L’expression génique est un processus qui se fait en trois étapes: la transcription, la maturation des ARNm et la traduction. Il est bien établi que le ribosome est la machinerie macromoléculaire responsable de la traduction. Cependant, nous en connaissons très peu sur la régulation des protéines ribosomales constituant cette machinerie. Une dérégulation de l’expression des protéines ribosomales peut entraîner différentes maladies telles que les anémies, les ribosomopathies, ainsi que des cancers. Il est donc important d’avoir une régulation contrôlée de l’expression des protéines ribosomales maintenant l’homéostasie. Chez la levure, plusieurs études suggèrent que les protéines ribosomales sont impliquées dans la régulation de leurs paralogues. Dans le laboratoire, des travaux ont montré la régulation négative de rpl30-2 par son paralogue Rpl30-1. Mes travaux sur la levure Schizosaccharomyces pombe ont permis de clarifier le mécanisme par lequel Rpl30-1 régule rpl30-2. Sachant que cette régulation est intron dépendant, nous avons vérifié si Rpl30-1 peut lier directement l’intron de rpl30-2 par retardement sur gel. Il faut aussi déterminer la région de l’intron permettant cette liaison. Différentes constructions devaient être générées afin de cibler la région nécessaire à la liaison. Certains problèmes sont survenus et ont persisté nous obligeant à mettre ce projet de côté. Nos travaux ont permis de proposer un nouveau modèle d’autorégulation de la protéine ribosomale S2 (rpS2) chez l’homme. Une lignée stable a été créée permettant de contrôler l’expression du gène de fusion GFV-RPS2 par l’ajout de doxycycline au milieu de culture. Une réduction de la protéine endogène rpS2 est notable lorsque l’expression de GFP-rpS2 est induite. Étonnamment, en excès de rpS2, les niveaux endogènes d’ARNm de RPS2 ne varient pas suggérant une régulation post-transcriptionnelle. De plus, nos résultats suggèrent une régulation indépendante des régions non traduites en 5’ et 3’. Nous avons vérifié la possibilité d’un mécanisme impliquant la stabilité de la protéine. Nos résultats semblent indiquer que la stabilité de rpS2 ne serait pas impliquée. D’autres expériences montrent que GFP-rpS2 semble lier l’ARNm de RPS2. Ce nouveau résultat permet de proposer un nouveau modèle dans lequel rpS2 pourrait lier son transcrit pour venir réprimer la traduction.

L'expression des ARN mitochondriaux et chloroplastiques des plantes implique un grand nombre de modifications post-transcriptionnelles, parmi lesquelles l'épissage des introns est un processus essentiel. Sur la base de leur structure et des mécanismes d'épissage associés, les introns peuvent être classés en deux familles et ceux présents dans les organites des plantes appartiennent au groupe II. Les introns mitochondriaux et chloroplastiques de groupe II sont fortement dégénérés et ont perdu la capacité de s'auto-épisser in vivo. Leur élimination nécessite l’action de nombreux facteurs protéiques codés dans le noyau et importés dans les organites. Les protéines de liaison à l'ARN jouent un rôle prédominant dans ce processus complexe. Les protéines ribosomales sont des protéines abondantes se liant à l'ARN et peuvent être recrutées pour remplir diverses fonctions annexes. Au cours de ma thèse, j’ai étudié la fonction des protéines de type uL18 chez Arabidopsis, qui comprend 8 membres. Ces protéines partagent un domaine uL18 plutôt dégénéré, mais dont la structure est conservée, et dont la fonction initiale est de permettre l’association avec l’ARNr 5S. Nos résultats ont montré que cinq protéines de type uL18 sont adressées aux mitochondries et trois aux chloroplastes. Deux d’entre elles correspondent à de véritables protéines ribosomales uL18 associées aux ribosomes des organites, tandis que deux autres (uL18-L1 et uL18-L8) se sont transformées en facteurs d'épissage et sont nécessaires à l'élimination d’introns mitochondriaux ou chloroplastiques spécifiques. L'analyse d'un troisième membre de la famille, uL18-L5, a révélé qu'il participait à l'épissage de nombreux introns mitochondriaux. Mes résultats ont permis de révéler que les facteurs dérivés des protéines ribosomales uL18 jouent un rôle essentiel dans l’épissage des introns du groupe II mitochondriaux ou chloroplastiques chez les végétaux et que ces fonctions ciblent sot un seul intron ou bien plusieurs d’entre eux. / RNA expression in plant organelles implies a large number of post-transcriptional modifications in which intron splicing is an essential process. Based on RNA structures and splicing mechanisms, introns can be classified into two families and organellar introns of seed plants are categorized as group II. Organellar group II introns are highly degenerate and have lost the ability to self-splice in vivo. Their removal from transcripts is thus facilitated by numerous nuclear-encoded proteins that are post-translationaly imported into