invasion et à la modulation de la cellule hôte qu'il infecte. Au cours de la division cellulaire de T. gondii, les protéines de rhoptries sont synthétisées selon la même cinétique. Dans le but d'identifier de nouvelles protéines dont la fonction est potentiellement liée aux rhoptries, nous avons recherché à partir des bases de données du génome de T. gondii, les protéines présentant ce profil particulier d'expression. La localisation subcellulaire de 12 candidats a été réalisée puis une caractérisation phénotypique de quatre d'entre eux a été entreprise. Nous avons identifié une nouvelle protéase de rhoptries, DegP, essentielle à la virulence du parasite in vivo. Nous montrons que DegP contrôle la phase aigüe de l'infection en modulant la réponse immune de l'hôte contribuant ainsi à la dissémination du parasite in vivo. Nous identifions également deux protéines homologues, Claw1 et Claw2, présentant une localisation atypique à l'extrémité apicale du parasite. Notre incapacité à déléter ces gènes pourrait indiquer un rôle essentiel de ces protéines au niveau du complexe apical de T. gondii. Enfin, bien que n'étant pas reliée aux rhoptries, ce crible a permis d'identifier la première protéine associée aux jonctions des vésicules constituant le complexe membranaire interne de Toxoplasma. La délétion de cette protéine, SIP, affecte la forme du parasite, entrainant un défaut de motilité, d'invasion et de virulence in vivo. / Toxoplasma gondii is an apicomplexan protist and the causative agent of toxoplasmosis. This obligate intracellular parasite harbors apical secretory organelles such as rhoptries that contain essential virulence factors responsible of the invasion and the modulation of the infected host cell. Along the cell cycle of T. gondii, rhoptry proteins share the same timing of expression. In order to identify new proteins involve in rhoptry content, biogenesis or secretion, we screened the genome database of T. gondii to isolate proteins that present this particular profile. We obtained the subcellular localization of 12 candidates and we investigated the biological functions for 4 of them. We showed that DegP, a rhoptry protease is essential for the in vivo virulence of T. gondii. DegP controls the acute phase during infection and modulate the host immune response leading to better parasite dissemination in vivo. Also, we identified Claw1 and its paralog Claw2 that present an atypical localization at the apical end of the parasite. To date, we were unable to disrupt the genes encoding these proteins suggesting that they may have an essential function related to the apical complex in T. gondii. Finally, we also examined a ‘hit' of this screening that was not related to rhoptries and we identified SIP, the first protein associated with the transversal junctions of the inner membrane complex in T. gondii. The disruption of SIP affects the shape of the parasite leading to an aberrant motility, defect in invasion and impaired parasite virulence in mice.
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Neospora caninum: estudo do secretoma e caracterização molecular de três proteínas com domínios Apple / Neospora caninum: study of the secretome and molecular characterization of three proteins containing Apple domainsOliveira, Letícia Pollo de 08 November 2013 (has links)
Neospora caninum (filo Apicomplexa) é um parasita obrigatório intracelular como todos os membros deste filo, alguns reconhecidos por causarem doenças com impacto relevante na saúde humana (Plasmodium e Toxoplasma) e veterinária (Babesia, Eimeria e Cryptosporidium). Causador da neosporose, N. caninum vem emergindo como um dos maiores causadores de abortos infecciosos em bovinos, levando a consideráveis perdas econômicas na bovinocultura mundial. Devido à sua recente descoberta, o conhecimento sobre diversos processos bioquímicos de N.caninum ainda é limitado, demandando novas pesquisas para a compreensão de seus mecanismos de sobrevivência e consequente identificação de alvos para intervenção terapêutica. O processo de invasão celular é bastante investigado em pesquisas envolvendo apicomplexas, uma vez que a sobrevivência desses parasitas depende do sucesso de sua entrada na célula hospedeira. Proteínas secretadas de organelas filo-específicas (micronemas, roptrias e grânulos densos) estão intimamente envolvidas com a invasão celular. Elas são responsáveis pela interação inicial com a célula hospedeira, participam da junção de movimento formada no momento da invasão, e contribuem para a estabilização do vacúolo parasitóforo. Neste trabalho as proteínas secretadas por taquizoítas de N. caninum foram investigadas de duas formas: (1) por caracterização molecular de proteínas com domínio Apple; e (2) por estudo do secretoma do parasita. Os domínios proteicos do tipo Apple são caracterizados pela capacidade de interação proteína-proteína e proteína-carboidrato, e estão presentes em algumas proteínas micronêmicas com propriedades adesivas. Neste trabalho três proteínas de N. caninum contendo domínios Apple foram caracterizadas: MIC17A, MIC17B e MIC17C. A análise das sequências proteicas e das estruturas dos domínios Apple, obtidas por modelagem molecular, mostraram alta identidade sequencial e estrutural entre MIC17A e MIC17C. Apesar de ser paráloga às outras duas, MIC17B apresenta diferenças importantes em sua sequência e estrutura. Para MIC17B e MIC17C foram realizados experimentos de detecção das proteínas nativas nos extratos total e secretado do taquizoíta que sugerem diferentes formas de processamento entre essas proteínas no parasita. Para MIC17B foi confirmada a localização em micronemas, num padrão diferente do observado para MIC17C. Os ensaios de invasão combinados aos de localização indicam que estas proteínas estejam relacionadas ao processo de invasão celular, porém, suas funções permanecem desconhecidas. O secretoma é o conjunto de proteínas secretadas pelo parasita e, para explorar a composição deste extrato (ESA) no taquizoíta de N. caninum, duas abordagens complementares foram utilizadas. Na primeira abordagem foram identificadas as proteínas presentes no ESA por espectrometria de massas. Na segunda abordagem realizou-se uma ii quantificação relativa das proteínas, marcadas por dois isótopos, nos extratos totais de taquizoítas submetidos ou não ao estímulo secretório. O resultado esperado seria com as proteínas secretadas diminuídas no parasita estimulado. Em ambas as abordagens foram utilizadas técnicas de espectrometria de massas de alta resolução (nanoLC-MS/MS), o que resultou num alto número de identificações; 615 proteínas no ESA e 2011 proteínas quantificadas. A comparação das duas abordagens permitiu o reconhecimento de proteínas com maior probabilidade de secreção. Uma rede de interação entre as proteínas diferencialmente expressas foi predita, gerando resultados que, associados às informações sobre as proteínas aumentadas, permitiram uma investigação sobre proteínas potencialmente envolvidas com a regulação do metabolismo relacionado à secreção. Os resultados obtidos por ambos os estudos aqui demonstrados somam conhecimento acerca do parasita N. caninum e demonstram ser úteis para guiar a busca e seleção de alvos a serem investigados para o desenvolvimento de terapêutica contra a neosporose. / Neospora caninum (Apicomplexa phylum) is an obligatory intracellular parasite like all members from this phylum, some causing diseases with relevant impact on human (Plasmodium and Toxoplasma) and veterinary (Babesia, Eimeria and Cryptosporidium) health. Causative agent of neosporosis, N. caninum has emerged as one of the leading causes of infectious abortion in cattle, generating huge economical losses in worldwide livestock. Due to its recent discovery, knowledge of N. caninum biochemical processes remains scarce, demanding new research for comprehending its survival mechanisms and, consequently, identifying new targets for therapeutic intervention. The invasion process has often been investigated in apicomplexans since their survival depends on the success of their entry into the host cell. Proteins secreted from phylum-specific organelles (micronemes, rhoptries and dense granules) are deeply involved with invasion. They are responsible for the initial interaction with the host cell; participate of the moving junction formed in the moment of invasion; and contribute for the stabilization of the parasitophorus vacuole. In this study, the proteins secreted by N. caninum tachyzoites were investigated in two ways: (1) the molecular characterization of Apple domaincontaining proteins; and (2) exploring the parasite secretome. The Apple protein domains are characterized by the ability to interact as protein-protein and proteincarbohydrate, and are present in some microneme proteins with adhesive properties. Here three N. caninum proteins containing Apple domains were characterized: MIC17A, MIC17B and MIC17C. Analyses of the Apple domains sequences and structures, obtained by molecular modeling, revealed high sequential and structural identities between MIC17A and MIC17C. Although being a paralog of the other two proteins, MIC17B presents significant differences in its sequence and structure. Experiments were performed for native MIC17B and MIC17C detection in the total and secreted tachyzoite extracts, suggesting different processing forms for these proteins