organelles. Among them, RNA binding proteins play predominant roles in this complex process. Ribosomal proteins are abundant RNA-binding proteins and could be recruited to carry out multifarious auxiliary functions. During my thesis, I investigated the function of the uL18 ribosomal-like protein family in Arabidopsis that comprises 8 members. The members of this protein family share a rather degenerate but structurally conserved uL18 domain whose original function is to permit association with the 5S rRNA. Our results showed that five uL18-Like proteins are targeted to mitochondria and three to chloroplasts. Two of these proteins correspond to real ribosomal uL18 proteins that incorporate into organellar ribosomes, while two other members (uL18-L1 and uL18-L8) have turned into splicing factors and are required for the removal of specific mitochondrial or plastid group II introns. The analysis of a third member, uL18-L5, revealed that it participated in the splicing of numerous mitochondrial introns. Our results revealed that uL18-like factors play essential roles in group II intron splicing in both mitochondria and plastids of plants and that these functions could target a single or multiple introns.

Les cellules souches ont attiré l’attention du public ces dernières années, grâce non-seulement à leur utilisation comme thérapies visant à s’attaquer à certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la médecine regénérative. Il est établi que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est régulé de façon intensive par un groupe de facteur clés agissant sur leur pluripotence. Il est néanmoins envisageable que certains déterminants influençant l’auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré, en utilisant une méthode par infections virales, une collection de ESC contenant des délétions chromosomales chevauchantes que nous avons baptisée DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indépendants dont les régions délétées couvrent environ 25% du génome murin. À l’aide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryoïdes (EB), démontrant que plusieurs clones délétés avaient un phénotype de différenciation anormal. Nos études de complémentation sur un groupe de clones ont par la suite permis l’identification de Rps14 - un gène codant pour une protéine ribosomale (RP) comme étant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxième temps, l’analyse approfondie des résultats de notre crible a permis d’identifier un groupe de gènes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la différenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manière intéressante, les phénotypes anormaux de formation en EB les plus marqués sont associés à des délétions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. Étonnament, alors qu’un débalancement des RP conduit généralement à une réponse de type p53, l’haploinsuffisance de ces trois gènes ne peut être renversée par une simple réduction des niveaux d’expression de ce gène suppresseur de tumeurs. Finalement, nos études de profilage polysomal et de séquençage à haut-débit montrent une signature spécifique de gènes liés au mésoderme chez un clone hétérozygote pour Rps5, suggérant ainsi une explication au phénotype de différenciation p53-indépendant identifié chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la création d’une ressource intéressante de génomique fonctionnelle qui a permis de mettre à jour le rôle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos résultats permettent aussi de documenter une réponse p53-indépendante suite à un débalancement de RP dans un contexte opposant l’auto-renouvellement et la différenciation des ESC. / Stem cells have captured public’s attention in the last years, thanks to their involvement in cancer therapies and also their huge theoretical potential in the regenerative medicine field. In order to translate this new technology to the clinic, a better understanding of their regulatory mechanisms is still needed. It is well established that mouse embryonic stem cell (ESC) fate is highly regulated by core pluripotency factors. However, it is conceivable that novel self-renewal or differentiation regulators are not yet described. To investigate this possibility, we used a viral-based approach to generate a collection of ESC with nested chromosomal deletions called DelES (Deletion in ES cells). This library contains more than a thousand independent ESC clones highly enriched in chromosomal deletions which together cover ~25% of the mouse genome. Using this resource, we conducted an embryoid body (EB) differentiation screen and showed that several clones were having an abnormal EB formation phenotype. Complementation studies later identified Rps14-a ribosomal protein (RP) coding gene- as a novel haploinsufficient gene in EB formation from undifferentiated ESC. Further analyses of our screen results showed a