in the parasite. For MIC17B, the microneme localization was confirmed, differently from the pattern observed for MIC17C. Invasion and localization assays indicated that these proteins are related to the cell invasion process; nevertheless, their functions remain unknown. The secretome is the set of proteins secreted by the parasite and, to explore this extract (ESA) composition in N. caninum, two complementary approaches were used. Firstly proteins present in ESA were identified by mass spectrometry. In the second approach, a relative quantification was performed on the proteomes of ethanol stimulated/non stimulated tachyzoites, expecting that the secreted proteins would be down regulated at the stimulated parasite. Both approaches were performed with high resolution mass spectrometry techniques (nanoLC-MS/MS), reaching a high number of identifications: 615 proteins iv in ESA and 2011 quantified proteins. The comparison between both approaches allowed the recognition of the most likely secreted proteins. An interaction network was predicted, involving the differentially expressed proteins. These results, associated with the information of up regulated proteins, allowed the investigation of proteins potentially involved with the secretion metabolism regulation. The findings from our two studies add up knowledge about N. caninum and demonstrate to be useful in guiding the search and selection for new targets for therapeutic development against neosporosis.
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Neospora caninum: estudo do secretoma e caracterização molecular de três proteínas com domínios Apple / Neospora caninum: study of the secretome and molecular characterization of three proteins containing Apple domainsLetícia Pollo de Oliveira 08 November 2013 (has links)
Neospora caninum (filo Apicomplexa) é um parasita obrigatório intracelular como todos os membros deste filo, alguns reconhecidos por causarem doenças com impacto relevante na saúde humana (Plasmodium e Toxoplasma) e veterinária (Babesia, Eimeria e Cryptosporidium). Causador da neosporose, N. caninum vem emergindo como um dos maiores causadores de abortos infecciosos em bovinos, levando a consideráveis perdas econômicas na bovinocultura mundial. Devido à sua recente descoberta, o conhecimento sobre diversos processos bioquímicos de N.caninum ainda é limitado, demandando novas pesquisas para a compreensão de seus mecanismos de sobrevivência e consequente identificação de alvos para intervenção terapêutica. O processo de invasão celular é bastante investigado em pesquisas envolvendo apicomplexas, uma vez que a sobrevivência desses parasitas depende do sucesso de sua entrada na célula hospedeira. Proteínas secretadas de organelas filo-específicas (micronemas, roptrias e grânulos densos) estão intimamente envolvidas com a invasão celular. Elas são responsáveis pela interação inicial com a célula hospedeira, participam da junção de movimento formada no momento da invasão, e contribuem para a estabilização do vacúolo parasitóforo. Neste trabalho as proteínas secretadas por taquizoítas de N. caninum foram investigadas de duas formas: (1) por caracterização molecular de proteínas com domínio Apple; e (2) por estudo do secretoma do parasita. Os domínios proteicos do tipo Apple são caracterizados pela capacidade de interação proteína-proteína e proteína-carboidrato, e estão presentes em algumas proteínas micronêmicas com propriedades adesivas. Neste trabalho três proteínas de N. caninum contendo domínios Apple foram caracterizadas: MIC17A, MIC17B e MIC17C. A análise das sequências proteicas e das estruturas dos domínios Apple, obtidas por modelagem molecular, mostraram alta identidade sequencial e estrutural entre MIC17A e MIC17C. Apesar de ser paráloga às outras duas, MIC17B apresenta diferenças importantes em sua sequência e estrutura. Para MIC17B e MIC17C foram realizados experimentos de detecção das proteínas nativas nos extratos total e secretado do taquizoíta que sugerem diferentes formas de processamento entre essas proteínas no parasita. Para MIC17B foi confirmada a localização em micronemas, num padrão diferente do observado para MIC17C. Os ensaios de invasão combinados aos de localização indicam que estas proteínas estejam relacionadas ao processo de invasão celular, porém, suas funções permanecem desconhecidas. O secretoma é o conjunto de proteínas secretadas pelo parasita e, para explorar a composição deste extrato (ESA) no taquizoíta de N. caninum, duas abordagens complementares foram utilizadas. Na primeira abordagem foram identificadas as proteínas presentes no ESA por espectrometria de massas. Na segunda abordagem realizou-se uma ii quantificação