strong bias for a subset of small subunit ribosomal protein genes which are critical for ESC differentiation but not for their self-renewal activity. Interestingly, the most severe differentiation phenotypes were found with ribosomal proteins associated to the ribosome’s mRNA exit site, namely Rps5, Rps14 and Rps28. While RP gene imbalance often leads to a p53 response that can be corrected by p53 suppression, ESC clones with decreased expression of mRNA exit site RP genes were surprisingly insensitive to p53 reduction, but were rescued by BAC or cDNA complementation, thus confirming the causative nature of these genes in the ESC phenotype. Finally, polysomal profiling and RNA-Seq studies showed that Rps5 deleted ESC exhibit an abnormal mesodermal gene signature. Together, our work presents a highly valuable resource for functional genomic studies in ESC and also highlights a novel p53-independent role linked to RP gene imbalance. Our results shed light on the relevance of these subunits for the developmental transition of ESC from a pluripotent to a differentiated state.

Microviridine sind ribosomal synthetisierte, cyanobakterielle Depsipeptide. Die genetische Basis der Microviridinproduktion ist ein Gencluster mit den Genen mdnABCDE. Zwei neuartige ATP-grasp-Ligasen, MdnB und MdnC, katalysieren die Bildung von Lacton- und Lactamringen durch die Einführung von zwei -Ester-und einer -Amidbindung. Die Prozessierung wird von einer bislang unbekannten Peptidase durchgeführt. Neben den filamentösen Nostoc und Planktothrix gehört die einzellige, blütenbildende Cyanobakteriengattung Microcystis zu den Microviridinproduzenten. Die inhibitorische Aktivität gegenüber Serinproteasen verleiht Microviridinen ökologische und pharmazeutische Relevanz. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine kleine Microviridin Expressionsplattform konstruiert. Ein neuartiges Microviridin Gencluster aus Microcystis aeruginosa Nies843 wurde heterolog in E. coli exprimiert, bioinformatisch analysiert und mutiert. Das hochkonservierte PFFARFL-Motif im Precursorpeptid MdnA wurde als Erkennungssequenz für die ATP-grasp Ligasen identifiziert. Manipulationen am C-Terminus des leader-Peptids führten zu einer Inhibierung der Aktivität von MdnB. Peptid-Protein-Interaktionen zwischen MdnA und den ATP-grasp Ligasen wurden untersucht. Der ABC-Transporter MdnE stabilisiert höchstwahrscheinlich einen Microviridin Biosynthesekomplex an der inneren Membran, wofür zwei mögliche Modelle vorgeschlagen werden. Punktmutationen in der Microviridin core-Sequenz offenbarten Flexibilität des Microviridin-Biosyntheseapparates für das peptide engineering. Es wurde eine Mutante konstruiert, deren inhibitorische Aktivität gegen Elastase um den Faktor 100 verbessert wurde. Durch die Konstruktion einer Precursoraustauschplattform konnten bisher kryptische Microviridine produziert werden. Diese Methode hat Potential für den Bau von Microviridinbibliotheken. Letztlich wird eine Hypothese zum Bindungsmechanismus von Microviridinen an Proteasen aufgestellt. / Microviridins are ribosomally synthesized cyanobacterial oligopeptides. These peptides comprise an unrivaled multicyclic cage-like structure, carrying two characteristic  ester and one amide bond, which are introduced by the two novel ATP-grasp ligases MdnB and MdnC. In addition to the filamentous species Nostoc and Planktothrix, the unicellular, bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa Nies843 is one of the microviridin producer strains. The potent serine protease inhibitory activity contributes to both ecological and pharmacological relevance of microviridins. During this work, a small expression platform carrying the microviridin gene cassette mdnABCDE was established. Microviridins were heterologously expressed in E. coli and analyzed using bioinformatics and mutational analysis. The strictly conserved PFFARFL motif in the precursor peptide MdnA was identified and characterized as a binding sequence for the ATP-grasp ligases. Protein interactions of MdnA with B and C were studied. The ABC transporter MdnE was unveiled to be crucial for cyclization and processing of microviridins, probably stabilizing a putative microviridin maturation complex at the inner membrane. Two initial models for the peptide recognition and processing have been proposed. Point mutations in the microviridin core sequence showed some flexibility of the microviridin biosynthetic pathway to be used for peptide engineering. The exchange of a phenylalanine against a leucine in position 5 of the core region resulted in more than a 100-fold increased inhibitory activity against the attractive drug target elastase. The possibility to express cryptic microviridin precursor peptides in a precursor exchange platform showed the potential to create peptide libraries. Finally, a hypothesis about the binding mechanism of microviridins is presented.