relativa das proteínas, marcadas por dois isótopos, nos extratos totais de taquizoítas submetidos ou não ao estímulo secretório. O resultado esperado seria com as proteínas secretadas diminuídas no parasita estimulado. Em ambas as abordagens foram utilizadas técnicas de espectrometria de massas de alta resolução (nanoLC-MS/MS), o que resultou num alto número de identificações; 615 proteínas no ESA e 2011 proteínas quantificadas. A comparação das duas abordagens permitiu o reconhecimento de proteínas com maior probabilidade de secreção. Uma rede de interação entre as proteínas diferencialmente expressas foi predita, gerando resultados que, associados às informações sobre as proteínas aumentadas, permitiram uma investigação sobre proteínas potencialmente envolvidas com a regulação do metabolismo relacionado à secreção. Os resultados obtidos por ambos os estudos aqui demonstrados somam conhecimento acerca do parasita N. caninum e demonstram ser úteis para guiar a busca e seleção de alvos a serem investigados para o desenvolvimento de terapêutica contra a neosporose. / Neospora caninum (Apicomplexa phylum) is an obligatory intracellular parasite like all members from this phylum, some causing diseases with relevant impact on human (Plasmodium and Toxoplasma) and veterinary (Babesia, Eimeria and Cryptosporidium) health. Causative agent of neosporosis, N. caninum has emerged as one of the leading causes of infectious abortion in cattle, generating huge economical losses in worldwide livestock. Due to its recent discovery, knowledge of N. caninum biochemical processes remains scarce, demanding new research for comprehending its survival mechanisms and, consequently, identifying new targets for therapeutic intervention. The invasion process has often been investigated in apicomplexans since their survival depends on the success of their entry into the host cell. Proteins secreted from phylum-specific organelles (micronemes, rhoptries and dense granules) are deeply involved with invasion. They are responsible for the initial interaction with the host cell; participate of the moving junction formed in the moment of invasion; and contribute for the stabilization of the parasitophorus vacuole. In this study, the proteins secreted by N. caninum tachyzoites were investigated in two ways: (1) the molecular characterization of Apple domaincontaining proteins; and (2) exploring the parasite secretome. The Apple protein domains are characterized by the ability to interact as protein-protein and proteincarbohydrate, and are present in some microneme proteins with adhesive properties. Here three N. caninum proteins containing Apple domains were characterized: MIC17A, MIC17B and MIC17C. Analyses of the Apple domains sequences and structures, obtained by molecular modeling, revealed high sequential and structural identities between MIC17A and MIC17C. Although being a paralog of the other two proteins, MIC17B presents significant differences in its sequence and structure. Experiments were performed for native MIC17B and MIC17C detection in the total and secreted tachyzoite extracts, suggesting different processing forms for these proteins in the parasite. For MIC17B, the microneme localization was confirmed, differently from the pattern observed for MIC17C. Invasion and localization assays indicated that these proteins are related to the cell invasion process; nevertheless, their functions remain unknown. The secretome is the set of proteins secreted by the parasite and, to explore this extract (ESA) composition in N. caninum, two complementary approaches were used. Firstly proteins present in ESA were identified by mass spectrometry. In the second approach, a relative quantification was performed on the proteomes of ethanol stimulated/non stimulated tachyzoites, expecting that the secreted proteins would be down regulated at the stimulated parasite. Both approaches were performed with high resolution mass spectrometry techniques (nanoLC-MS/MS), reaching a high number of identifications: 615 proteins iv in ESA and 2011 quantified proteins. The comparison between both approaches allowed the recognition of the most likely secreted proteins. An interaction network was predicted, involving the differentially expressed proteins. These results, associated with the information of up regulated proteins, allowed the investigation of proteins potentially involved with the secretion metabolism regulation. The findings from our two studies add up knowledge about N. caninum and demonstrate to be useful in guiding the search and selection for new targets for therapeutic development against neosporosis.
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