Les objectifs de cette thèse étaient d'apporter une percée conceptuelle pour une compréhension en profondeur des mécanismes moléculaires des protéines intrinsèquement désordonnées (IDPs) et de leurs rôles dans la physiologie cellulaire de Chlamydomonas reinhardtii. La combinaison d’approches expérimentale et bioinformatique m’a permis d’identifier 682 protéines thermorésistantes chez C. reinhardtii. Parmi celles-ci, 299 protéines sont systématiquement prédites comme potentielles IDP par quatre algorithmes de prédiction de désordre. Nos résultats indiquent que le pourcentage désordonné moyen de ces protéines prédites comme étant des IDPs est d'environ 20%, et la plupart d'entre elles (~70%) sont adressées à d'autres compartiments que la mitochondrie et le chloroplaste. Leur composition en acides aminés est biaisée par rapport à d'autres IDPs de la base de données de protéines désordonnées (DisProt). Ces IDPs potentielles jouent des fonctions moléculaires diverses, et 54% d'entre elles sont des cibles de phosphorylation.Notre travail a également augmenté l’état des connaissances sur l'adénylate kinase 3 (ADK3), une enzyme contenant une région intrinsèquement désordonnée (IDR). Cette enzyme a été isolée par notre approche globale pour caractériser les IDPs de l’algue verte. L’extension C-terminale désordonnée (CTE) de cette enzyme lui confère de nouvelles fonctions comme par exemple, la formation d’un complexe bi-enzymatique avec la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), la régulation (négative) de l'activité GAPDH avec le NADPH comme cofacteur, et le rôle de chaperon pour la GAPDH en la protégeant de la dénaturation par traitement thermique et de l’agrégation. / The objectives of this work were to bring a conceptual breakthrough for an in-depth understanding of the molecular mechanisms of intrinsically disordered proteins (IDPs) and their roles in the cellular physiology of Chlamydomonas reinhardtii. Using experimental approaches, 682 heat-resistant proteins were identified as putative IDPs. Among them, 299 proteins were consistently predicted as IDPs by all four disordered predictors. The mean percentage of disordered residues content of these IDPs is about 20%, and most of them (~70%) are addressed to other compartments than mitochondrion and chloroplast. These newly identified IDPs from C. reinhardtii have a biased amino acid composition as regard to other IDPs from the Database of protein disorder (DisProt). Furthermore, they play diverse molecular functions, and 54% of them are the targets for phosphorylation. Our work also revealed more knowledge of the IDR-containing protein adenylate kinase 3 (ADK3) that was extracted by heat-treatment. Its disordered C-terminal extension (CTE) brought new functions to this protein. For instance, via its CTE, ADK3 can form a bi-enzyme complex with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), down-regulates the NADPH-dependent GAPDH activity, and behaves as a chaperone for GAPDH against its aggregation and inactivation under heat-treatment.